PROSPECÇÃO DE LEVEDURAS SELECIONADAS DO MEL DA ABELHA MELIPONA FASCICULATA (TIÚBA) PARA OBTENÇÃO DE UM DESTILADO ALCOÓLICO, COMPONENTE NA PRODUÇÃO DE LICORES

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1 
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO MARANHÃO 
CENTRO DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS 
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA 
 
 
 
 
Projeto: 
Mel de Melipona fasciculata (Tiúba): identificação de leveduras intrínsecas e sua 
aplicação biotecnológica 
 
 
Plano de Trabalho: 
Prospecção de leveduras selecionadas do mel da abelha Melipona fasciculata (Tiúba) 
para obtenção de um destilado alcoólico, componente na produção de licores 
 
 
 
Orientador: Prof.º Dr. José Ribamar Silva Barros 
Bolsista: Luis Alberto Rocha Rodrigues Junior 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São Luís – MA 
2022 
 
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Projeto: 
Mel de Melipona fasciculata (Tiúba): identificação de leveduras intrínsecas e sua 
aplicação biotecnológica 
 
 
Plano de Trabalho: 
Prospecção de leveduras selecionadas do mel da abelha Melipona fasciculata (Tiúba) 
para obtenção de um destilado alcoólico, componente na produção de 
licores 
 
 
 
 
 
 
Orientador: Prof.º Dr. José Ribamar Silva 
Barros 
Bolsista: Luis Alberto Rocha Rodrigues Junior 
 
 
 
 
 
 
Orientador 
José de Ribamar Silva Barros 
 
 
 
Bolsista CNPq 
Luis Alberto Rocha Rodrigues Junior 
 
 
 
 
3 
RESUMO 
As abelhas sem ferrão (Hymenoptera, Apidae, Meliponinae), são as abelhas nativas que 
produzem um mel bem característico, muito apreciado por conta de sua composição físico-
química e teor alcoólico. O teor alcoólico dos méis se deve em sua maioria presença de 
leveduras que podem fermentá-los, garantindo assim este sabor diferenciado. Nesse sentido, a 
fermentação alcoólica é considerada resultado do crescimento de microrganismos intrínsecos, 
presentes de forma natural nos méis e sempre sobrevivendo nos substratos e equipamentos 
utilizados. Diante disso, projeto têm como objetivo o isolamento, identificação e caracterização 
molecular de leveduras intrínsecas do mel de Melipona fasciculata (Tiúba) do Maranhão e sua 
aplicação para obtenção de um novo produto de valor agregado. Foram utilizadas neste projeto 
amostras de mel de M. fasciculata (Tiúba) proveniente do município de Santo Amaro, onde 
foram feitas diluições em série. Após diluição e inoculação das amostras de mel, as séries que 
apresentaram desenvolvimento de colônias, foram fotografadas para análises de características 
macro e microscópicas. Os isolados foram multiplicados e expostos a testes de estresse. O 
isolado selecionado foi o SAD0 que, após exposto aos testes, foi introduzido em mosto no qual, 
depois que fermentado, foi destilado e produzido álcool que teve como graduação alcoólica um 
volume de 40% de álcool, permitido pela normativa nº 13 de 29 de junho de 2005. O destilado 
foi misturado junto a suco concentrado de maracujá juntamente com adição de calda de açúcar, 
originando assim um licor de maracujá, com graduação alcoólica por volta de 22% de volume 
alcoólico. O destilado alcoólico apresentou aroma característico com leve adocicado no final, 
já o licor de maracujá feito com o uso do álcool retirado do hidromel apresentou sabor aceitável. 
 
Palavras-chaves: Bebidas, Teor alcoólico, microrganismo. 
 
 
 
 
4 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 5 
2 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................. 7 
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 7 
3 METODOLOGIA .................................................................................................................. 8 
3.1 Coleta das amostras ........................................................................................................ 8 
3.2 Isolamento e inoculação das leveduras ......................................................................... 8 
3.3 Caracterização morfológica ........................................................................................... 8 
3.4 Multiplicação e armazenamento das leveduras ........................................................... 9 
3.6 Seleção das leveduras e testes em diferentes condições ............................................... 9 
3.6.1 Diferentes condições de carbono................................................................................ 9 
3.6.2 Teste de floculação ................................................................................................... 10 
3.6.3 Diferentes condições de etanol ................................................................................. 10 
3.6.4 Diferentes níveis de salinidade ................................................................................. 10 
3.7 Preparo do hidromel para destilação .......................................................................... 10 
3.8 Preparo do licor ............................................................................................................ 11 
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................................... 12 
4.1 Isolamento das leveduras ............................................................................................. 12 
4.2 Armazenamento das leveduras .................................................................................... 13 
4.3 Caracterização morfológica ......................................................................................... 14 
4.4 Seleção das leveduras e testes em diferentes condições ................................................. 15 
4.4.1 Diferentes condições de carbono.............................................................................. 16 
4.4.2 Teste de floculação ................................................................................................... 16 
4.4.3 Resistencia a níveis de salinidade ............................................................................ 17 
4.4.4 Diferentes condições de etanol ................................................................................. 17 
4.5 Seleção utilizada para produção do hidromel ............................................................ 18 
4.6 Produção do licor com leveduras isoladas do mel de Tiúba ..................................... 18 
5 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 21 
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 22 
 
