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Microbiologia de Alimentos Responsável pelo Conteúdo: Prof.ª Dr.ª Elisa Mara Prioli Ciapina Rochedo Revisão Textual: Prof.ª Dr.ª Luciene Oliveira da Costa Granadeiro Análise Microbiológica de Alimentos Análise Microbiológica de Alimentos • Entender a importância dos microrganismos indicadores de contaminação para o monito- ramento da qualidade da água e alimento; • Conhecer os padrões microbiológicos de água e alimentos estabelecidos em legislação; • Conhecer técnicas de contagem de microrganismos. OBJETIVOS DE APRENDIZADO • Microrganismos Indicadores de Qualidade de Água e Alimentos; • Meios de Cultura para Contagem Microbiana; • Métodos para Análise Microbiológica de Água e Alimentos; • Análise dos Resultados. UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos Contextualização Os alimentos e a água são importantes veículos de transmissão de patógenos, sendo responsáveis por diversos surtos de doenças. Fazer análise microbiológica de alimentos/água é fundamental para garantir a segurança para o consumo. No entanto, são vários os microrganismos patogênicos e é inviável a análise de todos eles. Dessa forma, foram escolhidos alguns microrganismos indicadores de qualidade microbiológica. Quer dizer que, se esse microrganismo indicador estiver no alimento/água, sugere-se que as condições higiênico-sanitárias estão insatisfató- rias; o processo de higienização foi ineficiente; pode ter ocorrido uma contaminação pós-processamento; ou, ainda, condição higiênica inapropriada dos manipuladores. A legislação de água e alimentos estabelece os padrões microbiológicos aceitáveis para consumo, onde é possível fiscalizar os estabelecimentos e a qualidade do produto servido em diferentes situações. Para fazer as análises microbiológicas, são utilizados meios de cultura e técnicas apropriadas para obter um resultado confiável e poder comparar com os valores da legislação. Nesta unidade, você terá uma visão geral de como fazer as análises microbio- lógicas em alimentos e água, e como interpretar os resultados de acordo com a legislação pertinente. 8 9 Microrganismos Indicadores de Qualidade de Água e Alimentos Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de microrganismos que, quando presentes em água/alimentos, podem fornecer indicações sobre as condições higiênicas durante o processamento, produção ou armazenamento de alimentos; pro- vável presença de patógenos; deterioração de alimentos; ocorrência de contaminação de origem fecal, indicando condições higiênicas sanitárias inadequadas. Os indicadores são utilizados, também, devido à inviabilidade técnica de detecção de todos os microrganismos importantes, tanto os que são patogênicos como os deteriorantes. Lembrando que a água é um veículo de contaminação para os alimentos, desta forma, deve-se ter a preocupação de realizar análises microbiológicas de água e alimentos. A contagem dos microrganismos indicadores pode ser feita de diversas maneiras, que será discutido posteriormente, e o resultado pode ser expresso em Unidade Formadora de Colônia (UFC)/g ou mL (quando se utiliza um meio de cultura sólido e conta-se as colônias crescidas) ou Número Mais Provável (NMP)/100mL (quando se utiliza meio de cultura líquido). Podemos destacar a contagem de alguns indicadores para a análise microbiológica de água e alimentos. Indicadores Gerais de Contaminação do Alimento • Contagem Total de Microrganismos Aeróbios Mesófilos: Também chamada de Contagem Padrão em Placas, é o método mais utilizado para verificar popu- lações microbianas, de um modo geral. Essa contagem não diferencia gêneros ou espécies de bactérias, e fornece informações sobre a qualidade do alimento, matérias-primas utilizadas, condições de processamento, manipulação, práticas de manufatura e vida útil do alimento. É importante ressaltar que não são indicadores de segurança, pois não está diretamente relacionado à presença de patógenos ou toxinas. Mesmo que os patógenos estejam ausentes, e que não tenha alteração organolética do alimento, o elevado número indica que o alimento é insalubre (não é bom para a saúde). Em alimentos, onde é possível verificar processos de deterioração, encontram-se valores entre 106 UFC/g do alimento até a 108 UFC/g de alimento. Dessa forma, se a carga microbiana (quantidade de microrganismos) inicial de um alimento está próxima a esses valores, deve-se ter cuidado, pois o alimento pode estar próximo a se deteriorar e terá uma vida útil menor. Em alimentos fermentados, outros valores devem ser considerados na deterioração do alimento. Em água, a contagem desses microrganismos indica integridade do sistema de distribuição de água e reservatório (tubulação e caixas de armazenamento), 9 UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos sendo que não deve exceder 500 UFC/mL, segundo legislação (Portaria nº 2.914/2011); • Contagem Total de Microrganismos Aeróbios Psicrotrófilos e Termófilos: Os psicrotrófilos são os microrganismos que se multiplicam em alimentos refri- gerados, podendo atingir a faixa de temperatura dos mesófilos. Essa contagem fornece informações sobre o grau de deterioração de alimentos refrigerados. Os termófilos são os microrganismos que crescem em temperaturas mais elevadas. Essa contagem fornece informações sobre o grau de deterioração de alimentos submetidos a tratamento térmico; • Contagem de Bolores e Leveduras: Maioria dos bolores e leveduras é encon- trada no solo e ar. Podem provocar deterioração e torna-se um perigo a saúde pública devido à produção de micotoxinas pelos bolores. Em alimentos ácidos e de baixa atividade de água, o crescimento do fungo é observado. Indicadores de Contaminação Fecal ou da Qualidade Higiênico-Sanitária dos Alimentos • Contagem de Enterobactérias: São bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, por isso são chamadas de enterobactérias. Essa família inclui as bactérias Gram negativas na forma de bastonetes (bacilos), que não produzem endósporos, são anaeróbias facultativas e apresentam características bioquímicas típicas dessa família como produtoras de ácidos e gás na fermen- tação da glicose ou de outros açúcares. Nessa família, estão vários gêneros importantes em alimentos como Escherichia, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia, Erwinia, Citrobacter, Enterobacter, Proteus, Klebsiela e outras. São encontradas em solo, água, plantas, frutas, vegetais, carnes, ovos, animais, grãos, insetos e no homem. Muitas são deteriorantes e outras patogênicas. As enterobactérias são utilizadas como indicador de condições de higiene dos processos de fabricação, porque são facilmente destruídas pelos sanificantes (agentes utilizados para higienização). Dessa forma, sua presença indica falhas no processo de higienização, seja de utensílios, ambientes, como também de processamento de alimentos; • Contagem de Coliformes Totais: Coliformes totais são um grupo de bac- térias, que fazem parte das enterobactérias, capazes de fermentar lactose com produção de gás a 35-37ºC, por 48 horas de incubação. Nesse grupo, estão tanto bactérias do trato gastrointestinal de humanos e outros animais de sangue quente como a Escherichia coli (E. coli), como também Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia e outras, encontradas em plantas e solo. Sua presença no alimento não indica contaminação fecal, mas pode ser considerado com condições higiênicas insatisfatórias, evidenciando falhas de processo e de contaminação pós-processo em alimentos pasteurizados, porque são facilmente eliminados por calor; 10 11 • Contagem de Coliformes Termotolerantes e E. coli: São bactérias que con- seguem fermentar lactose com produção de gás, quando incubadas a 44-45ºC. É um grupo de bactérias mais restrito dentro dos coliformes totais. No início, os coliformes termotolerantes eram chamados de coliformes fecais, para indicar contaminação fecal. No entanto, sabemos que os termotolerantes incluem bac- térias de origem não fecal. A pesquisaapenas de E. coli é utilizada também. Ela fornece informações sobre as condições higiênico-sanitárias do produto, já que seu habitat natural é o trato intestinal de animais de sangue quente, mas também pode ser introduzida nos alimentos a partir de fontes de fecais. Apesar de seu uso ser questionado por alguns autores, a legislação adota a análise de E.coli para verificar qualidade de água e alimentos, principalmente, alimentos in natura; • Presença de Enterococos: Essas bactérias estão presentes no trato intestinal como também em ambientes diferentes. Podem ser utilizadas como indicadores de contaminação fecal, apesar de seu uso ser questionado. Indica práticas sani- tárias inadequadas ou exposição do alimento a condições inadequadas. Outros Indicadores: Microrganismos Patogênicos para Verificar o Risco à Saúde das Pessoas • Contagem de Staphylococcus (Estafilococos): Indica perigo à saúde pública por causa da enterotoxina estafilocócica e condição de higienização questionável de manipuladores de alimentos; • Contagem de Salmonella: Importante e muito frequente agente de doenças de origem alimentar. Seu principal habitat é o trato intestinal de humanos e animais e pode contaminar diversos alimentos, atingindo toda a cadeia de pro- dução de alimentos, desde a matéria-prima até os produtos finais; • Contagem de Clostridium: São bactérias termófilas, liberam esporos e toxi- nas que indicam risco à saúde da população; • Contagem de Listeria Monocytogenes: Bactéria patogênica potencialmente letal para o indivíduo, com severo risco para gestantes e indivíduos com o sistema imunológico debilitado. Meios de Cultura para Contagem Microbiana Uma das maneiras de realizar a contagem dos microrganismos é por meio de cultivo em meios de cultura apropriados. Meios de cultura são soluções que contém nutrientes para atender às exigências nutricionais dos microrganismos. Esses meios de cultura podem ser sólidos (quando tem ágar que confere densidade firme), líquidos ou semissólidos (menor quantidade de ágar). 