[bioterismo] Genética e Classificação dos animais - convencionais, gnotobióticos, germfree, flora definida, SPF, outbreed, inbreed - status genético e status sanitário

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Bioterismo 
Classificação dos animais 
Cuidados com a saúde dos animais 
Genética 
 
 
 
Classificação dos biotérios: 
• Quanto a finalidade (criação, manutenção e 
experimentação) – vide resumos anteriores 
 
Classificação dos animais: 
• Quanto ao status sanitário/condição sanitária 
• Quanto ao status genético/condição genética 
 
Classificação quanto ao status sanitário 
 
1. Convencionais (haloxêmicos) 
2. Gnotobióticos 
a. Germfree (GF) 
b. Flora Definida (FD) 
3. Livres de Germes Patogênicos Específicos (SPF) 
 
Relação dos animais com seu meio ambiente particular 
e específico. Isso inclui: 
 
• Organismos associados aos animais 
• Organismos presentes dentro dos limites do 
ambiente físico e barreiras sanitárias 
 
Basicamente é a microbiota, o conjunto de organismos 
associados. Vírus, bactérias e parasitas. Quando mais 
eficientes as barreiras sanitárias, menores as chances 
de contaminação dos animais de experimentação. 
 
Importante saber a origem do animal e as condições 
em que eles são mantidos durante a experiência, para 
assim podermos encaixar o animal no grau correto. 
 
1. Convencionais (haloxênicos): animais que possuem 
microbiota indefinida por serem mantidos em 
ambiente desprovido de barreiras sanitárias rigorosas. 
 
As barreiras utilizadas nos animais convencionais são 
os princípios básicos de higiene – limpeza e desinfecção 
do ambiente e material utilizado e troca de uniformes 
(avental) para o trabalho com esses animais. São 
usualmente criados em sistemas de gaiolas abertas e 
em condições de livre acesso, sendo sujeitos a novas 
infecções. 
 
2. Gnotobióticos (vida conhecida): possuem 
microbiota associada definida, não conhecida ou não 
detectável, e devem ser criados em ambientes dotados 
de barreiras sanitárias absolutas. Eles vivem e são 
produzidos em isoladores e são originados a partir de 
animais Germfree. 
Exemplos de materiais dos isoladores: inox e fibra de 
vidro. 
 
a. Germfree (GF) (axênicos): animais totalmente livres 
de microbiota, ou seja, isentos de parasitas internos e 
externos, bactérias, fungos, protozoários, richetsia e 
vírus. Eles são o primeiro degrau para atingirmos os 
animais de flora indefinida (FD) e SPF. 
 
Várias espécies foram estudadas em ambiente GF, mas 
os ratos e camundongos foram os que melhor 
responderam a ele. 
 
Porém existem alguns microrganismos, como bactérias 
e vírus, que possuem maior resistência e podem ser 
adquiridas por transmissão vertical (exemplo: vírus da 
Cório Meningite Linfocítica). A testagem de colônias 
deve ser realizada. 
Utilização: estudo de imunologia, câncer, radiações, 
doenças entéricas, dentárias, nutricionais etc. 
 
Obtenção: intervenção cirúrgica em fêmea gestante. É 
realizada a histerectomia estéril do útero gravídico e 
introdução dele em isolador estéril, onde os animais 
serão mantidos sob procedimentos de manipulação 
extremamente rigorosos para mantê-los livres de 
germes. 
 
Como ocorre: Os embriões em desenvolvimento são 
protegidos da contaminação pela barreira placentária, 
limitando o tipo e quantidade de material que entra em 
contato com o feto. 
 
O desafio da obtenção do animal GF está na hora do 
parto, que é quando o filhote entra em contato com 
organismos do meio externo pela primeira vez. 
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A histerectomia ocorre 24h antes do parto e, muitas 
vezes, esses filhotes precisam ser reanimados após o 
parto. 
 
Os recém-nascidos obtidos assepticamente nos 
isoladores estéreis têm a opção de usar uma ama-de-
leite GF ou amamentação manual para mantê-los, mas 
geralmente é utilizada a ama-de-leite. 
 
b. Flora Definida (FD): são animais GF 
intencionalmente contaminados com microrganismos 
específicos. Após essa contaminação, o animal pode se 
enquadrar em: 
 
• Monoxênico: contaminado com um tipo de 
microbiota 
• Dixênico: contaminado com dois tipos de 
microbiota 
• Polixênico: contaminado com vários tipos de 
microbiota 
 
Obtenção: transferência de animal Germfree de seu 
isolador para um de barreira restrita. Ele pode ser 
alimentado com ração saturada com microrganismos 
específicos ou através da amamentação, cama e fezes 
de seus pais. Pode ser inoculada uma cultura pura dos 
contaminantes selecionados. 
 