 
 
 
 
 
5 
 
1 INTRODUÇÃO 
As abelhas sem ferrão (Hymenoptera, Apidae, Meliponinae), diferentemente das Apis 
mellifera (italianas, africanas ou europeias), não possuem glândula de veneno, nem ferrão. São 
as abelhas nativas que produzem um mel bem característico, muito apreciado por conta de sua 
composição físico-química. Além do mel, estas abelhas têm um papel importantíssimo na 
manutenção da flora, são polinizadores de até 90% das plantas nativas, dependendo da região 
(KERR et al., 1996). 
Neste contexto, o Maranhão (nordeste do Brasil) se destaca a criação da abelha nativa, 
Melipona fasciculata (Apidae, Meliponini), conhecida como Tiúba, que apresenta importância 
ecológica, pela polinização da flora endêmica, e econômica, por auxiliar na renda de pequenos 
agricultores familiares (BEZERRA, 2002). Onde a região de Santo Amaro, por exemplo, possui 
grande potencial na produção de mel de Tiúba, que conta com uma ótima estrutura para o 
beneficiamento do mel além de possui uma rica biodiversidade vegetal que incorpora uma 
complexa conexão de ecossistemas, incluindo manguezais, campos abertos e inundáveis, 
babaçuais, estuários, lagunas e matas ciliares (MARTINS E OLIVEIRA, 2011; DE MOURA, 
2004). 
Algumas abelhas do gênero Melipona são capazes de produzir um mel com 
características físico-químicas diferenciadas como maior acidez, umidade e teoralcoólico 
característico (RODRIGUES et al., 2005; SILVEIRA et al., 2002). Estes méis possuem 
atrativas características medicinais e antioxidantes que atraem consumidores distintos, 
dispostos a pagar altos preços por este valioso produto, o qual possuem expressiva ascensão no 
mercado brasileiro, com preços mais elevados se comparado ao mel de abelha A. mellifera 
(SOUZA et al., 2004). 
O teor alcoólico dos méis se deve em sua maioria presença de leveduras que podem 
fermentá-los, garantindo assim este sabor diferenciado (MENDES-FERREIRA et al., 2010). 
Nesse sentido, a fermentação alcoólica, cujo produtos originários são, em maior quantidade, o 
álcool etílico (etanol) e o gás carbônico (CO2) (CAMPOLINA, 2018), é considerada resultado 
do crescimento de microrganismos intrínsecos, presentes de forma natural nos méis e sempre 
sobrevivendo nos substratos e equipamentos utilizados. Alguns substratos que contêm grande 
quantidade de açúcar, umidade e fontes de carboidratos facilmente assimilados são os 
ambientes mais propícios para que as populações de leveduras cresçam e ali se tornem densas. 
Ademais, flores e frutos se apresentam como habitats favoráveis a possuir todas essas 
características (ASHENAFI, 2006; BAHIRU et al., 2001; FARIAS, 2019). No entanto este tipo 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160510005209?casa_token=2LuNvs8u9JEAAAAA:dC6DOPFhuZ4j5DjtqexNPmdVz93OiZNMEuTuu2GVZRw4hh68Bmb6XUibSEA0-jxcRC9693xK#bb0005
 
