5 - Apostila MICROBIOLOGIA

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CURSO PREPARATÓRIO PARA CONCURSOS ANÁLISES CLÍNICAS
microbiologia
Prof.ª Luciane Sales
Biomédica
2018
Técnicas de Esterilização
 
Assepsia: é o conjunto de medidas que utilizamos para impedir a penetração de microrganismos num ambiente que logicamente não os tem, logo um ambiente asséptico é aquele que está livre de infecção. 
Antissepsia: é o conjunto de medidas propostas para inibir o crescimento de microrganismo ou removê-los de um determinado ambiente, podendo ou não destruí-los e para tal fim utilizamos antissépticos ou desinfetantes. 
Desinfecção: é o processo pelo qual se destroem particularmente os germes patogênicos e/ ou se inativa sua toxina ou se inibe o seu desenvolvimento. Os esporos não são necessariamente destruídos. 
Esterilização: é o processo de destruição de todas as formas de vida microbiana (bactérias nas formas vegetativas e esporuladas, fungos e vírus) mediante a aplicação de agentes físicos ou químicos. 
 
MEIOS DE ESTERILIZAÇÃO 
→FÍSICO 
 	•CALOR SECO 
· ESTUFA 
· FLAMBAGEM 
· FULGURAÇÃO 
 	•CALOR ÚMIDO 
· FERVURA 
· AUTOCLAVE 
 	•RADIAÇÕES 
· RAIO ALFA 
· RAIO GAMA 
· RAIOS –X 
→QUÍMICO 
 	•DESINFETANTES 
 
Esterilização por calor seco 
A incineração afeta os microrganismos de forma muito parecida a como afeta as demais proteínas. Os microrganismos são carbonizados ou consumidos pelo calor (oxidação), assim podemos usar a chama para esterilizar (flambagem) e a eletricidade (fulguração). 
O aparelho mais comum para a esterilização pelo calor seco é a estufa. As estufas são usadas para esterilizar materiais “secos”, como vidraria, principalmente os de precisão, seringas, agulhas, pós, instrumentos cortantes, gases vaselinados, óleos, vaselina, etc; 
A esterilização acontece quando a temperatura no interior da estufa atinge 160°C a 170°C, durante 2 horas, ocorrendo destruição dos microrganismos inclusive os esporos. 
Flambagem
 
Meio de esterilização nos laboratórios de microbiologia para a manipulação de material biológico ou transferência de massa bacteriana pela alça bacteriológica. 
 
Esterilização por calor úmido 
Fervura: não oferece uma esterilização completa, pois a temperatura máxima que pode atingir é 100°C e sabemos que os esporos e alguns vírus resistem a essa temperatura. 
Autoclave: age através da difusão do vapor d’agua para dentro da membrana celular (osmose), hidratando o protoplasma celular, produzindo alterações químicas (hidrólise) e coagulando mais facilmente o protoplasma, sob ação do calor. A ação combinada de temperatura, pressão e da umidade são suficientes para uma esterilização rápida, de modo que vapor saturado a 750mmHg e temperatura de 121°C são suficientes para destruir os esporos mais resistentes, em 30 minutos. 
Serve para todos os objetos que não estragam com a umidade e temperatura alta como panos, soluções salinas, instrumentais, agulhas e seringas, vidraria (não os de precisão). 
Radiação: Alternativa de esterilização de artigos termossensíveis (seringa de plástico, agulha hipodérmica, luvas, fios cirúrgicos) por atuar em baixas temperaturas, é um método disponível em escala industrial devido aos elevados custos de implantação e controle. 
 
→ Radiação ionizante: raios beta, gama, x e alfa (cobalto). 
→Radiação 	não-ionizante: 	raios 	ultravioleta, 	ondas 	curtas 	e 	raios infravermelhos). 
 
Agentes químicos utilizados p/ esterilização: 
- óxido de etileno 
- ácido paracético – desinfetante e esterilizante para cateteres 
- aldeído – material de acrílica, cateteres, drenos, nylon, silicone, pvc, laringoscópicos, etc; 
 
Peróxido de hidrogênio: é um agente químico esterilizante tanto na sua forma líquida, gasosa e plasma, inativa bactérias, vírus, bacilos da tuberculose, fungos e alguns esporos. 
Age produzindo radicais hidroxilas livres que atacam a membrana lipídica do DNA e outros elementos da célula microbiana. 
 
Aldeído → O mecanismo de ação é a desnaturação proteica, perda da permeabilidade. 
 
Coleta, Transporte e Processamento de Amostras 
 
Tecidos 
O tecido para cultura deve ser colocado em um frasco estéril, com tampa de rosca e boca larga. Serve para diferenciar entre lesão e malignidade. 
Olhos 
Raspados da conjuntiva ou amostras de swab são obtidos para determinar o agente etiológico da conjuntivite. 
As bactérias são o agente etiológico mais comum da conjuntivite infecciosa e as mais comumente envolvidas são Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, e Staphylococcus epidermidis. 
A coleta faz-se com um swab umedecido com caldo de cultura ou com uma espátula de platina estéril. 
As extensões devem ser secas ao ar e transportadas imediatamente com o meio inoculado para o laboratório. 
Nasofaringe
 
As amostras são obtidas por aspirados, lavados e swab de nasofaringe. São coletadas primariamente para o diagnóstico das infecções respiratórias virais. 
Para coletar as células da nasofaringe com um swab todo o muco da cavidade nasal é removido e um pequeno swab flexível é inserido ao longo do septo nasal até a faringe posterior e rodado contra a mucosa várias vezes. 
Garganta 
As amostras de swab de garganta são mais comumente coletadas para diagnosticar as faringites causadas por Streptococcus do grupo A. As amostras dos swabs de garganta são coletadas baixando-se a língua com um abaixador lingual, introduzindo o swab entre os pilares tonsilares e atrás da úvula sem encostar nas paredes laterais da cavidade bucal e esfregando para trás e para frente transversalmente à faringe posterior. 
Para a detecção de bactérias, as amostras devem ser colocadas em um meio de transporte Stuart modificado.
 
