Microscopia - Resumos

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MICROSCOPIA 
ÓPTICA 
07 de maio de 2022. 
 
 
Biologia celular 
Citologia 
Introdução das organelas celulares 
Descrição das estruturas 
Técnicas e Metodologia no estudo da Célula 
 Um bom microscópio não e aquele que da o maior aumento e sim o 
maior pode de resolução. 
 
 
 
 
 
 
A capacidade de visualizar dois pontos (estruturas) separatas ira 
depender da qualidade da lente e comprimento da onda (limite de 
resolução). 
 
Poder de resolução do 
microscópio 
Menores limites de 
resolução
• Quanto mais informações tiver a objetiva, melhor ela é 
• 1 m (micrômetro) = 1.000X menor que o milimetro 
 Número de abertura da lente 
Resolução = + 
Comprimento da onda (luz) 
 
 
Componentes do microscópio óptico 
• Ocular – Lupa. Possui lentes em seu interior e um diafragma. 
• Objetivas – O mais importante do microscópio. A resolução alcançado e 
maior parte da qualidade da imagem final depende das lentes. Possui 
varias lentes em seu interior. 
• Objetivas de imersão – são objetivas de maior aumento em que se 
utiliza óleo de imersão para aproveitar toda a abertura da lente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Iluminação – O objetivo a ser observado no M.O. deve ser fino o 
suficiente para a luz atravessar. Neste aso é iluminação por 
transparência (tanto os de campo claro quanto os de campo escuro). 
• Filtros – Cores a depender do objetivo (azul, vermelho, verde…). 
• Condensador – Formado por varias lentes internas. Tem a finalidade de 
concentrar a luz de modo que a objetiva receba um cone de luz. É 
regulado pelo diafragma de abertura. 
Aberrações 
Distorções na imagem. 
Raios de luz atravessam a lente e sofrem desvio devido a curvatura da 
lente. Com isso, os raios não se encontram em um só ponto (o que deveria ser 
o ideal por corresponder ao ponto-objetivo). 
• Correção da aberração esférica: Combinação de diferentes lentes 
(curvaturas diferentes) e materiais (óleo de imersão). 
Outras aberrações 
Óleo de Imersão 
Possui o mesmo índice de refração do citoplasma 
Impede que os raios de luz sofram reflexão ao passar pelo material 
Não há ar entre a lamínula e a objetiva 
Não há perda da luz 
Astigmatismo 
Coma 
Distorção 
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 Uma boa objetiva traz alguns dados sobre a sua qualidade: 
• Qualidade da objetiva: Tipo de correção possui (Plan, Fluorita, APO) 
• Aumento dado pela objetiva: 40x, 63x, 10x… 
• Número de abertura: 0,35; 1,0; 1,4 … 
• Espessura da lamínula: 0,17mm… 
 
Modalidades De Observação Em 
Microscopia Óptica 
Campo claro: Mais simples; 
Todos os microscópios funcionam com campo claro; 
Usado para visualização de materiais corados (ex.: eosina). 
Campo escuro: Possuem condensadores especiais; 
Visualização de células vivas; 
Contraste de fase: Visualização de células vivas sem coloração, vivas ou não; 
Possuem Ph (phase) escrito na objetiva; 
Halo ao redor de toda a célula; 
Utilizado em exames rápidos, onde não se deseja fazer 
nenhuma coloração; 
Culturas, esfregações vaginais, analises de células malignas, 
sangue, bactérias, objetos como: minerais, sintéticos e fibras 
têxteis. 
DIC (Contraste Interferencial Diferencial): Usado para visualizar materiais 
excessivamente espessos 
 Visualização de pequenos detalhes de célula sem corar; 
 Fornece maior resolução e sensação de relevo, comparado ao 
contraste de fase; 
 Necessita do uso de prismas; 
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O microscópio devera conter ranhuras para a inserção do 
prisma e não necessita de objetivas especiais; 
Resultado da imagem em relevo (3D). 
Polarização: Observação de materiais (biológicos ou não) que sejam 
birrefringente (que formam duas imagens); 
Estruturas repetitivas: músculo, ossos, celulose, fibras, cabelos, 
cristais… 
Microscópio de fluorescência: O espécimen a ser estudado deve ser 
previamente marcado com algum composto fluorescente; 
Permite a detecção a nível celular de sub-estruturas que 
estejam marcados por fluorocromos; 
Detectam proteínas ou certas estruturas subcelulares que 
fiquem marcadas com compostos fluorescentes; 
Útil em imunocitoquimica; 
Trabalha com um sistema de Epi-iluminação com lâmpadas de 
mercúrio. 
Microscópio invertido: Sistema de iluminação permite a observação de 
materiais extremamente expressos, impossíveis de visualizar nos demais 
microscópios; 
Observação de células dentro de tubos e garrafas; 
Microscópio estereoscópio: Possuem oculares (lupas) que ampliam o 
material permitindo observação de espécimens para dissecação; 
Favorece manipulação de embriões. 
Confocal a Laser (Laser Scanning Microscope – LSM): Permite observar 
material espesso, sem corar, viço ou não, pois focaliza em diferentes planos 
focais; 
Obtém cortes ópticos; 
Proporciona reconstituição tridimensional e a visualização de 
célula como um todo; 
Uso de uma fonte luminosa forte e passar por um pequeno 
orifício (pinhole). 
 