6 
de fermentação alcoólica pode ser imprevisível resultando na degradação do alimento e 
elaboração de bebidas como licores de frutas. 
Em um mel com maior umidade, pode-se encontrar predominante as leveduras sendo 
principais aquelas do gênero Zygosaccharomyces que são reconhecidas como osmofílicas 
(SILVA et al., 2017). O mel de Tiúba apresenta elevada umidade de 23 a 28 % (FERNANDES 
et al., 2020a; HOLANDA et al., 2012) se comparado ao mel de Apis, 20 % (BRASIL, 2000) o 
que pode favorecer a presença de leveduras osmofílicas. Além disso, o mel elaborado por essas 
abelhas tem sabor levemente ácido, com o máximo de 70% de açúcar, um valor aceitável se 
comparado ao mel de Apis que possui padrões estabelecidos pela normativa Nº 20 de outubro 
de 2000 no qual mensura o valor mínimo em 65% de açúcar (BRASIL, 2000), o que o torna 
mais apreciável e de qualidade adequada ao consumo humano (FERNANDES, 2017). 
Algumas leveduras foram identificadas no mel e produtos de abelhas sem ferrão, como 
Candida (Torulopsis) apícola que está associada às espécies Melipona quadrifasciata 
(Mandaçaia) e Melipona rufiventris (Uruçú-amarela) por isso, poderiam ser utilizadas na 
produção de bebidas, destacando-se assim os licores (SILVA, 2017). 
De acordo com Pinto (2019), licores são bebidas alcoólicas produzidas nas mais 
diversas regiões do mundo, tendo suas principais características relacionadas com a técnica de 
preparação, matéria-prima e finalidade sendo uma bebida doce, de alto teor alcoólico no qual a 
tecnologia aplicada em sua produção é considerada simples e o produto final é comercializado 
à temperatura ambiente apresentando um longo tempo para ser consumido. 
O Decreto n. 6871, de 4 de junho de 2009 descreve que licor é considerada uma bebida 
elaborada com álcool etílico potável ou destilado alcoólico simples, com graduação alcoólica 
entre de 15 a 54% em volume, a 20 graus Celsius, e um teor de açúcar superior a 30 gramas por 
litro, adicionada de extratos ou substâncias de origem vegetal ou animal, substâncias 
aromatizantes, saborizantes, corantes e outros aditivos permitidos pela legislação vigente. Licor 
de frutas é uma bebida alcoólica preparada sem processo fermentativo e seus principais 
componentes naturais são as frutas (BRASIL, 2009). Nesse sentido, este projeto teve como 
objetivo isolar, identificar e caracterizar as leveduras presentes no mel da abelha Tiúba, a fim 
de obter um novo produto de valor agregado. 
 
 
 
7 
2 OBJETIVO GERAL 
Isolamento, identificação e caracterização molecular de leveduras intrínsecas do mel de 
Melipona fasciculata (Tiúba) do Maranhão e sua aplicação para obtenção de um novo produto 
de valor agregado. 
 
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
✓ Prospecção de leveduras com potencial tecnológico na obtenção de produtos de 
alto valor agregado; 
✓ Seleção de leveduras com potencial alcoólico para produção de licores; 
✓ Obtenção de um novo produto que atenda as exigências do MAPA e do mercado 
potencial; 
✓ Valorização da Meliponicultura e do mel da Tiúba produzido no Maranhão. 
 
 
8 
3 METODOLOGIA 
3.1 Coleta das amostras 
Foram utilizadas neste projeto amostras de mel de M. fasciculata (Tiúba) proveniente 
do município de Santo Amaro, que possui um expressivo número de produtores do mel de 
Tiúba e o proponente mantém colaboração de projetos anteriores. 
Na coleta do mel foram utilizados kits contendo seringas e canudos estéreis (Figura 1) 
com o objetivo de reduzir possíveis contaminações na coleta do mel, garantindo apenas 
microrganismos próprios do mel. O mel foi armazenado em tubos estéreis em ambiente 
protegido da luz direta. 
Figura 1: Coleta do mel utilizando materiais esterilizados. 
 
Fonte: RODRIGUES, 2021. 
3.2 Isolamento e inoculação das leveduras 
Do mel coletado, foram feitas diluições em série, nos períodos de 0, 45 e 90 dias após a 
data de cada coleta, onde foi retirado uma alíquota de 25g de mel e diluídos em 225mL de água 
peptonada (10-1), e subsequentemente,1mL desta diluição foi adicionado em tubos de ensaio 
contendo 9mL do mesmo diluente (10-2) e assim por diante até a diluição 10-5. 
De cada diluição, foram inoculadas em Agar de extrato de levedura-extrato de malte 
(YM) (glicose a 1%, peptona a 0,5%, extrato de malte a 0,3%, extrato de levedura a 0,3%, ágar 
a 2%) volumes de 100µL e 1mL organizados em triplicada para melhores observações. As 
placas foram incubadas a 28 °C e examinadas periodicamente até o crescimento de leveduras 
(SAKSINCHAI et al., 2012; DE SOUSA et al., 2020). 
3.3 Caracterização morfológica 
Após diluição e inoculação das amostras de mel, as séries que apresentaram 
desenvolvimento de colônias, foram fotografadas para análises de características macro e 
microscópicas. A caracterização morfológica das colônias foi baseada em aspectos vistos no 
crescimento em placa de petri. 
 