Escarro 
Os estudos microbiológicos do escarro (expectorado e induzido) e as amostras de aspirados traqueais são utilizados primariamente para determinar os agentes etiológicos da pneumonia e tuberculose. 
O escarro é coletado pela manhã, antes da primeira refeição. O paciente deve enxaguar a boca com água e então expectorar uma amostra, preferencialmente de 5 a 10 mL, resultante de uma tosse profunda. 
As amostras de escarro e de aspirados traqueais devem ser enviadas imediatamente ao laboratório ou refrigeradas por breve período de tempo, se a demora for inevitável. 
Para uma ótima detecção de micobactérias no escarro, é recomendado a coleta de 3 amostras em 3 dias separados. 
Trato urinário
 
Os métodos aceitáveis de coleta de urina incluem coleta do fluxo intermediário limpo (preferencialmente a primeira urina da manhã), cateterização e aspiração suprapúbica. 
Para mulheres, a área periuretral e o períneo devem ser limpos antes, com gaze estéril no sentido da frente para trás, enxaguados com uma gaze estéril umedecida, e secos com uma gaze estéril seca. 
Todas as amostras de urina devem ser imediatamente enviadas ao laboratório e têm que ser processadas dentro de 2 horas após a coleta. Se a demora no transporte ou processamento for inevitável, as amostras podem ser refrigeradas por até 24h. 
Trato genital 
As secreções vaginais são úteis na determinação do agente etiológico da vulvovaginite e da vaginose bacteriana. Os patógenos mais comuns são Gardnerella vaginalis, espécies de Candida e Trichomonas vaginalis. 
As amostras endocervicais são coletadas para determinar o agente etiológico da cervicite e para identificar pessoas assintomáticas, portadoras de organismos causadores de DST. 
O swab ou escova é inserido 1 a 2cm para dentro do canal cervical (passando a junção escamocolunar) girado firmemente contra a parede por 10 a 30 segundos, retirado sem tocar na superfície da vagina e colocado em meio de transporte. 
Para diagnosticar DST em homens, devem ser obtidas amostras de swab uretral ou da primeira urina da manhã. De maneira ideal, as amostras do swab uretral são coletadas pelo menos 2 horas após o paciente ter urinado. 
O swab é inserido na uretra por 2 a 4 cm, movimentos rotatórios são feitos em uma direção por 5 segundos, depois retirado e colocado em meio de transporte. 
 
Sangue (Hemocultura) 
O sangue para cultura deve ser coletado antes do início da terapia antimicrobiana, quando qualquer umou uma combinação dos seguintes sinais está presente: febre (pico febril), hipotermia, leucocitose especialmente com desvio à esquerda, granulocitopenia ou hipotensão. 
A maioria das hemoculturas é obtida após o início da febre e dos calafrios. Devem ser transportadas para o laboratório em temperatura ambiente o mais rápido possível após a coleta. 
Nunca devem ser refrigerados. É recomendada a coleta de 20 a 30mL de sangue por cultura, em adultos. Em bebês e em crianças, a concentração dos microrganismos no sangue é mais elevada, e a coleta de 1 a 5 mL de sangue por cultura é adequada. 
3 amostras de hemocultura em um período de 24 horas devem ser suficientes para detectar quase todos os patógenos bacterianos potenciais. 
Os sistemas com caldo de carne convencionais que utilizam meio líquido enriquecido com nutrientes recuperam a maioria das bactérias. 
Soja tríptica ou tripticase, peptona suplementada infusão cérebro- coração, caldo colúmbia ou brucela - Aeróbios e anaeróbios facultativos.
Tioglicolato (Thio) ou caldo de coração para infusão anaeróbia – Anaeróbios.
 
Fezes (Coprocultura) 
 
Devem ser coletadas no início ou fase aguda da doença, quando os patógenos estão usualmente presentes em maior número e, preferencialmente, antes da antibioticoterapia.
Coletar as fezes e colocar em um frasco contendo o meio para transporte (Cary Blair ou salina glicerinada tamponada), fornecido pelo laboratório, em quantidade equivalente a uma colher de sobremesa. Preferir sempre as porções mucosas e sanguinolentas. 
Fechar bem o frasco e agitar o material. Se a amostra não for entregue no laboratório em uma hora, conservar em geladeira a 4ºC, no máximo por um período de 12 horas. Marcar o horário da coleta. 
Usar swab de algodão, certificando-se de que a ponta da haste que suporta o algodão está bem revestida. 
Umedecer o swab em salina estéril (não usar gel lubrificante) e inserir no esfíncter retal, fazendo movimentos rotatórios. Ao retirar, certifique-se que existe coloração fecal no algodão. O número de swabs depende das investigações solicitadas. 
Identificar a amostra e enviar ao laboratório no intervalo de 30 minutos ou utilizar o meio de transporte fornecido. 
 
