Microbiologia Médica - Método de Gram, Coagulase e Amostra de Staphylococcus

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO - UFES
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
MEDICINA
LUCAS BRUMATTI SETUBAL
VICTÓRIA PAGANI SAMORA SOUSA
RELATÓRIO DAS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA:
Métodos de cultivo e carreadores cocos Gram+ (17 abril)
Leitura carreadores e Gram dos isolados + Coagulase (4 de maio)
Interpretação de TSA de amostras Staphylococcus (11 de maio)
VITÓRIA
2022
Introdução
Este relatório consiste em elucidar as técnicas desenvolvidas nas três primeiras
aulas prática do curso de Microbiologia Médica, que tiveram como objetivo principal
demonstrar a importância de realizar o correto manejo de uma queixa clínica
envolvendo possíveis microrganismos, assim como adequada coleta de dados e de
amostras para análise laboratorial, a fim de se ter um diagnóstico preciso.
Nesse contexto, deve-se seguir os cinco “Is”: inocular, isolar, incubar, inspecionar e
identificar a espécie do patógeno em questão. Para tanto, faz-se necessário realizar
a coleta precisa do espécime a ser analisado, em quantidade ideal e transporte
adequado, para a preservação da qualidade da amostra para análise, de modo a ter
um resultado acurado.
No cenário em questão, levantou-se a hipótese de se ter bactérias GRAM-positivas
Staphylococcus aureus em fossas nasais, por isso realizou-se um SWAB nasal em
um dos integrantes da dupla (Lucas Brumatti Setubal) para análise laboratorial.
Após a coleta, inoculou-se a amostra em dois meios de cultura diferentes, o primeiro
foi o Ágar sangue (meio de cultura nutritivo) e o segundo foi o Ágar manitol salgado
(seletivo para Staphylococcus aureus).
A semeadura no Ágar sangue foi feita pela técnica de esgotamento visando isolar
culturas puras em amostras com culturas mistas, formando colônias isoladas e
possibilitando a identificação dos microrganismos que cresceram nesse meio por
meio de métodos de coloração posteriores. Já a semeadura no ágar manitol
salgado, é utilizada para caracterizar principalmente o Staphylococcus aureus, uma
vez que esse meio é seletivo. O S. aureus não apenas cresce nesse meio, mas
também converte a cor do meio originalmente rosa em amarelo, em razão da sua
capacidade de fermentar o manitol.
Para identificar os tipos de colônias cultivadas no Ágar sangue foi realizada o
método de coloração GRAM, no qual primeiramente possibilitou a distinção entre
GRAM-positivas e GRAM-negativas e em segundo momento entre Streptococcus
spp e Staphylococcus spp, através da observação no microscópio com aumento de
1.000x.
Além disso, foi realizado o teste de coagulase na colônia isolada no Ágar sangue
como um complemento para detecção de S. aureus, uma vez que, nesse meio, ele
é capaz de transformar fibrinogênio em fibrina.
Por fim, foi-se avaliada a sensibilidade dessas bactérias aos antimicrobianos
Tetraciclina, Sulfametoxazol/Trimetropim, Cefoxitina, Clindamicina e Eritromicina por
meio do teste por disco de difusão de antimicrobianos.
Objetivos
Avaliar o status de portador de Staphylococcus spp. e/ou Streptococcus spp. em
fossas nasais.
Objetivos específicos
Coletar amostras de bactérias via swab nasal; semear e isolar os espécimes
coletados; inspecionar e identificar de forma mac km roscópica e microscópica os
Staphylococcus e Streptococcus; realizar o teste de Manitase; avaliar a
sensibilidade e/ou resistência dessas bactérias aos antimicrobianos Tetraciclina,
Sulfametoxazol/Trimetropim, Cefoxitina, Clindamicina e Eritromicina.
Materiais e Métodos
● Ágar sangue (meio seletivo e indicador)
● 1 Swab estéril
● 1 Placa de Ágar Sangue – AS (90x15mm)
● 1 Tubo com Ágar Manitol Hipertônico – MAN
● Frasco com lâmina de vidro para testagem do método de Gram
● Corante cristal violeta
● Solução de Iodo
● Safranina
● Jorradeira (picete) com água destilada
● Lápis dermatográfico
● Alça de inoculação estéril
● Bateria de Gram com suporte para lâminas
● Cepa padrão: placa com Ágar Nutriente – AN (70x15mm) semeada com S.
aureus
● Solução salina estéril
Para a coleta do swab nasal, umedeceu-se o swab em solução salina estéril e
introduziu-se na fossa nasal, de ambos os lados, até o septo nasal e depois
realizou-se movimentos giratórios circulares por dez segundos. Após isso, fez-se a
semeadura, por meio do método de esgotamento, inoculando o material coletado
em uma extremidade da placa de Ágar sangue, em movimentos giratórios, para a
formação de colônias isoladas. Com a alça de inoculação estéril, realizou-se
movimentos em zigue-zague, com o giro da placa em 90° após o esgotamento. A
segunda técnica foi a de inoculação do espécime em ágar manitol hipertônico, pela
seletividade desse meio para Staphylococcus. Por fim, os meios de cultura foram
armazenados por 24h a 35ºC para facilitar o crescimento dos microrganismos.