9 
As características macroscópicas estudadas foram a forma da colônia (Circular ou 
irregular), cor das colônias (branca, creme, amarela, rosa ou marrom), consistência (cremosa, 
mucóide, butirosa, esfarelada, dura, seca) e bordas das colônias (lisas, franjeadas, onduladas, 
pregueadas, cremadas, lobuladas e filamentosas), tamanho (Pequeno, médio ou grande) e brilho 
(Opaco, moderado, intenso). 
As características microscópicas foram observadas baseada na forma no qual pode ser 
classificada em elipsoide, globosa, cilíndrica, apiculada, triangular, talóide, globular com hifas, 
globular com pseudohifas (ANGIOLETTO, 2013; ALMEIDA, 2014; PEREIRA 2001). 
3.4 Multiplicação e armazenamento das leveduras 
Com ajuda de alça estéril de 1µL, foi retirada alíquota de 3µL de cada placa para 
suspensão em meio de cultura líquida YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de 
dextrose, 0.02% cloranfenicol), seguida de incubação por 72 horas a 28 ᵒC sob agitação (Figura 
2) em agitador orbital GLOBAL TRADE DSR-10 com velocidade constante a 150 rpm 
(BARRY et al., 2018). 
Após a multiplicação das amostras, foram retiradas 800µL e colocados em microtubos 
eppendorf com 200µL de glicerol a 20% (v/v) e congelados instantaneamente em nitrogênio 
líquido e posteriormente, armazenados a -80 ᵒC (BARRY et al., 2018) para conservação do 
material biológico e futuros trabalhos. 
Figura 2: Erlenmeyer com amostras para agitação referente ao período 0 após a coleta. 
 
Fonte: RODRIGUES JUNIOR, 2021. 
3.6 Seleção das leveduras e testes em diferentes condições 
3.6.1 Diferentes condiçõesde carbono 
Para os testes fermentativos em diferentes meios com carbono, as leveduras foram 
inoculadas em tubos, contendo em seu interior 30mL de meio líquido YPD (extrato de levedura 
e peptona) acrescentado da fonte de carbono a ser testada glicose 2 g (p/v), sacarose 2 g (p/v), 
maltose 2 g (p/v), frutose 2 g (p/v), e xilose 2g (p/v). As amostras foram mantidas em 
 
10 
temperatura ambiente e durante 48 horas, observando o crescimento das leveduras e a formação 
de gás CO2 (FARIAS, 2019). 
3.6.2 Teste de floculação 
Para os testes de floculação, os inóculos foram colocados em tubos contendo 30 mL 
de meio líquido YPD (extrato de levedura e peptona) com glicose (2% p/v) e deixados em 
temperatura ambiente durante 48 horas. Após este período, foram levadas à agitação em 
aparelho vórtex para visualização da formação de flocos (FARIAS, 2019). 
3.6.3 Diferentes condições de etanol 
Para testes de tolerância a etanol, foram inoculadas em tubos contendo 20 mL de meio 
líquido YPD (extrato de levedura e peptona) adicionado de glicose (2% p/v) e de etanol nas 
concentrações variáveis de 10% (v/v), 20% (v/v) e 30% (v/v), seguida de incubação a 
temperatura ambiente durante 48 horas com observações frequentes para crescimento e 
formação de gás (FARIAS, 2019). 
3.6.4 Diferentes níveis de salinidade 
Foram preparados meios de cultura YPD modificados com adição de cloreto de sódio 
(NaCl) nas concentrações de 3%, 5% e 7%. A partir da padronização, foram retiradas alíquotas 
que posteriormente eram inoculadas em placas de Petri com o meio YPD modificado com NaCl 
e incubadas em BOD à 15°C. Cada uma das concentrações foi feita em triplicata e avaliadas 
após 7 e 14 dias de incubação (FARIAS, 2018). 
3.7 Preparo do hidromel para destilação 
Para o preparo do mosto fermentativo (Figura 5), foi utilizado mel de Apis mellifera 
diluído em água na proporção de 2:1 (IGLESIAS et al., 2014) tendo como valor de ᵒBrix inicial 
de 32. Em seguida, foram adicionados ao mosto complemento nutricional para levedura, 
antiespumante mais antibacteriano e, por fim, as leveduras selecionadas por meios dos testes 
executados e multiplicadas para inoculação. 
Com auxílio de um refratômetro de grau ᵒBrix e com o intuito de se obter um volume 
alcoólico de 10%, diariamente era medido o valor de açucares no mosto a fim de que a leitura 
observada fosse igual a 16 ᵒBrix, valor referente a uma gravidade específica de 
aproximadamente 1.060 SG, que corresponde aos 10% de volume alcoólico desejado. 
 