 
 
Microscópio Eletrónico 
De Transmissão 
MET 
14 de Maio de 2022. 
 
 Composto essencialmente de uma fonte geradora de feixe de elétrons, 
de um sistema de lentes eletromagnéticas de nomenclatura e função análoga 
as lentes do M.O. e de uma tela revertida por substancias que se torna 
fluorescente quando bombardeado pelo feixe de elétrons formando a 
imagem. 
Fonte 
• Ou também canhão eletrónico, consiste num filamento de tungstênio 
que é denominado cátodo (negativo). 
• É envolvido por um escudo metálico com um furo central – Escudo de 
Wehnelt. 
• Abaixo fica o ânodo, ligado a terra, sendo portanto neutro. 
• O feixe de elétrons se forma de grande aceleração dos elétrons que 
migram ao longo da coluna, no qual são orientador pelo sistema de 
lentes eletromagnéticas. 
Lentes 
 São bobinas cilíndricas simples (solenóides) pelas quais se faz passar 
corrente elétrica de intensidade variável. 
Obs.: a trajetória do elétron pela lente não é retilínea. 
Condensadora - situa-se abaixo do ânodo e focaliza o feixe eletrónico sobre o 
espécimen, criando condições ideais de iluminação”. 
Objetiva – situa-se logo abaixo do espécimen e forma a ampliação iniciação 
da área atravessadas pelo feixe eletrônico. Essa imagem será 
subsequentemente ampliada pelas lentes intermediarias e projetores. 
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Intermediárias – aumenta a gama de ampliações. Pode haver mais de uma ao 
longo da coluna. 
Projetora – projeta a imagem final podendo ser captada por uma câmara de 
video ou monitor. 
 
 
Microscópio 
Eletrônico De 
Varredura 
MEV 
 
 O microscópio de varredura é capaz de fornecer imagens 
tridimensionais. São utilizados para obtenção de imagens elétrons 
secundários que partem da superfície da amostra quando esta é 
bombardeada pelo feixe de elétrons. 
Constituição Do MEV 
1 – Um sistema de geração de feixe elétrico que varre o espécimen. 
2 – A amostra sobre a qual incide o feixe eletrônico e da qual parte o sinal 
que dará origem a imagem. 
3 – Um sistema de captação de elétrons secundários que coleta o sinal e o 
amplifica. 
4 – Um sistema de composição da imagem formada. 
Preparo de Material para Microscopia de Varredura e Transmissão 
 Os procedimentos para observação visam conferir as células: 
• Um aspecto mais próximo ao in vivo. 
• Resistência ao bombardeamento do feixe de elétrons e ao vácuo da 
coluna do M.E. 
• Contraste. 
• Manter a identidade bioquímica da célula. 
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Etapas 
Fixação 
Pós-fixação 
Desidratação 
 