LCE 
O LCE geralmente é obtido por punção da espinha lombar, mas algumas vezes pode ser aspirado a partir dos ventrículos ou coletado de um desvio. Coleta-se em 3 tubos de vidro: tubo 1 → proteínas e glicose e testes sorológicos, tubo 2 → preparação das extensões p/ coloração pelo método de Gram e para cultura, tubo 3 → contagens celulares e corantes diferenciais. 
Esfregaços 
 
Os esfregaços devem ser preparados com um gradiente de espessura suficientemente denso para facilitar a visualização, mas, também, bastante esparso para revelar as características do agrupamento. Utilizar, de preferência, lâminas limpas e novas (não oxidadas). Os melhores resultados serão obtidos se as mesmas permanecerem no álcool até o momento do uso. 
 
Fixação do Esfregaço 
Calor 
Todo o esfregaço, antes de ser submetido a coloração, deverá estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com calor brando (50ºC). A fixação excessiva e o superaquecimento irão distorcer a morfologia celular e a fixação insuficiente permitirá a saída do material durante o processo de coloração. Deixar a lâmina esfriar antes de iniciar a coloração.
 
Metanol ou Etanol 
 
A fixação pelo metanol ou etanol também pode ser utilizada. Além de prevenir a lise das hemácias, evita que os esfregaços, principalmente os de urina, desprendam-se no momento da coloração. Deixar o esfregaço secar numa superfície plana; após, colocar uma a duas gotas de álcool (1min), drenando o excesso, sem lavar. Não aquecer a lâmina antes da coloração. 
 
Coloração de Gram
Preparo do Reagente para a Coloração de Gram 
 
Cristal-violeta - solução estoque: 
 
Solução A – 
Cristal-violeta 40 g 
Álcool etílico a 95% 400 ml 
 
Solução B – 
Oxalato de amônio 16 g 
Água destilada 1600 ml 
 
Lugol (mordente): 
 
Iodo metálico 1 g 
Iodeto de potássio 2 g 
Água destilada 300 ml 
 
Descolorantes: 
 
Álcool etílico a 95% – agente descolorante lento ou 
Álcool etílico a 95% e acetona (v/v) – agente descolorante intermediário. 
Exige maior habilidade por parte do operador para que não ocorra hiperdescoloração. 
 
Contracorante: 
 
Solução de reserva - safranina 5 g 
Álcool etílico a 95% 500 ml 
 
A coloração de Gram é usada para classificar bactérias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes. 
No laboratório de microbiologia clínica é um teste adicional rápido para o diagnóstico de agentes infecciosos, sendo também utilizado para avaliar a qualidade da amostra clínica analisada. 
As interpretações dos esfregaços corados pelo Gram envolvem considerações relacionadas com as características da coloração, tamanho, forma e agrupamento das células. 
Estas características podem ser influenciadas por vários fatores, incluindo idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera de incubação e a presença de substâncias inibidoras. 
Para preparar uma extensão para coloração, uma alíquota da porção mais purulenta ou mais sanguinolenta da amostra é colocada em uma lâmina de microscópio limpa. 
O material na lâmina é colocado para secar, fixado com metanol ou aquecimento moderado, e então corado com os reagentes da coloração de Gram (cristal de violeta, iodo de Gram, álcool e Safranina). 
Os organismos que possuem uma parede celular Gram-positiva resistem à descoloração com o álcool e retêm a cor púrpura do cristal de violeta. 
Os organismos que possuem parede celular Gram-negativa serão descorados e vão adquirir a cor vermelha com a safranina. Os organismos observados devem ser avaliados quanto ao tamanho, à morfologia e à reação de Gram. 
 
Etapas da coloração 
 
Cobrir a área com a solução de cristal-violeta ou violeta genciana por cerca de 1 minuto. 
Decantar o cristal-violeta e lavar suavemente com água destilada. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das células Gram-positivas). 
Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo ou lugol durante cerca de um minuto. 
Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona (1:1), até que o solvente escorra incolor. Alternar com água corrente (jato fraco). O tempo usualmente utilizado nesta etapa é de cerca de 15 a 30 segundos. (Obs.: lavagem excessiva nesta etapa pode causar a retirada do cristal violeta das células Gram-positivas, assim como, a pouca descoloração pode resultar em pouca retirada do cristal violeta, ocasionando uma tonalidade azulada nas bactérias Gram-negativas). 
Cobrir o esfregaço com a solução de safranina (ou Fucsina básica 0.1% a 0.2%), por cerca de 30 a 1 min. Lavar com água corrente. Deixar secar ao ar, em temperatura branda (50ºC). 
As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto, coradas com o corante de fundo (fucsina) e se apresentam róseas ou avermelhadas. 
 
Outras colorações
ALBERT LAYBORN (CORINEBACTÉRIAS) 
 
Solução A 
Azul-de-toluidina 0,15g 
Verde-malaquita 0,20g 
Ácido acético glacial 1ml 
Álcool 95 2ml 
Água destilada 100ml 
 
Solução B 
Iodo 2g 
Iodeto de potássio 3g 
Água destilada 300ml 
 
Execução 
Corar três minutos com solução A; Escorrer e, lavar com água corrente, cobrir com solução B; Após dois minutos, lavar com água corrente rapidamente; Enxugar com papel de filtro e secar sem passar na chama. 
Observar o corpo bacteriano corado em verde e os grânulos metacromáticos (castanho- escuro). 
 