 
11 
Figura 05: Mosto fermentativo preparado para produção do hidromel. 
 
Fonte: Autoria própria, 2022. 
3.8 Preparo do licor 
Após a fermentação, houve o processo de destilação do hidromel a fim de se obter a 
aguardente do hidromel, levando como parâmetro de graduação alcoólica, a estabelecida para 
cana de açúcar pela normativa nº 13 de 29/06/2005 que coloca a graduação alcoólica mínima 
de 38% e máxima de 54% (BRASIL, 2005). 
Para preparo do licor, a fruta utilizada foi o maracujá, comum em supermercados e com 
uma aceitação entre as pessoas que apreciam bebidas mais doces. Foi utilizado 3 frutos onde 
constituiu na retirada da poupa e utilizado o suco concentrado com volume de 350 mL. Após a 
extração do suco, foi emulsificado com o destilado alcoólico proveniente do hidromel e 
armazenado com ausência de luz por 3 dias. Em seguida, a mistura foi filtrada e adicionado 500 
mL de calda de açúcar, finalizando a composição do licor de maracujá. 
 
 
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4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 
4.1 Isolamento das leveduras 
O isolamento das leveduras consistiu no processo de diluição descrito no item 3.2 da 
metodologia. O mel coletado teve um código de designação seguido de um número de indicação 
do período de maturação como apresentado na Tabela 1. 
Tabela 1: Códigos designados para cada cidade onde houve a coleta dos méis. 
Cidade Código Tempo de coleta (dias) Código 
Santo Amaro SA 
0 SAD0 
45 SAD45 
90 SAD90 
Legenda: D = dia; SA = Santo Amaro. 
Fonte: Elaborado pelo autor, 2022. 
O processo de isolamento se fez por meio da observação do crescimento das leveduras 
logo após o processo de diluição. Cada série de diluição foi dividida em triplicada, como 
supracitado no item 2.3. As placas que apresentaram o crescimento de colônias (Figura 6), 
foram repicadas e passadas para placas contendo meio de cultura sólido YPD para fins de 
isolamento das colônias observadas e logo após, armazenadas em BOD a 28º C. 
Figura 6: Crescimento de colônias de leveduras do mel Tiúba de (SAD0). 
 
Legenda: (A) Crescimento de leveduras com volume de 1mL; (B) Crescimento de Leveduras em placas com 
volume de 100 µL. 
Fonte: Elaborado pelo autor, 2021. 
Ao inocular volumes diferentes com níveis de diluições diferentes, observou-se o maior 
crescimento de colônias nos que tiveram 1mL (Figura 7). Essas colônias iam decrescendo à 
medida que a série da diluição iria diminuindo, algo visto no trabalho de Facco et al. (2016) 
que fizeram estudos sobre leveduras, onde foram identificados a partir do 3º a 4º dia após a 
inoculação do material diluído nas placas. 
 
 
13 
Figura 7: Crescimento de colônias em SAD0. 
 
Legenda: Identificação de colônias em menor quantidade no volume de 100µL a 10-5(A); 
Identificação de colônias em maior quantidade no volume de 1mL a 10-5 (B); 
Identificação de colônias em maior quantidade no volume de 1mL a 10-3 (C); 
Identificação de colônias em menor quantidade no volume de 100µL a 10-3(D); 
Fonte: Elaborado pelo autor, 2021. 
 
Fernandes et al. (2020b), enfatizam que as leveduras são capazes de prosperar no mel 
de Tiúba, isso porque sobrevivem em condições de acidez, típica no mel em questão, e não 
sofrem inibição pelo açúcar. Diante disso, ao analisar o crescimento de leveduras nos três 
períodos estudados, 0, 45 e 90 dias após a coleta, observou-se que o crescimento de colônias de 
leveduras aos 90 dias ainda era presente, porém, em menor quantidade nas placas no qual foram 
inoculadas as diluições. 
Essa condição pode estar relacionada às características presentes no mel ao decorrer na 
sua maturação, como aponta Rosa (2014), onde afirma que bolores e leveduras possuem a 
capacidade de se desenvolver em condições desfavoráveis para a maioria dos microrganismos 
e que podem crescer em substratos com concentrações de açúcares menores, intoleráveis para 
as bactérias, e também, tolerando altas concentrações de ácidos e variações de pH entre 2 e 9. 
4.2 Armazenamento das leveduras 
Quanto ao armazenamento, foram realizados a partir dos isolados selecionados das 
diluições. Ao total, de cada procedência, foram armazenadas 16 amostras em microtubos 
eppendorf colocados em caixas para microtubos. Os tubos foram identificados com a 
nomenclatura apresentada na Tabela 2. 
Tabela 2: Codificação dos tubos para armazenamento. 
Cidade Tempo 0 Tempo 45 Tempo 90 
 