Inclusão 
Mictomia 
Contratação 
Secagem 
Evaporação com ouro
 
MET 
 
MEV
Fixação 
 Visa matar a célula rapidamente preservando sua estrutura e 
permeabilizando-a, a fim de permitir a penetração do próprio fixador e de 
outras substâncias. 
• Glutaraldeido – Forma ligações com proteínas geralmente utilizado 
numa concentração de 2,5% em tampão. 
• Tetroxido de Ósmio – a 1% é utilizado numa segunda fixação (pós-
fixação) é um ótimo fixador de lipídeos. 
• Formaldeído – Fixador clássico. Não confere uma boa preservação do 
matéria. É usado quando se deseja preservar a integridade bioquímica 
e antigênico da célula.Tampões 
 O tampão tem por função conferir a célula um ambiente de 
osmolaridade de pH semelhantes ao fisiológico, ou seja, impedindo que a 
célula inche ou murche durante a fixação e evitar que o pH dos fixadores leve 
a célula a sofrer durante a fixação. 
• É a mistura de dois sais no qual as células serão lavadas entre as 
etapas do processo. 
• O tampão mais usado é o fosfato de sódio (em M.E.), composto por 
fosfato de sódio monofásico e dibásico. 
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Desidratação 
 Tem por objetivo a substituição da agua presente nas células por 
cetona ou álcool etílico. 
 A coluna dos microscópios eletrônicos permanecem constantemente 
sob alto vácuo, logo, a observação de células hidratadas levaria a altos 
problemas como a evaporação desta agua para o interior da coluna. 
 Consiste na passagem da amostra por uma serie de concentrações 
crescentes de cetona ou etanol até atingir 100%. 
 Quanto mais lenta a desidratação, menores são os riscos de que as 
células se apresentem contraídas ou arrebentadas no resultado final. 
Infiltração em Resina 
 A grande maioria das células é muito espessa para se atravessada pelo 
feixe de elétrons e com isso, precisam ser fatiadas. Para isso o. Tecido 
necessita que esteja enrijecido. 
 As resinas em M.E. são inicialmente liquidas e se infiltram lentamente 
em todos dos espaços intracelular e extracelulares, substituindo o álcool ou 
cetona utilizados na desidratação. 
 Uma vez endurecida a resina obtém-se um pequeno bloco que ode ser 
cortado em fatias ultrafinas. A ultramicrotomia utiliza navalhas muito afiadas 
de vidro ou diamante. Estas fatias ultrafinas flutuam sobre um espelho d’água 
sobre qual são coletadas em pequenas telas de cobre (mais comum), de 
níquel, ouro ou náilon. 
Contrastação 
 Os cortes ultrafinos precisam ser tratados com soluções de sais que 
contenham metais pesados em sua composição para conferir contraste as 
amostras. 
• Acetato de uranila – Possui afinidade pelos ácidos nucléicos, tornando 
eletrodensoso o núcleo, ribossomos e outras estruturas que tem DNA e 
RNA. 
• Citrato de chumbo – Impregna-se principalmente em membranas 
conferindo-lhes contorno nítido. 
Processamento para MEV 
 O material para o MEV deve ser fixado da mesma forma e desidratado. 
Procedemos então a etapa de secagem. Isto é, a substituição da agua por ar. 
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Secagem pelo Ponto Crítico 
 O objetivo é substituir a cetona ou etanol usados na desidratação por 
ar, sem que a célula se deforme. A substituição da cetona ou etanol por CO2 
liquido. A troca é feita entre 0o e 5oC e a pressão atmosférica é elevada 
juntamente com a temperatura até o estado chamado Ponto Crítico, onde o 
CO2 passa para o estado gasoso. 
 O ponto critico do CO2 se dá a 31oC e sobe 73 atmosferas de pressão. 
Evaporação com Ouro 
 O feixe de elétrons passa sobre a preparação onde são gerados 
elétrons secundários que serão utilizados na formação da imagem. A amostra 
necessita ser boa condutora e que dela partem elétrons secundários. 
Congelamento e Criofratura 
 Permite preservar e armazenar células vivas bem como estabiliza-lós 
sem o uso de substâncias químicas. 
 A fixação queimação, o uso de agentes desidratastes, de resinas, de 
fixadores como álcool, provocam alterações diversas ao nível sub-celular, 
deslocando compostos solúveis (íons e moléculas) limitando reações 
químicas e imunológicas. 
Funções 
1. Comparar dados ultraestruturais fornecidos por fixações químicas e 