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN 
 
Solução de carbolfucsina 
Fucsina básica 0,3 g 
Álcool etílico a 95% 10 ml 
Cristais de fenol derretidos 5 ml 
Água destilada 95 mL
Ácido-álcool 
Álcool etílico 97 ml 
Ácido clorídrico concentrado 3 ml 
 
Coloração de fundo (azul-de-metileno) 
Azul-de-metileno 0,3 ml 
Água destilada 100 ml 
 
Execução 
 
Cobrira superfície da lâmina com a solução de carbolfucsina. Aquecer a lâmina coberta com o corante, lentamente com auxílio de um bico de Bunsen, até a emissão de vapores, tomando o cuidado para não deixar ferver. 
Aquecer com calor baixo ou intermitente por um período de três a cinco minutos. Deixar a lâmina esfriar. Lavar a lâmina com água corrente. Cobrir a lâmina com solução de álcool - ácido a 3% e descorar o esfregaço até que o corante não drene mais da lâmina. 
Lavar a lâmina com água corrente e esgotando todo resíduo da mesma. Cobrir a lâmina com o corante de contraste (azul de metileno), por 20 a 30 segundos. 
Lavar a lâmina com água corrente e deixar secar naturalmente sem forçar com papel de filtro. Examinar o esfregaço com objetiva de imersão no aumento de 100x. 
 
Técnicas de Cultura 
Os meios de cultura são selecionados para fornecer as condições ótimas de crescimento dos patógenos comumente encontrados em um local ou tipo particular de amostra. Os meios escolhidos devem incluir meios seletivos e diferenciais além do ágar padrão de enriquecimento. 
O ágar suplementado com sangue é um meio de crescimento geral e demonstra a ação hemolítica das colônias nos eritrócitos. Antibióticos ou químicos podem ser adicionados para criar um meio seletivo como o ágar ácido nalidíxico-colistina (CNA) ou ágar álcool feniletil (PEA), que são utilizados para inibir o crescimento de bacilos Gram negativos ao mesmo tempo em que permitem o crescimento de bactérias Gram- positivos. 
O aquecimento do sangue para preparar o ágar chocolate e adição de suplementos vitamínicos criam um meio enriquecido com disponibilização da hemina (fator x) e da adenina nicotinamida dinucleotídeo (fator v) para o isolamento de Haemophilus spp. e outras bactérias exigentes. 
Os bacilos Gram-negativos podem ser separados dos bacilos Gram-positivos por meio da utilização de um sal biliar e um corante em um meio como ágar MacConkey, que ainda classifica as colônias em positivas ou negativas para lactose, tornando então o meio seletivo e diferencial. 
As culturas bacterianas geralmente são incubadas a 33°C e examinados inicialmente após 18 a 24 horas da incubação. 
A adição de CO2 em concentrações de 5% a 10% é essencial ou estimulatória ao crescimento de Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae, e deve ser utilizada sempre que possível. 
As culturas bacterianas devem ser examinadas rotineiramente depois de 18 a 24 horas de incubação. A exceção a essa regra é a cultura anaeróbia, que geralmente é examinada com 48 horas para permitir que essas bactérias de crescimento mais lento produzam colônias visíveis. 
Em geral, os meios sólidos são mantidos por 48 horas, enquanto os meios líquidos são conservados por mais 24 a 48 horas. 
Meios de Cultura 
Ágar sangue (AS) – meio rico e não seletivo, diferencial para a hemólise, nele crescem a maioria dos Gram negativos e Gram positivos, além de fungos filamentosos (bolores) e leveduras, exceto algumas espécies de hemófilos e outros fastidiosos. 
Ágar chocolate (AC) – meio rico e não seletivo, permite o crescimento da grande maioria das bactérias aeróbias e facultativas. Quando incubado em CO2 dá suporte também ao crescimento dos microaerófilos. Pode-se observar halos esverdeados com colônias alfa- hemolíticas 
Ágar Mac Conkey (MC) – meio seletivo para Gram negativos e diferencial para a utilização de lactose. Deve inibir o crescimento de microrganismos Gram positivos. Lactose positiva – coloração avermelhada/Lactose negativa – coloração inalterada. Como exceção, eventualmente, podem crescer Enterococcus, Candida e Bacillus 
Ágar Salmonela-Shigella (SS) – meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração rósea) e produção de H2S (coloração negra). 
Ágar Hecktoen Enteric (HE) - meio seletivo para Salmonela e Shigella e diferencial para a utilização de lactose (coloração alaranjada) e produção de H2S (coloração negra). 
Ágar Thayer Martin Modificado (TMM) – meio seletivo pela adição de colistina, vancomicina e nistatina inibe crescimento de enterobactérias, Gram positivos, fungos e algumas espécies de Neisserias saprófitas. Enriquecido com a adição de complementos para a recuperação de N. meningitidis e N. gonorrhoeae. 
 