14 
Santo Amaro SAD0 b SAD45 b SBD90 b 
Santo Amaro - SAD45 r - 
Legenda: b = branco; r = rosa; 
Fonte: Elaborada pelo autor, 2022. 
Na tabela acima, a codificação de cada procedência foi designada baseado 
principalmente nas cores e formas de cada colônia. As amostras de SA do período 45 dias após 
a coleta, apresentou maior variação de cor e forma e por isso seguiram com mais exemplares 
para o armazenamento. 
4.3 Caracterização morfológica 
A caracterização morfológica vista macroscopicamente é apresentado na Figura 8, onde 
foram observadas as colônias puras, inoculadas após multiplicação, num volume de 100µL em 
placa de petri com meio YPD. As características observadas foram catalogadas como mostra a 
Tabela 3. 
Figura 8: Placas com leveduras inoculadas de SA com os períodos 0, 45 e 90 dias. 
 
Legenda: b = branco; r = rosa; bt = branco transparente; a = amarelo. 
Fonte: Elaborado pelo autor, 2022. 
Silva et al. (2013), conseguiram isolar leveduras com cores que se assemelham com as 
que foram encontradas neste trabalho,tons de rosa e amarelo foram vistos por ele com formato 
circular e brilho moderado com bordas lisas. 
Tabela 3: Características macroscópicas dos isolados de SA. 
 
Código Tamanho colônia Consist. Cor borda Brilho 
SAD0 b Pequeno Circular Cremosa Branca Lisas Opaca 
SAD45 b Pequeno Irregular Cremosa Creme Ondulada Moderado 
SAD45 r Pequeno Irregular Cremosa Rosa Ondulada Opaca 
SAD90 b Pequeno Circular Cremosa Creme Ondulada Moderado 
Legenda: b = branco; r = rosa; Consist. = Consistência. 
Fonte: Elaborado pelo autor, 2022. 
Na tabela 3, observa-se um padrão quanto ao tamanho e borda das leveduras referindo 
aos três períodos analisados. Ademais, dentro do período 0 e 90, houve pouca divergência 
 
15 
dentre as classificações supracitadas na tabela. Em relação ao período de 45 dias após a coleta, 
houve distinções em relação a cor, com tons de branco e rosa encontrados. 
Aspectos microscópicos podem ser vistos na figura 8 no qual está representando a foto 
tirada de cada colônia vista da figura 9. 
Figura 9: Captura microscópica das placas com colônias isoladas. 
 
Fonte: Elaborado pelo autor, 2022. 
De maneira geral, ao observar as fotografias, os isolados apresentaram formato 
diferentes entre eles. Contudo, Fleuri & Sato (2010) e Morais et al. (2014), fotografaram 
leveduras que se assemelham com a foto apresentada no período de 0 dias após a coleta. 
A tabela 4 abaixo descreve a caracterização dada para cada forma observada pelo 
microscópio. 
Tabela 4: Classificação das formas vistas por microscopia. 
Código Forma 
SAD0 b Elipsoide 
SAD45 b Elipsoide 
SAD45 r Globular 
SAD90 b Globular 
Fonte: Elaborado pelo autor, 2022. 
4.4 Seleção das leveduras e testes em diferentes condições 
Ao analisar a literatura mais com mais precisão, observou-se que a seleção SA45 r não 
apresentava características morfológicas vistas em isolados já registrados de leveduras que são 
utilizadas no ramo de bebidas, suspeitando-se ser um isolado que pode causar efeitos adversos 
a saúde. Por este motivo, decidiu-se não a utilizar nos testes de resistência e na produção da 
 