físicas. 
2. Estocar células: quando se necessita congelar amostras importantes 
para o uso posterior em estado vivo perfeito. 
3. Exame de atividade enzimática: como as enzimas são e modo geral 
muito lábeis, elas mudam sua conformação proteica quando se usa 
fixação química com forte agentes redutores ou oxidativos. 
4. Microanalise por raio X: analise de elementos químicos presentes em 
material biológico que são melhor detectados sob congelamento 
5. Localizar antígenos nas células: marcação através de anticorpos ou 
fluorescência. 
6. Localizar sítios de produção de anticorpos seguido de estimulo de 
antígenos. 
7. Localizar receptores para hormónios. 
8. Diagnósticos rápidos em biópsias e cirurgias. 
9. Localizar sítios sub-celulares para ação de drogas. 
10. Obter novas informações sobre a estrutura/sub-estrutura celular. 
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Criogênios 
 São substancias que tem a propriedade de retirar calor das amostras, 
resfriando-as. Devem ser de fácil obtenção, baratos, não devem contaminar o 
material biológico, não oferecer perigo para o laboratório e de preferência 
permanecer líquidos em temperaturas baixas. 
Criopreservação 
• Tem por objetivo armazenar células por congelamento para revivê-las. 
• Usado em banco de células. 
• O material não perde suas propriedades físico químicas 
• Mantidas em balões de nitrogénio por tempo indeterminado. 
Criofixação 
 Estabiliza o material biológico de modo mais próximo possível do 
estado in vivo. 
Cristalização e Verificação 
 O objetivo a ser alcançado num bom congelamento é o estado de 
verificação, ou seja, a ausência de cristais. 
 Pseudoverificação – onde há cristais menores que 10 nm. 
Crioprotetor 
 São substancias que se ligam a agua celular tanto alterando seu ponto 
de fusão, como se ligando a agua livre. Desse modo há menos possibilidade 
da formação de cristais e gelo. 
• Glicerol – Crioprotetor de escola para criofratura. A pesar de causar 
inúmeros artefato, é necessário fazer fixação previa para melhor 
penetração. Pode ocasionar efeitos osmóticos na célula. 
• DMS0 (Dimetilsulfoxido) – Usado em células viáveis, ou seja, quando se 
deseja congelar células importantes e recuperá-las após um tempo 
(viagens longas). 
Não é recomendado para estudos ultraetruturais, por poder provocar 
efeitos tóxicos no metabolismo e danos na membrana. 
• Açúcares – Sacarose com alta molaridade. Usado em microanalise por 
raios-X já que não penetra na célula. 
Criofratura 
 Consiste no congelamento de células a temperaturas muito baixas e 
submetê-las a uma fratura com lamina. Após a fratura a superfície recebe 
uma delgadissima camada de platina e outra de carbono de modo a formar 
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um filme (molde ou replica). Os restos celulares são digeridos por agentes 
latamente corrosivos de modo que somente a replica é examinado ao MET. 
Vantagens 
1. Por suprimir diversas etapas como o pós-fixação, desidratação, 
inclusão e coloração, o material difere pouco do seu estado in vivo. 
2. Permite observar a parte interna das membranas pois há chances da 
fratura atingir a região hidrofóbica das mesmas. 
3. Obtenção de imagens tridimensionais. 
4. O plano da fratura pode expor qualquer parte da célula fornecendo 
imagens semelhantes a cortes finos. 
5. Permite estudos morfométricos: partículas intermembranosas podem 
ser cortadas, complexos de poros nucleares. 
Etapas da Criofratura com o uso de Crioprotetor 
1. Obtenção da célula 
2. Fixação com 
glutaraldeido 
3. Crioproteção 
4. Congelamento das 
células 
5. Fratura 
6. Etching (opcional) 
7. Metalização 
8. Limpeza da replica
 
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	Preparo de Material para Microscopia de Varredura e Transmissão
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	Infiltração em Resina
	Contrastação
	Os cortes ultrafinos precisam ser tratados com soluções de sais que contenham metais pesados em sua composição para conferir contraste as amostras.
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	Etapas da Criofratura com o uso de Crioprotetor