enzimas_de_restricao (1)

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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO
A DESCOBERTA
1970- Universidade John Hopkins- EUA
Laboratório de Hamilton Smith
Isolada enzima de restrição de uma bactéria
BACTÉRIAS- produzem naturalmente enzimas de restrição proteção contra infecções virais
Enzimas CORTAM o DNA viral em fragmentos
PORQUE ESTAS ENZIMAS NÃO DEGRADAM O DNA DAS BACTÉRIAS?
Elas se protegem metilando as sequências de seu DNA
Enzimas de restrição 
Enzimas produzidos por bactérias para restringir a proliferação de vírus invasores
Diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de bases de DNA
Ajuda a detectar a presença de diferentes formas de determinados genes
 in 1fiuA-1crf_-active
Nomenclatura
As enzimas de restrição são chamadas de acordo com a bactéria que o produziu
RY 13
Exemplo: EcoR I
Escherichia
coli
1º enzima a ser descoberta nesta bactéria
Género
Estirpe
Espécie
Ordem de descoberta 
COMO ELAS CORTAM O DNA
DOIS TIPOS DE FRAGMENTOS:
EXTREMIDADES SIMÉTRICAS: quando as fitas são clivadas em posições opostas
EXTREMIDADES COESIVAS: quando os cortes encontram-se deslocados
COMO AS ENZIMAS AGEM
Extremidades coesivas
EXTREMIDADES SIMÉTRICAS
EcoRI 	Escherichia coli
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens RH
BglII		Bacillus globigii
PvuII		Proteus vulgaris
HindIII	Haemophilus influenzae Rd
HinfI		Haemophilus influenzae Rf
Sau3A	Staphylococcus aureus
AluI		Arthrobacter luteus
TaqI		Thermus aquaticus
HaeIII		Haemophilus aegyptius
NotI		Nocardia otitidis-caviarum
Hidrólise Enzimática
- A hidrólise dá-se ao nível das ligações fosfodiéster
-Mg2+ é um cofator essencial, mas pode ser substituído por certos cations divalentes, como Mn2+
- Produtos da hidrólise resultam em extremidades 3’-OH e
	5’-P
5’
3’
5’
3’
Hidrólise Enzimática
A hidrólise enzimática pode ser simples ou múltipla dependendo do número de enzimas utilizados na obtenção de fragmentos de DNA
 Hidrólise múltipla:
 DNA hidrolisado por mais que um enzima de restrição
 Determinação das posições dos fragmentos no DNA, produzidos pelos enzimas, com a ajuda da electroforese
 Hidrólise simples:
 Digestão do DNA com um único enzima de restrição
 Determinação relativa das orientações dos fragmentos no DNA linear
Fatores que influenciam a atividade dos enzimas de restrição:
Composição do tampão
Diferem na força iónica (concentração de sal)
Diferem no tampão principal (Na+ ou K+)
Solução: Manter o pH da reação (geralmente em 8.0)
Influência da metilação no DNA
 Existem algumas endonucleases de restrição que não clivam DNA metilado
Temperatura de incubação
 A maioria dos enzimas cliva melhor a 37ºC
 Exceções: Bactérias termofílicas – clivam melhor entre 50 a 60ºC
	
Armazenamento: - 20ºC.
	Como as enzimas de restrição possuem a capacidade de cortar o DNA dependendo de uma sequência específica, elas são muito utilizadas em Biologia Molecular para verificar a variabilidade de indivíduos que diferem em uma determinada sequência por um único nucleotídeo (SNP), e para obtenção de fragmentos para construção de moléculas de DNA recombinante.
UTILIDADE DAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
RFPL: Polimorfismos de tamanho do 	fragmento de restrição
	Técnica utilizada para detecção dos polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs – single nucleotide polymorphisms). 
	Basicamente é um ensaio onde o produto da PCR é submetido à ação da enzima de restrição.
PCR-RFLP
Neste exemplo, em uma população, os indivíduos diferem em uma determinada sequência do DNA. A grande parte da população possui uma Adenina na posição 5 da sequência, enquanto a menor parte possui uma forma variante deste fragmento, cujo na posição 5 existe uma Guanina.
Mas como a enzima de restrição pode distinguir qual indivíduo possui qual sequência ?
Clivagem por endonucleases
Aqui existem duas possibilidades de sequência
AGCT ou ACCT, sendo que a enzima, reconhece
Genótipos Possíveis
Marcadores
10
25
50
80
100
DNA não digerido
70
1
2
3
1 – Indivíduo Heterozigoto: Uma fita de DNA possui a sequência reconhecida pela enzima de restrição, sendo que a outra fita não possui essa sequência.
2 – Indivíduo homozigoto para o sítio de restrição. Ambas as fitas possuem a mesma sequência, que é reconhecida pela enzima de restrição.
3 – Indivíduo Homozigoto SEM o sítio de restrição. Ambas as fitas possuem a mesma sequência, que NÂO são reconhecidas pela enzima de restrição.
o gene XRCC1 -
Na posição, Arg399Gln
No DNA correspondente podemos ter os nucleotídeos G ou A .
Um fragmento de 614 pb contendo esta região é amplificado por PCR e submetido à digestão enzimática.
EXEMPLO
Será utilizada a Enzima MspI – Moxarella species que reconhece CCGG 
– A pergunta é: a enzima corta quem ? O Alelo A ou o Alelo G.
Resposta:
614 – alelo A – Não corta pois a enzima não reconhece CCAG
374 e 240 – alelo G
AG
GG
AA
L
GG
GG
GG
GG
GG
AG
AG
AG
GG
AG
L
AG
AG
AG