Bactérias de Importância Clínica 
Cocos Gram positivos 
Estafilococos 
Características: os estafilococos são cocos esféricos, positivos para catalase, frequentemente aparecendo como agrupamentos em forma de cacho de uva nas extensões coradas. 
Os estafilococos crescem bem em meios contendo peptona como nutriente em condições aeróbias e anaeróbias, e podem produzir hemólise do sangue de várias espécies de animais e pigmentos amarelo ou laranja no ágar. 
O crescimento dos estafilococos é facilmente detectado nas placas com ágar sangue ou em vários tipos de caldo nutriente. 
Para o isolamento de Staphylococcus aureus, um bom meio seletivo é aquele que contém NaCl 7,5% a 10% com manitol. 
O S. aureus é diferenciado de outras espécies de estafilococos principalmente pela sua produção de coagulases, que são capazes de coagular o plasma. 
Manifestações clínicas e Patogênese: S. aureus pode estar presente entre flora natural da pele, olhos, tratos respiratório e digestório, uretra e, menos frequentemente, vagina. 
As infecções causadas por S. aureus podem acometer múltiplos sistemas orgânicos, entre os mais comuns estão aquelas que envolvem a pele e seus apêndices, como impetigo, foliculite, mastite e infecções em feridas cirúrgicas. O S. aureus é uma das principais causas de bacteremia em pacientes hospitalizados. 
Vários fatores apresentam influência na virulência de S. aureus. A cápsula, se presente, possui atividades anti-fagocíticas. As peptidoglicanas da parede celular possuem atividade semelhante à endotoxina. 
A proteína A, uma substância imunologicamente ativa da parede celular da bactéria, possui capacidade anti-fagocítica. 
O S. aureus produz inúmeras toxinas. A exotoxina TSST1 é responsável pela síndrome do choque tóxico e as enterotoxinas A e E são responsáveis pela intoxicação alimentar pelos estafilococos. 
Toxinas esfoliativas, as toxinas epidermolíticas A e B causam o eritema e a separação da pele observados na síndrome da pele escaldada. 
As doenças mediadas por toxinas de S. aureus incluem a síndrome da pele escaldada, intoxicação alimentar e síndrome do choque tóxico. 
A síndrome da pele escaldada ocorre em bebês infectados com uma cepa de S. aureus produtora da toxina esfoliativa. 
A intoxicação alimentar estafilocócica, caracteriza-se por náusea, vômito, cólicas abdominais e diarreia, ocorre uma a seis horas depois da ingestão de alimentos contaminados com a enterotoxina estafilocócica pré-formada. 
A síndrome do choque tóxico é uma doença multissistêmica, que acomete indivíduos que não possuem anticorpos para TSST-1, as solas dos pés e as palmas das mãos descamam em uma a duas semanas. 
As infecções causadas pelas espécies coagulase-negativas de Staphylococcus geralmente ocorrem em associação com corpos estranhos, especialmente próteses de válvulas, articulações e desvios. O Staphylococcus epidermidis é a espécie mais frequentemente envolvida nessas infecções. 
O Staphylococcus Saprophyticus é uma causa importante de bacteriúria particularmente em mulheres jovens sexualmente ativas. 
Diagnóstico laboratorial: a observação microscópica de cocos tipicamente arredondados, Gram positivos, em grupos, na extensões de material obtido das lesões não abertas ou não drenantes é indicativo de infecção por Staphylococcus. 
O S. aureus produz coagulase, uma enzima que liga o fibrinogênio plasmático, promovendo a aglutinação dos organismos ou a coagulação do plasma. 
Sensibilidade antimicrobiana: Praticamente todos os estafilococos são resistentes à penicilina. 
 
Identificação de Staphylococcus 
 
Prova da Catalase 
 
Com a alça bacteriológica ou com um palito coleta-se o centro de uma colônia suspeita e esfrega-se em uma lamina de vidro. Colocar sobre este esfregaço uma gota de água oxigenadaa 3% e observar a formação de bolhas. Para a família Microccocacea (estafilococos) a prova é geralmente positiva, enquanto que para a família Streptococcacea (estreptococos) é negativa. 
 
Teste da Resistência a Novobiocina 
 
A cepa é semeada de maneira semelhante ao antibiograma em placa de Muller Hinton acrescida de um disco teste de novobiocina contendo 5 µg. As amostras resistentes mostram zonas de inibição de 6 a 12 mm, enquanto as susceptíveis apresentam halos de 16 mm ou mais. As cepas de Staphylococcus saprophyticus são resistentes. 
 
Teste da Coagulase em Lâmina 
 
A maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator aglutinante) “clumping factor” na superfície da parede celular, que reage com o fibrinogênio do plasma causando a coagulação do mesmo. 
Colocar 2 gotas de salina em uma lâmina; Emulsionar uma colônia isolada a ser testada; Colocar uma gota de plasma e misturar com um palito de plástico ou madeira; Observar se há aglutinação em 10 segundos; 
Não se pode executar este teste a partir de um ágar com grande concentração de sal como ágar manitol. 
 
Teste da Coagulase em Tubo 
 
Este teste baseia-se na presença da coagulase livre que reage com um fator plasmático formando um complexo que atua sobre o fibrinogênio formando a fibrina. O teste é melhor efetuado se: Adicionar 0,1 ml de caldo BHI, incubado por uma noite, com colônia suspeita a um tubo de ensaio com 0,5 ml de plasma; 
Incubar por 4 horas à 35°C em estufa ou banho maria; A formação do coágulo é observada pela inclinação suave do tubo de ensaio a 90 graus da vertical. 
Teste da DNAse 
Este teste consiste na inoculação de colônias em meio contendo DNA, (DNAse test agar) obtido comercialmente. Adicionar ao meio original azul de ortotoluidina na concentração de 0,1%; o meio adquire uma coloração azul intensa; 
Incubar a 35°C por 24 horas. Uma coloração rósea característica ao redor das colônias produtoras de DNAse indica a positividade da prova. 
 