11 UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos Figura 1 Fonte: Getty Images Na figura, observa-se meio de cultura líquido em tubos e meio de cultura sólido em placas de Petri (ao fundo), que são placas apropriadas para esse fim. Os meios de cultura sólidos são utilizados para verificar o crescimento e realizar contagem microbiana. Isso é possível devido à formação de colônias dos microrga- nismos visíveis a olho nu nesses meios. Uma única célula de microrganismo é neces- sária para a formação de uma colônia. A colônia é visível a partir do momento que aquela célula inicial começou a dividir e aumentou o número de células. Dessa forma, quando se tem uma colônia, é porque inicialmente tinha uma célula microbiana, isto é, uma Unidade Formadora de Colônia (UFC). Assim, contando as colônias, sabemos quantos microrganismos tinham na amostra. Figura 2 Fonte: Getty Images Na imagem, observa-se crescimento de várias colônias de microrganismos, em meio de cultura sólido. Cada colônia visível foi formada pelo crescimento de uma célula bacteriana inicial invisível. 12 13 Os meios de cultura semissólidos são utilizados, por exemplo, para verificar a motilidade dos microrganismos, por causa do flagelo. Os meios líquidos servem para verificar crescimento e quantificar microrganismos. O resultado é expresso em Número Mais Provável (NMP) de microrganismos presente na amostra. Existem vários tipos de meios de cultura a serem considerados: meio de enrique- cimento, meio de cultura completo, meio seletivo, meios diferencial, meio de cultura para anaeróbios. Os meios de cultura completos são ricos em nutrientes e permitem o crescimento do maior número possível de microrganismos, muito utilizados para as contagens de microrganismos totais. Os meios de enriquecimento são utilizados em amostras com pequeno número de microrganismos. Os meios de cultura seletivos possuem compostos que inibem um determinado grupo de microrganismos e favorece outro, por exemplo, meios de cultura seletivos para Gram negativas, que favorecem o crescimento das enterobactérias que são Gram-negativas. Temos, também, meios seletivos que favorecem o crescimento apenas de bactérias ou de fungos. Os meios seletivos para fungos têm pH ácido. Meios de cultura diferenciais permitem distin- guir espécies ou gêneros de bactérias pela alteração da cor do meio ou da colônia. Algumas vezes, um meio de cultura pode ser seletivo e diferencial. Figura 3 Fonte: Getty Images Na figura acima, observa-se um meio de cultura diferencial, onde a alteração de cor das colônias e do meio de cultura permite distinguir os microrganismos. Assim, utilizar os meios de cultura adequados é uma das maneiras de fazer a quantificação dos microrganismos indicadores. 13 UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos Métodos para Análise Microbiológica de Água e Alimentos Para realizar uma análise confiável de água e alimentos, devemos ter critérios rigorosos nas etapas de amostragem, preparação da amostra para análise e a escolha dos métodos de contagem/identificação. Para a coleta da amostra, vários cuidados devem ser tomados. Alimentos refrige- rados devem ser mantidos em baixa temperatura até o momento da análise. Produtos prontos, em embalagem fechada, devem ser mantidos na embalagem original. Alimentos que estejam em embalagens abertas devem ser coletados com utensílios esterilizados (conchas, espátulas) e acondicionados adequadamente para evitar con- taminação do ambiente e do manipulador. A coleta de amostras de utensílios de cozinha ou superfícies pode ser feita com o Swab, que são hastes esterilizadas, com algodão na superfície. É necessário delimitar uma área de 10 cm2 ou 1 cm2, passar a haste nesta área, armazenar em tubo e levar para o laboratório para plaqueamento. As figuras abaixo mostram o Swab e o plaqueamento da amostra sendo realizados em meio de cultura. Figura 4 Fonte: Adaptado de Getty Images As amostras devem ser preparadas mantendo o cuidado para evitar contaminação externa de modo a não interferir na contagem microbiana presente no alimento. A porção de amostra a ser analisada é de 25g, 50g ou 100g (mL). Nas amostras sólidas, elas devem ser diluídas e homogeneizadas adequadamente com uma solução própria, esterilizada. Muitas vezes, é necessário fazer diluições da amostra para con- seguirmos contar os microrganismos sem deixar dúvidas nos valores. Vários são os protocolos para seguir uma correta preparação de amostra. Com a amostra preparada, alguns métodos de contagem podem ser utilizados como a contagem por plaqueamento e a técnica do Número Mais Provável (NMP). 