Utilização: restabelecer relação entre flora entérica 
selecionada e taxa de crescimento, susceptibilidade à 
infecção experimental e efeito de endotoxinas. 
 
3. Animais Livres de Germes Patogênicos Específicos 
(SPF): animais livres de microrganismos específicos, 
mas não necessariamente livres de outros 
inespecíficos. 
 
• Heteroxênicos: apresentam apenas 
microrganismos não-patogênicos. 
 
Obtenção: animais Germfree são infectados com flora 
conhecida e não patogênica e colocados em ambiente 
estéril, mas sem isoladores. 
 
Exemplo: animal que apresenta ausência de patógenos 
respiratórios, como a gripe, é desejável para se 
investigar o efeito de um medicamento na função 
pulmonar. 
 
 
 
Diferença entre animais convencionais e Germfree: 
 
Germfree: 
• Coração menor; consequentemente, o 
funcionamento cardíaco, o fluxo de sangue 
para a pele, fígado e intestino e consumo de 
oxigênio também são menores; 
• Paredes capilares e alveolares no pulmão 
menos espessas; 
• Maturação sexual mais lenta; demoram mais 
para entrar em período reprodutivo. 
• Conteúdo cecal com pH maior, em virtude da 
ausência dos ácidos graxos voláteis produzidos 
pelo metabolismo fermentativo da microflora 
intestinal. 
• Crescimento, peso e temperatura corporal 
iguais são os mesmos. 
 
É importante ter conhecimento dessas diferenças para 
que a comparação entre outros animais seja bem 
definida e erros de interpretação não ocorram. 
 
Ou seja: 
 
O padrão sanitário dos animais se classifica em três 
grupos distintos: animais gnotobióticos, que possuem 
microbiota associada definida e devem ser criados em 
ambiente com barreiras sanitárias absolutas; animais 
livres de germes patogênicos específicos (specific 
pathogen free – SPF), que não apresentam microbiota 
capaz de determinar doença, ou seja, albergam 
somente microrganismos não patogênicos; e animais 
denominados de convencionais, que possuem 
microbiota indefinida por serem mantidos em 
ambiente desprovido de barreiras sanitárias rigorosas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Quanto ao status genético 
 
 
1. Outbreed (não-consanguíneos) 
2. Inbreed (consaguíneos – isogênicos) 
2.1 Híbridos 
2.2 Mutantes 
 
 
A partir de agora, entramos no tópico de controle 
genético, manutenção de colônia e reprodução das 
espécies convencionais. 
 
1. Outbreed – não consanguíneos: 
 
São os heterogênicos ou heterozigotos – a 
consanguinidade chega a apenas 1%. São os animais 
convencionais de laboratório. 
 
Eles apresentam constituição genética variada, em 
estado de heterozigose, o que deve ser conhecido e 
mantido. 
 
Características: 
• Animais mais robustos 
• Mais férteis 
• Maior número de filhotes por ninhada 
• Menor susceptibilidade a variações do meio 
• Fenótipo variável 
 
Utilidade: 
Realizar experimentos similares às condições naturais, 
que são populações heterogêneas 
 
Para evitar o acasalamento de parentes próximos, é 
realizado o emprego do sistema de acasalamento 
rotacional. A colônia se desenvolve em vários grupos 
de igual número, assim como o número de machos e 
fêmeas em todos eles. Colônias com maior número de 
indivíduos possui maior quantidade de grupos. 
 
2. Inbreed – consanguíneos 
 
São os isogênicos: índice de 99% de homozigose. São 
os produtos de 20 gerações consecutivas do 
acasalamento entre irmãos ou entre pais e filhos. Esses 
animais são o mais idênticos possíveis que se pode 
obter, possuindo características fixadas. Cada 
linhagem tem sua característica individual e única. 
Geralmente esses animais vivem em isoladores. 
 
Características:• Animais de menor porte 
• Menos férteis 
• Menor número de filhotes por ninhada 
Roedores outbreed podem ter de 10 a 12 filhotes por 
ninhada. Um inbreed costuma ter de 2 a 4. Isso 
também representa maior custo, já que serão 
necessárias mais ninhadas para se conseguir um N 
relevante para pesquisa. 
• Uniformidade fenotípica 
• Estabilidade genética a longo prazo 
 
Utilidade: 
Pesquisas que querem características fixas e que passe 
para todas as gerações. 
 