Estreptococos e Enterococos 
Características: os estreptococos são cocos Gram-positivos, catalase negativos, esféricos, ovoides ou em formato lanceolado, frequentemente encontrados em pares ou em cadeias. São facultativamente anaeróbicos. Os estreptococos podem ser geralmente classificados de acordo com a reação hemolítica no ágar-sangue. 
As cepas que hemolisam completamente os eritrócitos sobre suas colônias são denominadas β-hemolíticas e podem ser ainda categorizadas nos grupos de Lancefield com base na reatividade sorológica dos carboidratos. 
Os membros importantes desse grupo incluem Streptococcus pyogenes (Grupo A) e Streptococcus agalactiae (grupo B). 
Aqueles que produzem hemólise parcial (provocam o “esverdeamento” do ágar) são os α-hemolíticos. Um membro importante deste grupo é o S. pneumoniae. 
Os estreptococos que não hemolisam o sangue são os ϒ-hemolíticos. Um membro importante deste grupo é o Streptococcus bovis. 
S. agalactiae também podem ser ϒ-hemolíticos. A maior parte dos demais estreptococos α e ϒ- hemolíticos é coletivamente denominada estreptococos “viridans”. 
Os enterococos, previamente designados como estreptococos do grupo D porque seus ácidos teicóicos reagem com anti-soros do grupo D, são suficientemente diferentes dos estreptococos. Esses organismos são cocos Gram-positivos que ocorrem isoladamente, aos pares e em cadeias curtas, são anaeróbios facultativos. 
Manifestações clínicas e Patogênese: uma das manifestações clínicas mais comuns dos estreptococos do grupo A é a faringite, esta pode ser acompanhada por febre escarlate (escarlatina). Infecções cutâneas causadas pelo Streptococcus do grupo A incluem celulite, erisipelas e piodermites. 
S. pyogenes produz inúmeros fatores de virulência. Um dos mais importantes é a proteína M antifagocítica da parede celular. Um outro componente importante da parede celular é o ácido lipoteicóico, que permite a aderência bacteriana ao epitélio respiratório. 
A estreptolisina O, uma enzima antigênica, estável com oxigênio, produz hemólise superficial nas placas com ágar sangue, e a estreptolisina S, uma enzima não- antigênica, estável com oxigênio, produz hemólise superficial. 
As infecções mais comuns causadas pelos estreptococos de grupo B são a sepse neonatal, pneumonia e meningite. 
As infecções causadas por S. pneumoniae são pneumonia, meningite, bacteremia espontânea, sinusite e peritonite espontânea. S. pneumoniae é flora normal do trato respiratório superior. A disseminação é favorecida pelas infecções do trato respiratório superior e pelos aglomerados humanos. O principal fator de virulência de S. pneumoniae é a cápsula polissacarídica antifagocítica. 
A endocardite bacteriana é a infecção mais comum causada pelos streptococcus viridans. Os enterococos não são altamente patogênicos, todavia, são uma causa comum de infecção do trato urinário em pessoas hospitalizadas. 
Diagnóstico laboratorial: os estreptococos crescem bem no ágar-sangue ou no ágar-chocolate. O ágar-sangue é o meio preferido porque permite avaliar as propriedades hemolíticas do organismo. 
Mais de 99% dos isolados de Streptococcus do grupo A são suscetíveis ao antibiótico bacitracina. Todos os isolados Streptococcus são positivos para L-pirrolidonil –β- naftilamida (PYRase). 
Um isolado que se mostra β-hemolítico ou que apresenta uma reação positiva para a adenosina monofosfato cíclica (AMP) é presuntivamente denominado de Streptococcus do grupo B. 
As colônias α-hemolíticas são sugestivas de S. pneumoniae e devem ser avaliadas em termos de sensibilidade ao hidrocloreto de etilidroxicupreína, mais comumente denominado de optocina. S. pneumoniae é suscetível, outros estreptococos α-hemolíticos são resistentes. 
As colônias α-hemolíticas que não são S. pneumoniae e as colônias ϒ-hemolíticas são testados para a hidrólise PYRase, os enterococos são PYRase-positivos, e os Streptococcus viridans são negativos. 
Sensibilidade Antimicrobiana: os antibiogramas dos Streptococcus são previsíveis (todos eles são suscetíveis à penicilina). 
 
Identificação dos Streptococcus 
Os estreptococos podem ser diferenciados de acordo com sua aparência na placa de ágar sangue após incubação a 35°C em presença de 5% de CO2, podendo apresentar: hemólise total (beta), parcial (alfa, de cor esverdeada) ou nenhuma (gama). 
A identificação de espécie de estreptococos beta hemolíticos é feita através de aglutinação com soros específicos contra os antígenos de Lancefield (A, B, C, D, F e G), que constitui uma prova rápida, porém não acessível a todos os laboratórios em virtude do elevado custo. 
 
Teste da Bacitracina 
 
É importante notar que as identificações devem ser feitas em ágar sangue sem tensão de CO2 ou os resultados podem ser conflitantes. Semear a placa de ágar sangue com o estreptococo a ser identificado, como para um antibiograma; Colocar o disco de bacitracina 0,004 u como indicado; 
Incubar por uma noite a 35ºC sem CO2. Observar qualquer zona de inibição como resultado de sensibilidade. O Streptococcus pyogenes (grupo A) é assim rapidamente identificado. 
 
Teste de cAMP (Na mesma placa) 
 
Inocular uma estria única de uma amostra de Staphylococcus aureus produtor de beta lisina no centro de uma placa de ágar sangue preparada obrigatoriamente com sangue de carneiro. 
Inocular as amostras a serem testadas em estrias formando um ângulo reto com a linha de inoculação da amostra teste de estafilococo. 
As estrias não devem se tocar, ficando a 1 mm de distância, e deste modo várias amostras podem ser testadas em uma mesma placa de ágar sangue. A maneira de inocular é fundamental para a observação do efeito esperado. 
Incubar a placa a 35-37°C durante um período de 18-24 horas. 
A positividade da prova, Streptococcus agalactiae (grupo B), é evidenciada pelo alargamento da zona de lise, que adquire a forma de ponta de flecha característica, na área de intersecção entre as duas estrias. 
 