16 
bebida. No entanto, não se descartou o conteúdo isolado, o trabalho de caracterização molecular 
da seleção está sendo executado para que haja melhores análises no exemplar. 
4.4.1 Diferentes condições de carbono 
O teste em diferentes condições de carbono está condicionado no crescimento de 
inóculos em diferentes tipos de açúcar acrescentados no meio de cultura. Brandão (2021), 
afirma que estes testes servem para selecionar estirpes de leveduras que se assemelhem ao 
gênero Saccharomyces, principal gênero utilizado na produção de bebidas. A tabela 5 apresenta 
as seleções obtidas nos três diferentes tempos de maturação e seu desempenho ao serem 
inoculados nos seguintes açúcares. 
Tabela 5: Teste com leveduras em diferentes tipos de açúcares. 
 Frutose Sacarose Glicose Maltose Xilose 
SAD0 + + + + + 
SAD45 + + + + + 
SAD90 + + + + -- 
 Legenda: + = constatou-se desenvolvimento e formação de bolhas; -- = Não houve crescimento; 
As observações de cada parâmetro foram feitas à medida que houve formação de bolhas 
que, segundo Farias (2019), indica a assimilação do carbono pelo inoculo. Nesse sentido, todos 
os inóculos referentes a todos os tempos de maturação apresentaram assimilação dos açúcares 
inseridos, com exceção do inóculo referente ao tempo de 90 dias após a coleta, que não foi 
observado formação de bolhas em uma avaliação feita na xilose. 
4.4.2 Teste de floculação 
Na produção de bebidas destiladas, a floculação é um elemento importante para o 
processo de produção na indústria de bebidas, já que, uma baixa floculação influencia 
negativamente no processo de separação, uma vez que a floculação acelera o processo de 
decantação, otimizando o processo (SILVA et al., 2022). No intuito de selecionar cepas que 
apresentam essa característica, foi observado por meio do teste de floculação, quais dos isolados 
apresentaram tal característica. A tabela 6 apresenta quais apresentaram tal comportamento. 
Tabela 6: Teste de floculação com os isolados de leveduras. 
 Repetição 1 Repetição 2 Repetição 3 
SAD0 + -- + 
SAD45 + + + 
SAD90 + + + 
Legenda: + = constatou-se floculação; -- = Não houve floculação; 
Como visto, os 3 apresentaram a capacidade de flocular, porém, essa característica, 
quando comparada a leveduras já selecionadas (Figura 10), não se observa algo tão 
significativo. 
 
17 
Figura 10: Comparação da floculação entre o isolado estudado, SAD0 a esquerda, e um isolado estudado por 
Brandão (2021), a direita. 
 
Fonte: Autoria própria, 2022. 
4.4.3 Resistencia a níveis de salinidade 
Lins (2012), descreve que o sal pode ser um componente inibitório do crescimento de 
microrganismos, a tabela 7 apresenta o resultado da observação dos inóculos submetidos a 
concentrações diferentes de NaCl. 
Tabela 7: Teste com leveduras em diferentes concentrações de NaCl. 
Concentração de NaCl 
3% 
Repetição 1 Repetição 2 Repetição 3 
SAD0 + + + 
SAD45 -- -- -- 
SAD90 -- -- -- 
Concentração de NaCl 
5% 
Repetição 1 Repetição 2 Repetição 3 
SAD0 -- -- -- 
SAD45 -- -- -- 
SAD90 -- -- -- 
Concentração de NaCl 
7% 
Repetição 1 Repetição 2 Repetição 3 
SAD0 -- -- -- 
SAD45 -- -- -- 
SAD90 -- -- -- 
Legenda: + = constatou-se crescimento; -- = Não houve crescimento; 
No que diz respeito às observações, destaca-se que concentrações acima de 3% inibem 
total o crescimento dos isolados, corroborando com o que Lins (2012) apontou em seu trabalho. 
Porém, há um destaque para o isolado SAD0 que apresentou desenvolvimento em uma 
repetição com concentração de NaCl em 3%. 
4.4.4 Diferentes condições de etanol 
No ramo de bebidas, o processo fermentativo tem por finalidade a produção de etanol, 
um álcool que pode trazer características de impacto sensoriais ou não para o destilado ou 
Isolado sad0 Isolado cerlev194 
 