DBA/1J: camundongo inbreed muito comum. Utilizado 
como modelo para artrite reumatoide e imunização. 
Esse 1 é a cepa com que ele foi modificado, e o J é o 
laboratório de onde ele veio. 
 
Exemplos de isogênicos: 
2.1 Híbridos 
Animais provenientes de duas linhagens isogênicas; 
Vantagem: Animais mais vigorosos, prole mais 
numerosa, uniformidade fenotípica e melhor aceitação 
aos transplantes de tecidos 
Desvantagem: só podem ser reproduzidos a partir do 
cruzamento de linhagens consanguíneas, o que obriga 
o pesquisador a manter ambas as linhagens para 
produzir o híbrido de interesse. 
 
2.2 Mutantes 
• Mutações naturais espontâneas 
• Identificadas a partir de fenotipagem e/ou 
genotipagem 
• Existem sistemas de acasalamento específicos 
(retrocruzamentos) que tem como objetivo 
comparar os efeitos do alelo mutante sem a 
interferência de outras combinações gênicas. 
São três: backcross, cross-intercross e cross-
backcross-intercross. 
 
Coisogênico: mutação ocorre no núcleo reprodutivo de 
uma linhagem isogênica, gerando um novo alelo 
mutante que substitui o alelo original 
Congênico: fixação de uma característica a partir de 
repetidos cruzamentos. 
Transgênicos: animais que possuem um segmento de 
DNA de outra espécie. 
 
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Animal Knockout: Esses animais possuem um gene 
intencionalmente inativado; muitas vezes são 
produzidos através de recombinação homóloga. 
Ocorre comprometimento no sistema imune. 
 
Exemplo: o camundongo c57BI/6 normal é nocauteado 
é resultam em C57BI/6 knockout INF-g. são 
camundongos deficientes em interferon-gama, sendo 
incapazes de controlar a infecção por patógenos como 
Tripanossoma cruzi. Camundongos com mesmo 
genótipo e que expressam esse fator sobrevivem a 
infecção. Se ele recebe um medicamento e ele 
responde, muito provavelmente esse estudo é 
promissor. 
 
Fatores que afetam a reprodução 
 
São relevantes principalmente quando se fala em uma 
taxa de reprodução já reduzida dos animais inbreed. 
• Condições ambientais 
• Manejo 
• Modificações genéticas (inbreed ou outbreed) 
• Variabilidade genética 
• Padrão sanitário (Germfree, SPF, FD...) 
• Nutrição (A restrição calórica entre 15-30% dos 
ratos pode levar a interrupção do ciclo estral e 
ao atraso da maturidade sexual, por exemplo) 
• Olfato 
Os roedores são muito sensíveis a percepção de 
feromônios (liberados pela pele, na urina e fezes), e 
isso causa influencia direta no comportamento das 
fêmeas. Podem sentir os feromônios de outros animais 
a partir da roupa do manipulador ou no ambiente. 
Passar álcool na pele antes de aplicar um medicamento 
também não é ideal. 
Ratos ficam mais ariscos, mas camundongos sentem 
bastante. 
• Audição 
Roedores escutam infra e ultrassons. Ruídos que 
ultrapassem 85dB prejudicam a qualidade reprodutiva. 
Exemplo: máquina de lavar gaiola ao lado do ambiente 
dos animais. 
 
Importância do controle genético 
• Reduzir o número de animais utilizados 
diminuindo as variações dentro/entre grupos 
• Garantir a manutenção de colônias de 
produção fechadas 
• Uniformidade fenotípica (quando é isso que se 
quer) 
• Estabilidade genética: comparação de 
resultados experimentais ao longo do tempo e 
entre laboratórios. 
 
Cuidados com a saúde dos animais 
 
Saúde = bem-estar físico e psicológico 
 
Características observadas 
 
• Peso: 
A queda dele pode representar saúde precária ou pode 
ser decorrente do procedimento realizado; 
 
• Pele e anexos: 
Elástica, úmida, lisa, rósea ou com a característica da 
linhagem. Anormalidades podem ser decorrentes de 
alimentação, temperatura, alergia e verminoses; tomar 
cuidado com a troca de alimentação no período de 
adaptação, pois às vezes eles eram adaptados a outro 
tipo de alimentação; 
 
• Pelos: 
homogêneo, brilhosos, sem áreas alopécicas ou 
feridas; 
 
• Olhos: 
brilhantes, umidificados e mostrando vivacidade; 
 
• Orelhas: 
inchaço na base pode ser tumoral; 
 
• Dentes: 
devem gerar atrito com alimentos. O crescimento 
excessivo pode gerar má oclusão, que é a quebra ou 
desalinhamento; geralmente é um problema 
hereditário. Em biotérios, deve-se investigar quem são 
os pais e o que está acontecendo com eles. Pode ser 
realizado o desgaste ou adaptar a alimentação. 
 