Teste do PYR 
Este teste determina a atividade do PYR também chamado pyrrolidonylaminopeptidase, uma enzima produzidapelo Streptococcus pyogenes e também pelo Enterococcus sp. 
Utilizar somente colônias puras para o teste, pois podem surgir resultados errôneos. Seguir as instruções do fabricante, uma vez que se encontra disponível comercialmente. 
 	Esse teste é tecnicamente, equivalente à prova da hidrólise da bile esculina e crescimento em 6,5% de NaCl, usados na identificação clássica dos enterococos, e mais específico que o teste da Bacitracina na caracterização presuntiva dos estreptococos β- hemolíticos do grupo “A”, tendo a vantagem de ser mais rápido. 
Em qualquer dos dois casos, o PYR constitui uma alternativa importante para esclarecer testes duvidosos. Na impossibilidade da realização de testes sorológicos de confirmação, reforçar o valor dos testes presuntivos clássicos de identificação do Streptococcus pyogenes. 
 
Teste da bile esculina e do NACL 6,5% 
 
Semear as provas de Bile Esculina e do caldo de NaCl a 6,5% Incubar da mesma forma; 
Teste da bile esculina positiva apresenta cor marrom escuro e o do caldo de NaCl a 6,5 % deve mostrar turvação para ser considerado positivo. 
Todos os estreptococos do grupo D de Lancefield apresentam a bile esculina positiva, seja Enterococcus sp ou Streptococcus do grupo D não enterococo (Streptococcus bovis). Quanto ao teste da tolerância ao NaCl a 6,5%, somente os enterococos são positivos. 
 
Identificação dos Streptocococ não β-Hemolíticos 
Somente os estreptococos do grupo B (Streptococcus agalactiae) e D (Enterococcus spp. e Streptococcus bovis) podem não apresentar nenhuma hemólise, a denominada gama hemólise. 
 
Identificação dos Streptococcus α-Hemolíticos 
 
Teste da Optoquina 
Semear um quarto de uma placa de ágar sangue com a cepa alfa hemolítica a ser testada. Aplicar um disco de optoquina. Incubar a 35º C em tensão aumentada de CO2 - método da vela; 
Uma zona de inibição de 14 mm ou mais à volta de um disco de 6 mm significa sensibilidade e identifica o Streptococcus pneumoniae. 
 
Bactérias Gram-negativas 
Enterobacteriaceae 
Características: as enterobacteriaceae são bacilos Gram-negativos aeróbios e anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, imóveis e dotados de flagelos peritríquios, oxidase-negativos, que produzem ácido por meio da fermentação da glicose e reduzem nitratos e nitritos. 
Manifestações clínicas e patogênese: as enterobacteriaceae são encontradas em plantas, no solo, na água, e nos intestinos de animais e do homem. Esses organismos estão comumente associados com infecções clínicas, incluindo abcessos, pneumonia, meningite, septicemia e infecções do trato urinário. 
Os organismos mais comuns são E.coli, Klebsiella spp. Proteus spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Serratia spp., Citrobacter spp. e Providencia spp. 
No trato urinário, os exemplos mais frequentemente isolados são E. coli, Proteus mirabilis e Klebsiella pneumoniae. 
As enterobactérias associadas com diarreia incluem Shigella spp., Salmonella spp. E. coli (enteroaderente, enterohemorrágica, enterotoxigênica, enteroinvasiva, enteropatogênica) e Yersinia. 
As Shigellas raramente são isoladas de outros locais que não o trato gastrointestinal, enquanto as Salmonellas são mais frequentemente isoladas de outras fontes, como urina ou sangue. 
As endotoxinas das Enterobacteriaceae consistem de porções de lipídios e polissacarídeos com pequenas quantidades de aminoácidos e podem induzir febre, calafrios, hipotensão. O choque endotóxico é resultado da septicemia Gram-negativa com a endotoxina. 
Diagnóstico laboratorial: o isolamento dos bacilos Gram- negativos a partir de amostras contaminadas é facilitada pelo emprego de meios diferenciais e seletivos. Secreções: ágar sangue e Mac Conkey 
Líquidos nobres e biópsias: Ágar Chocolate e Mac Conkey
Fezes: Mac Conkey e Salmonella-Shigella 
Urina: CLED ou ágar sangue e Mac Conkey, etc. 
 
O ágar azul de metileno- eosina (EMB) e o ágar Mac Conkey podem ser utilizados alternadamente como meios mínimos seletivos e diferenciais para selecionar inicialmente e diferenciar os bacilos Gram- negativos fermentadores da lactose dos não fermentadores. 
O ágar Xilose- lisina desoxicolato (XLD) é o ágar Entérico Hektoen (HE) são meios seletivos mais diferenciais, especificamente úteis para selecionar Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras altamente contaminadas como as fezes. 
Salmonella spp. produzem H2S e são facilmente reconhecidos pela produção de colônias com centros escuros nos meios ágar XLD, HE e sulfito de bismuto (BS). 
O ágar incubado com cefsulodina - irgasan – novobiocina (CIN) é seletivo e diferencial para a recuperação de Y. enterocolitica. 
O ágar MacConkey, com sorbitol como o açúcar fermentador, é um meio capaz de diferenciar a E. coli enterohemorrágica, pois são negativas para a fermentação do sorbitol, e estão associados com a síndrome urêmico-hemolítica diferente da maioria das outras E. Coli. 
Proteus spp. crescem bem em ágar-sangue, Klebsiella spp. formam colônias mucóides, Serratia marcescens podem produzir um pigmento vermelho, Salmonella spp. produzem H2S e E. Coli são positivas para indol. 
Neisseria 
As espécies de Neisseria têm como característica morfológica serem diplococos Gram-negativos mais achatadas nas laterais, dando a forma de rins ou dois grãos de feijão unidos por uma ponte. Apenas a espécie N. elongata difere desta morfologia, sendo diplobacilos ou diplococo-bacilo. 
Todas neisserias são oxidase positivas e catalase positivas, exceto Neisseria elongata e Kingella denitrificans. Todas utilizam carboidratos por via oxidativa e não fermentativa, sendo baixa a acidez, de modo que podem acontecer reações duvidosas com o meio CTA (Cistyne Tripticase Agar) com indicador vermelho de fenol, que sempre foi muito utilizado em rotina. 
As diferentes espécies de neisseria, incluindo N. meningitidis e N. gonorrhoeae, são analisadas junto com a Moraxella catarrhalis, Moraxella spp., Acinetobacter spp., Kingella spp e Alcaligenes spp. pelas características morfológicas de serem cocos ou cocóides ao Gram e pela possibilidade de haver confusão na sua identificação. 
N. gonorrhoeae e N. meningitidis geralmente exigem imediata incubação em CO2 para seu crescimento. 
Manifestações clínicas e patogênese: Neisseria meningitidis pode colonizar as membranas mucosas do trato respiratório superior, e a Neisseria gonorrhoeae coloniza o trato genital. 
Diagnóstico laboratorial: o elemento mais importante no diagnóstico laboratorial das infecções causadas por N. meningitidis e N. gonorrhoeae é a amostra. Muitas exigem a imediata incubação com CO2. 
Os meios contendo sangue achocolatado são comumente utilizados para as culturas e devem conter antibióticos se a amostra estiver contaminada com a flora endógena. O meio mais indicado é o Thayer martin. 
As extensões coradas por Gram preparados de colônias de N. gonorrhoeae devem demonstrar diplococos Gram-negativos típicos, mas os organismos podem ocorrer em tríades. Todas as espécies são positivas para oxidase e catalase. 
 
