Microbiologia - Esfregaço e técnicas de coloração

Prévia do material em texto

CENTRO UNIVERSITÁRIO DO NORTE 
ESCOLA DE SAÚDE 
CURSO DE BIOMEDICINA 
 
Preparo e fixação do esfregaço 
Se os microorganismos estiverem sendo cultivados em meio líquido e 
apresentarem boa taxa de crescimento, retira-se do tubo de cultura com o auxílio de uma 
alça de platina 1 a 3 gotas de meio, colocando sobre uma lâmina de vidro. 
Se os microrganismos estiverem em meio sólido, coloca-se previamente 1 a 2 
gotas de solução salina estéril sobre a lâmina, recolhendo com a alça de platina uma 
pequena porção da colônia diluindo na gota de salina com movimentos circulares. Para 
fixação das células sobre a lâmina é necessário aquecê-la, fazendo então fixação do 
esfregaço pelo calor, passando-se a lâmina contendo o esfregaço seco ao ar 3 vezes sobre 
a chama do bico de Bunsen. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Técnicas de coloração 
 
“Loeffler” – Azul de Metileno 
 O azul de metileno é um corante catiônico empregado para coloração simples das 
células, com o objetivo de evidenciar a morfologia bacteriana. A presença de moléculas 
carregadas negativamente na célula causa o fenômeno da coloração, pois o corante 
carregado positivamente é atraído por partículas carregadas negativamente, como DNA e 
RNA. 
 Procedimento: Prepara-se e fixa-se a lâmina previamente, em seguida, adiciona-
se o corante azul de metileno. Deixando-o agir por 2 minutos, lava-se com água 
corrente. 
 Resultado: Visualização de estruturas não específicas coradas em azul. 
 
Gram 
Foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista Hans Christian Gram, e é a 
coloração diferencial mais utilizada em bacteriologia. Esta separa as bactérias em dois 
grandes grupos: as Gram-positivas e as Gram-negativas. O princípio da técnica baseia-se 
na diferença de composição da parede de diferentes bactérias e na capacidade destas 
paredes em reterem os corantes utilizados. 
 Procedimento: Adiciona-se o corante cristal violeta sobre esfregaço previamente 
preparado e fixado, deixando agir por 1 minuto. Após lavagem, adiciona-se o 
lugol deixando agir por mais 1 minuto. Em seguida, adiciona-se a solução 
descorante (álcool-cetona) por cerca de 30 segundos, seguido de fucsina por 1 
minuto. 
 Resultados: Células Gram-positivas retém o corante cristal-violeta e apresentam 
coloração roxa. Células Gram-negativas são descoradas e posteriormente coradas 
pela fucsina apresentando coloração rosa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ziehl-Neelsen 
 Coloração de escolha para a identificação de bactérias do gênero Mycobacterium, 
bem como para identificação de cepas patogênicas de bactérias do gênero Nocardia. A 
parede de micobactérias possui uma espessa camada de lipídeos (ácido micólico) que 
evita a penetração de diversos corantes. Por outro lado, quando o corante penetra 
alcançando o citoplasma da célula, não pode ser removido com facilidade mesmo com 
uso de agentes descolorantes (mistura álcool-ácido). A célula permanece corada após a 
mistura álcool-ácido ter sido aplicada e é denominada álcool-ácido resistente, enquanto 
aquelas que descoram são denominadas álcool-ácido sensíveis. 
 Procedimento: Coloca-se um pequeno pedaço de papel toalha sobre a lâmina e 
adiciona-se fucsina deixando agir por 5 minutos sobre a chama do bico de Bunsen, 
tomando cuidado para o papel não secar. Em seguida, utiliza-se a solução 
descorante (álcool-ácido) por 1 minuto. Após lavagem, adiciona-se o 
contracorante (azul de metileno) por 2 minutos. 
 Resultados: Células álcool-ácido resistentes retém o corante fucsina e apresentam 
coloração rosa. Células álcool-ácido sensíveis são lavadas pela solução descorante 
e apresentam a coloração azul do contracorante.