• Sistema circulatório: 
sempre realizar a inspeção habitual do 
comportamento e batimentos cardíacos – não dá para 
contar, mas pode-se monitorar. 
 
• Sistema respiratório: 
eles são muito susceptíveis a doenças do trato 
respiratório, já que eles sempre são mantidos a uma 
temperatura controlada. Monitorar se há espirros, por 
exemplo. 
 
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• Sistema genitourinário: 
cuidado especial com Leptospira sp. A infecção se dá a 
partir da urina de roedores selvagens e pode ser 
transmitida ao homem. Sempre manipular com luvas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Acasalamento 
 
A escolha depende de fatores como: 
 
• Característica genética necessária 
• Espaço existente no biotério 
• Número de animais necessários 
 
Acasalamento de animais heterogênicos: 
 
• Produção de população natural. 
• Escolha de métodos de acasalamento que 
evitem a consanguinidade 
• Permitir que a população se mantenha 
constante em todas as suas características pelo 
maior número de gerações possíveis 
• Manter o alto nível de heterozigose 
• Preservar a estabilidade da população inicial 
de alelos e sua frequência o máximo possível 
durante as gerações 
 
Colônia de Fundação: Para que tudo isso ocorra, tem-
se a chamada colônia de fundação. É a matriz. Eles não 
são vendidos nem sairão daquele local. 
 
Características da colônia de fundação heterogênicos: 
• Mínimo de 200 casais 
• Fechada (não há introdução de novos pares 
reprodutivos) 
• Monogâmica 
• Acasalamento randômico (indivíduos com 
igual chance de participação) 
• Não pode haver critérios de seleção para não 
fixar alelos 
• Tempo reprodutivo fixo (30 semanas) 
• Aumentar os intervalos entre gerações (o 
máximo possível – usar da quinta ninhada pra 
frente) 
• Renovação do casal ocorre de 6 a 8 meses. 
 
Caso um casal não esteja procriando adequadamente, 
deve haver a substituição desse casal. Se não for 
possível, substituir pela F1, F2... 
 
Colônia de produção e/ou expansão: é a segunda linha 
após a colônia de fundação. Os descendentes da 
colônia de fundação, após o desmame, vão para 
crescimento/fornecimento. 
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Importante: manter o mesmo número de filhotes 
mamando para manter a uniformidade dos animais 
durante o crescimento. 
 
Acasalamento de animais isogênicos: 
 
Pode haver problemas de animais inférteis, com 
malformações, morte repentina e mutações. 
 
Características: 
• Preservar a isogenicidade e alto coeficiente de 
consanguinidade 
• Evitar contaminações genéticas, mutações e 
heterozigose residual 
• Colônia de fundação: 10-20 pares 
monogâmicos 
 
Manejo do acasalamento 
• Separação física de diferentes linhagens 
• Sistema de identificação controlado 
• Núcleo da fundação deve vir de um ancestral 
comum 
• Colônia pedigree 
• Observar animais com variações fenotípicas – 
pode ocorrer graças a contaminação ou 
mutação 
 
Método Lane-Peter (Traffic-light): 
método de identificação para animais isogênicos. São 
colocadas fitas coloridas nas caixas. 
• Faixa branca: F1 da colôniafundadora 
• Faixa verde: F1 da faixa branca 
• Faixa amarela: F1 da faixa verde 
• Faixa vermelha: F1 da faixa amarela 
 
Método reprodutivo das Linhas Paralelas: 
 
 
 
Uma tendência que vem sendo implementada nos 
biotérios é a do congelamento dos óvulos a partir da 
colônia de expansão, diminuindo custos e evitando que 
animais sejam criados e eutanasiados 
desnecessariamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Métodos de acasalamento 
 
1. Monogâmico 
2. Poligâmico 
 
1. Monogâmico: um macho e uma fêmea permanecem 
juntos permanentemente na gaiola. No caso dos 
roedores, é amplamente utilizado em colônias de 
fundação de animais consanguíneos onde se 
empregam acasalamento entre irmãos. Comum em 
mice. 
 