Haemophilus
 
São bacilos pleomórficos ou cocobacilos Gram-negativos, pequenos, oxidase positivos, anaeróbios facultativos com exigência de fator X ou V. 
Diferentes espécies pertencentes ao gênero Haemophilus podem ser encontradas como flora normal da nasofaringe e orofaringe, chegando a 50% da população, geralmente cepas não capsuladas, embora também cepas do H. influenzae b possam apenas representar colonização (rara nos adultos e cerca de 5% nas crianças). 
Para considerar o isolamento de Haemophilus é fundamental associar o papel patogênico ao da clínica. Várias são as infecções causadas por H. influenzae, sendo H. influenzae do tipo b as cepas mais virulentas. Entretanto, a partir da década passada, com a disponibilidade de vacinação, houve uma drástica redução na importância desta bactéria nas populações vacinadas. 
Doenças causadas pelo H. influenzae b principalmente na infância: Meningite, Epiglotite, Pericardite, Pneumonia, Artrite séptica, Osteomielite, Celulite facial. 
Mais raramente:peritonite e infecção urinária em crianças menores que cinco anos. Doenças causadas por cepas não b e não tipáveis (em maiores de 9 anos e adultos associados a doença de base predisponente como neoplasia, AIDS, alcoolismo, etc.): Traqueobronquite e pneumonia, Bacteremia, Conjuntivite, Otite (segunda causa depois do pneumococo), Sinusite. 
 
Haemophilus aphrophilus 
 
Microbiota do trato respiratório superior, especialmente em placas dentárias e sulco gengival; endocardite e abscesso cerebral e mais raramente meningite, pneumonia e bacteremia estão associados a este agente, particularmente em pacientes com comprometimento imunológico. 
A endocardite não está necessariamente relacionada à lesão valvular prévia, mas a associação com embolia arterial é freqüente nestes casos. Existem relatos também de isolamento em otites, sinusites e epiglotites, etc. 
Crescem bem em ágar chocolate no isolamento primário e em ágar sangue de carneiro nos subcultivos sem exigência de fatores X e V, mas as colônias são muito pequenas de cor amarelada, cheiro de cola e necessitam de 48 a 72h para boa visualização. 
Em caldo, tem a característica de aderir às paredes do tubo, como o Actinobacillus actinomycetemcomitans. Não crescem em Mac Conkey. Para todos os hemófilos, fazer o teste da beta-lactamase para verificar a resistência à penicilina. 
 
Haemophilus Ducrey 
 
É o agente do cancro mole, sendo na atualidade raramente isolado, pela menor incidência da doença, da contaminação das lesões com flora genital e pelo frequente uso prévio de antibióticos. 
É colhido de úlceras genitais, removendo-se previamente a secreção superficial ou lavando com salina estéril e utilizando um swab. Recomenda-se semear imediatamente e fazer esfregaço a ser corado pelo Gram. Em geral é de difícil cultivo. 
Emprega-se ágar chocolate de cavalo com base GC ou Mueller Hinton. A colocação de um disco de vancomicina pode ajudar a inibir bactérias Gram positivas. Na bacterioscopia aparecem coco-bacilos Gram lábeis agrupados e em cadeias como cardumes. 
 
Identificação de Espécies de Haemophilus 
 
Melhor meio de cultura para Haemophilus influenzae é o ágar chocolate com sangue de cavalo. A base GC usada para Neisserias é indicada, embora os hemófilos cresçam com outras bases como Columbia e Mueller Hinton. 
Há necessidade de umidade e CO2 entre 3 a 5% para o H. influenzae e H. aphrophilus. O ágar chocolate suporta muito bem o crescimento dos haemophilus, mas para outros fastidiosos recomenda-se adicionar suplemento de crescimento. 
As diferentes espécies de haemófilos podem dar reação de oxidase positiva fraca e demorada (cerca de 20 a 25 segundos). 
Em amostras de LCE pode ser útil a aglutinação com partículas de látex, mas a confirmação bioquímica e sorológica em laboratório de referência é necessária.