Depois disso, confeccionou-se o esfregaço na lâmina identificando com o lápis
dermatográfico. O próximo passo foi realizar a coloração para o método de GRAM,
seguindo a ordem dos corantes: Corante cristal violeta por 60 segundos; lavar com
esguicho de água destilada; cobrir com lugol por 60 segundos; lavar com água
destilada; descorar com álcool a 95% ou acetona por 10 segundos; corar com
safranina por 60 segundos; lavar com água destilada; secar e observar a lâmina ao
microscópio óptico. A coloração azul indica que as bactérias são GRAM-positivas e
a rosa indica que são GRAM-negativas.
Com a adição do Lugol, ocorre a formação do complexo iodo-pararosanilina, que
fixa o corante primário nas estruturas coradas. O álcool-acetona extrai a fina
camada de peptidoglicanos das bactérias Gram-negativas, aumentando a
porosidade/permeabilidade da parede celular. Por isso, o complexo cristal
violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas.
Já a parede celular das bactérias gram-positivas, em virtude de sua composição,
torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-acetona, sem romper-se e a
porosidade diminui, reduzindo a permeabilidade, por isso o complexo CVI não pode
ser extraído.
Outro teste realizado foi o de sensibilidade e/ou resistência aos antimicrobianos
Tetraciclina, Sulfametoxazol/trimetoprim, cefoxitina, clindamicina e eritromicina. O
método utilizado para avaliar o resultado do teste de difusão em disco é a medição
do diâmetro da zona de inibição.
Resultados
● Teste de Manitase positivo (meio ficou amarelo): indicativo de bactéria capaz
de oxidar manitol, como por exemplo o S. aureus;
● Semeadura no Ágar sangue feita pela técnica de esgotamento e pela
configuração das colônias percebe-se que que o cultivo foi feito de forma
adequada. Nessa placa, pode-se visualizar colônias de 1-4mm, de cor
amarelo ouro e acompanhadas por hemólise total e parcial, indicando a
presença de bactérias do gênero “Staphylococcus”. Mas também foi possível
observar colônias de 0,5-1mm, esbranquiçadas, sem presença de hemólise,
indicando também a presença de Streptococcus spp.
● Teste de coloração GRAM-positivo: para esse teste foi utilizada uma colônia
de 3mm amarela ouro hemolítica do Ágar sangue que foi preparada em
solução salina, fixada e corada com cristal violeta mesmo após a lavagem.
Indicando, dessa forma, bactérias ricas em paredes de peptideoglicanos, as
quais retém o cristal violeta mesmo após a lavagem com acetona.
● Ao microscópio: colônias de bactérias GRAM-positivas em forma de cachos :
Staphylococcus spp;
● Teste de coagulase negativo: indica ausência de S. aureus;
● Diâmetro do halo de Tetraciclina: 35mm, sendo que > 22mm indica
sensibilidade do S. aureus;
● Diâmetro do halo de Sulfametoxazol/Trimetropim: 28mm, sendo que >17mm
indica sensibilidade do S. aureus;
● Diâmetro do halo de Cefoxitina: 37mm, sendo que > 17mm indica
sensibilidade para S. aureus e > 25mm indica sensibilidade para S.
epidermidis
● Diâmetro do halo de Clindamicina: 35mm, sendo que > 22mm indica
sensibilidade para S. aureus.
● Diâmetro do halo de Eritromicina: 18mm, sendo que > 21mm indica
sensibilidade, entre 18mm-20mm compreende afaixa intermediária e <
18mm indica resistência para S. aureus.
Discussão
O teste de GRAM com resultado positivo indica que se trata de Staphylococcus
spp., justamente pelo arranjo das colônias em formato de cacho de uva, em vez de
cadeias retas, como seria o caso de Streptococcus spp. Outro ponto relevante é que
as bactérias dessa colônia não são resistentes aos antimicrobianos testados, o que
indica que o portador é negativo para MRSA (Staphylococcus Aureus Resistente à
Meticilina). A importância dessa testagem diz respeito ao fato de que infecções
provocadas por MRSA, resistentes à penicilina, à meticilina e a outros
antimicrobianos, necessitam de cuidados específicos e isolamento, principalmente
se for um paciente hospitalar, além de rígidos cuidados de higiene por parte dos
profissionais de saúde que estiverem acompanhando o portador de MRSA, de modo
a evitar sua disseminação.
Conclusão
O teste de Manitase positivo pode indicar se tratar de uma cultura de bactérias
capazes de oxidar o manitol presente no meio, como o Staphylococcus aureus, mas
esse teste não é específico apenas para essa espécie de bactéria. A coloração pelo
método de GRAM indica ser uma colônia de Staphylococcus spp. GRAM-positivos.
E, por fim, o teste de coagulase negativo indica que a colônia isolada não era de
Staphylococcus aureus. Portanto, somando os resultados apresentados, levando
em consideração que todos os procedimentos foram realizados adequadamente e
que houve controle da eficácia dos testes, conclui-se que não foi identificada a
presença de Staphylococcus aureus nas fossas nasais do indivíduo examinado.