Vantagens: 
• Fácil identificação dos filhotes 
• Manutenção de registro fidedigno 
• Elevada porcentagem de cios férteis pós-parto 
• Elevada porcentagem de filhote desmamados 
• Maior controle das enfermidades 
• Boa seleção dos reprodutores 
 
Desvantagens: 
• Aumento de mão-de-obra 
• Necessidade de grande número de machos 
reprodutores; 
• Necessidade de espaços maiores 
 
2. Poligâmico: um macho para um grupo de duas ou 
mais fêmeas. Mais utilizado em colônias de animais de 
produção de roedores e na grande maioria das 
espécies primatas. 
 
Vantagem: 
• Maior número de animais em menos espaço 
 
Desvantagens: 
• Dificuldade para registro dos animais 
• Identificação da fêmea e do macho não fértil 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sistemas de acasalamento 
 
1. Acasalamento ao acaso 
2. Sistema rotacional 
Método Poiley 
Método Falconer 
3. Acasalamento consanguíneo 
 
Colônias com 10 – 25 animais: o sistema utilizado é o 
de consanguinidade mínima. O princípio básico diz que 
cada macho contribui com um macho e cada fêmea 
contribui com uma fêmea para a geração seguinte. 
Para que isso ocorra, todos devem ser acasalados ao 
mesmo tempo para não haver sobreposição de 
gerações. 
 
Colônias de 25 – 100 animais: o sistema utilizado é o 
rotacional. O objetivo é evitar o acasalamento de 
parentes próximos 
 
Colônias acima de 100 machos: acasalamento ao 
acaso, já que a chance de consanguinidade é menor. 
 
1. Acasalamento ao acaso: a chance de acasalamento 
de um macho qualquer e uma fêmea qualquer da 
população é igual para todos os animais. 
 
Em grandes populações, o acasalamento ao acaso 
preserva os genes e as suas frequências ao longo das 
gerações, desde que não haja seleção ou mutações 
ocorrendo (lei de Hardy-Weinberg) 
 
Já em populações menores, a tendência é que haja a 
perda de alelos e a fixação de outros. Ou seja: 
homozigose. 
 
2. Sistema rotacional: evita o acasalamento de 
parentes próximos e assegura que a próxima geração 
venha de um espectro mais amplo de pais do que seria 
se fosse ao acaso. É empregado onde existe uma 
contínua substituição das colônias sem distinção entre 
as gerações. Esses acasalamentos são arranjados de 
forma sistemática e a escolha dos animais é feita 
dentro dos grupos. 
 
2.1 Método Poiley: quanto menor o número de 
unidades reprodutivas, maior o número de grupos 
formados; costumam ser de 3 a 12 grupos. Esses 
acasalamentos seguem esquemas predefinidos e 
podem ser realizados de acordo com as necessidades 
de reposição de cada grupo. 
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2.2 Método Falconer: 
Também ocorre a formação de grupos, mas em vez de 
embaralharmos os novos grupos a serem formados, 
fixamos um dos sexos e rotacionamos o outro. 
 
4. Acasalamento consanguíneo: Realizada com irmãos 
da mesma ninhada. Ocorre a manutenção das 
características da linhagem consanguínea; Fixação de 
características ou desenvolvimento de novas 
linhagens. 
 
Ao partir de um casal representante, acasala-se todos 
os irmãos de todas as ninhadas; à medida que a colônia 
cresce, se começa a selecionar quais os melhores casais 
e apenas acasala-se os filhotes desses casais. Ao atingir 
20 casais, se inicia a reposição deles. 
 
Após 3 gerações consecutivas, escolhe-se um novo 
casal para rederivar a colônia de maneira que 
possamos traçar uma única linha no pedigree dos 
casais atuais até o casal ancestral comum. Assim, evita-
se o distanciamento dos animais em reprodução com o 
ancestral. 
 
Um menor número de casais representa maior chance 
de fixação de alelos desejáveis. 
 
 
Referências 
Molinaro, E. M., Majerowicz, J., Couto, S. E. R., Borges, C. C. 
A., & Moreira, W. C. (2009). Animais de laboratório. EPSJV. 
 
ANDRADE, Antenor; PINTO, Sergio Correia; OLIVEIRA, 
Rosilene Santos de. Animais de laboratório: criação e 
experimentação. Editora Fiocruz, 2006.