18 
fermentado. No entanto, uma serie de efeitos prejudiciais da exposição das células de leveduras 
à altas concentrações de etanol durante a fermentação, tais como, inibição do crescimento e do 
tamanho das células, efeito mutagênico no metabolismo respiratório, redução da fermentação, 
inibição enzimática, aumento da permeabilidade da membrana celular (SILVA et al., 2022). 
Entender em quais concentrações de etanol esse isolados se adaptam, formaliza um 
importante componente no que diz respeito à bioprospecção das seleções, como é apresentado 
na tabela 8. 
Tabela 8: Teste com leveduras em diferentes concentrações de álcool etílico. 
Concentração de álcool 
10% 
Repetição 1 Repetição 2 
SAD0 + + 
SAD45 -- -- 
SAD90 -- -- 
Concentração de álcool 
20% 
Repetição 1 Repetição 2 
SAD0 + + 
SAD45 + + 
SAD90 + + 
Concentração de álcool 
30% 
Repetição 1 Repetição 2 
SAD0 -- -- 
SAD45 -- -- 
SAD90 -- -- 
Legenda: + = constatou-se crescimento; -- = Não houve crescimento; 
Ao observar a tabela 8 acima, o isolado feito no período inicial após a coleta, SAD0, 
apresentou desenvolvimento em duas concentrações de etanol. Essa observação pode indicar 
uma melhor adaptação dessa seleção em variações de etanol, indicando também, que em uma 
possível prospecção para produção de bebidas, apresente características que atendam os 
parâmetros sensoriais e de concentrações de volumes alcoólicos. 
4.5 Seleção utilizada para produção do hidromel 
Ao observar cada teste, é notório que a seleção SAD0 apresentou melhores resultados. 
Dos quatro testes executados, essa seleção obteve um ponto de crescimento/desenvolvimento, 
entendendo-se que ela, em detrimento das outras seleções apresentou melhores adaptações nos 
testes realizados. Diante disto, a seleção foi a escolhida para os processos fermentativos 
descritos abaixo. 
4.6 Produção do licor com leveduras isoladas do mel de Tiúba 
A produção do licor consistiu no processo de destilação do hidromel (Figura 11) 
produzido utilizandoa levedura, isolada e selecionada por meio dos testes já citado. No 
processo de destilação, houve a separação do conteúdo extraído, no caso, o álcool. 
 
19 
Figura 11: Processo de destilação do hidromel para produção do destilado alcoólico. 
 
Fonte: Autoria própria, 2022. 
A separação consiste na divisão das partes do destilado em cabeça, que possui uma 
graduação alcoólica acima do permitido pela normativa brasileira que considera o máximo de 
54% de volume alcoólico, o coração, parte no qual possui graduação alcoólica aceitável citada 
no item 3.8 da metodologia, e a cauda, desprezada por conta da baixa graduação alcoólica que 
destoa da permitida para uma cachaça ou aguardente (BRASIL, 2005). Diante disto, a destilação 
resultou num produto de graduação alcoólica registrada em 40% vol. (quarenta porcento de 
volume alcoólico) como é possível observar na figura 12. 
Figura 12: Resultado da destilação do hidromel, um destilado alcoólico com 40% de vol. de álcool. 
 
Fonte: Autoria própria, 2022. 
De acordo com a normativa, licores são bebidas mistas (BRASIL, 2008). Nesse 
sentido, a produção do licor foi realizada com a extração da poupa de maracujá (Figura 13) e 
mistura com o destilado alcoólico retirado do hidromel, como já citados no item 3.7 da 
metodologia. A mistura foi deixada em repouso com a ausência de luz para emulsificação. Em 
seguida, foi preparada a calda doce e adicionada à mistura. 
 
 
20 
Figura 13: Extração de poupa do maracujá para produção do licor. 
 
Fonte: Autoria própria, 2022. 
Por conta da diluição feita com a calda, a graduação alcoólica do licor passou a ser 
observada em 22% de álcool, padrão permitido pela normativa (Figura 14). 
Figura 14: Licor de maracujá feito com destilado alcoólico do hidromel. 
 
Fonte: Autoria própria, 2022. 
 
 
21 
5 CONCLUSÕES 
• Foi observado que à medida que ocorreram as diluições em períodos muito 
posteriores a coleta, a quantidade de colônias foram diminuindo; 
• Foi possível identificar, baseado em características morfológicas vistas na 
literatura, diferentes aspectos vistos em leveduras já selecionadas; 
• A levedura isolada conseguiu realizar o processo de fermentação do açúcar do 
mel; 
• Para melhor caracterização, os isolados foram encaminhados para 
sequenciamento e será trabalhado para definição das espécies. 
• O destilado alcoólico apresentou aroma característico com leve adocicado no 
final; 
• O licor de maracujá feito com o uso do álcool retirado do hidromel apresentou 
sabor aceitável; 
• A aplicação em bioprocessos das leveduras selecionadas poderão trazer 
alternativas no uso de um fermento, no qual o processo de fermentação de bebidas será 
facilitado tendo em vista o acesso de um fermento produzido no estado maranhense. 
• Algumas avaliações com os isolados e com o produto resultante deste trabalho 
ainda precisam ser feitas. Por conta de problemas com o equipamento para multiplicação, o 
progresso em alguns testes e a testagem da bebida ficaram comprometidos. 
 
 
22 
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