14 15 A contagem por plaqueamento é um método convencional, que consiste no plaqueamento de quantidades (alíquotas) conhecidas da amostra líquida (previa- mente diluída em caso de alimentos sólidos), nos meios de cultura selecionados de acordo com o interesse da análise. O plaqueamento pode ocorrer na superfície do meio de cultura (colocado numa placa de Petri), técnica conhecida como Spread Plate ou plaqueamento em superfície, ou a amostra pode ser colocada numa placa de Petri e, depois adicionada o meio de cultura, técnica Pour Plate, de profundidade. Em seguida, as placas devem ficar acondicionadas em estufas com temperatura controlada, normalmente em 36ºC, por 24 horas, para permitir o crescimento dos microrganismos e formação das colônias. A partir daí, realiza-se a contagem das colônias, como mostra a figura, e obtêm-se o resultado expresso em Unidades Formadoras de Colônias (UFC/g ou mL). Figura 5 Fonte: Getty Images A imagem mostra a contagem manual das colônias (UFC), das bactérias que estavam na amostra coletada. Lembrando que, quando se tem uma colônia, é porque inicialmente havia uma célula microbiana, isto é, uma Unidade Formadora de Colônia (UFC). Assim, contando as colônias, sabemos quantos microrganismos tinham na amostra. A contagem por Numero Mais Provável (NMP) é muito utilizadapara estimar a contagem de coliformes totais e Escherichia coli. Nela, as alíquotas das amostras diluídas são adicionadas a uma série de tubos, contendo meio de cultura líquido. Os tubos são incubados em estufa e espera-se o crescimento. A combinação da quantidade de tubos que apresentaram crescimento é verificada e, por meio de uma tabela específica, obtém-se o NMP. Essas técnicas são trabalhosas e demoradas. Existem alguns métodos mais modernos que facilitam o preparo e execução da contagem microbiana. Na videoaula, 15 UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos é apresentada a técnica de plaqueamento em superfície e uma técnica, mais moderna, para estimar o NMP de coliformes totais e E.coli. Outras técnicas de análise de microrganismos que não necessitam de crescimento do microrganismo podem ser utilizadas, no entanto, requerem reagentes e equipa- mentos mais específicos. Análise dos Resultados Considerando que a distribuição dos microrganismos nos alimentos não é igual, quanto maior for o número de unidades de um produto submetido à análise, mais confiável será o resultado. É importante que os resultados sejam confiáveis para evi- tar erros como reprovar um produto aceitável ou aprovar um produto inadequado. Para definir os critérios a serem adotados para aprovar ou reprovar um alimento, é necessário conhecer quais microrganismos devem ser pesquisados, e é a análise desses microrganismos que vai determinar se o produto está ou não adequado no que se refere às condições higiênico-sanitárias e de saúde pública. Para saber quais os microrganismos que deveriam ser estudados num alimento, o ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Food) classificou os microrganismos em categorias diferentes, de acordo com os diferentes graus de risco ao produtor e ao consumidor. Dessa forma, têm-se os microrganismos que indicam: • Alterações no alimento sem serem patogênicos que são os microrganismos, sem risco direto à saúde, como bactérias aeróbias mesófilas e fungos; • As condições higiênico-sanitárias do produto, que indicam a possível pre- sença de outros microrganismos prejudiciais à saúde. Esses microrganismos são os indicadores de contaminação fecal ou da qualidade higiênico-sanitá- ria dos alimentos; • Risco direto à saúde do consumidor como os microrganismos patogênicos de interesse em alimentos. Assim, a aprovação ou rejeição de qualquer produto está na dependência dos resultados da análise e dos critérios microbiológicos adotados. Os critérios microbiológicos são de caráter obrigatório, que são aqueles que não podem ser desobedecidos. O alimento que não estiver de acordo com esse critério deve ser reprovado. Assim, o padrão microbiológico é um critério obrigatório, que faz parte de uma lei ou regulamentação administrativa. O não atendimento ao padrão microbiológico vigente constitui violação da lei. Os critérios microbiológicos podem ser internacionais, federais, estaduais e municipais. Em nível internacional, existe a Comissão do Codex Alimentarius, que é um órgão formado pela FAO (Food and Agricultural Organization) e pela OMS (Organização Mundial da Saúde), ambos da Organização das Nações Unidas (ONU) 16 17 e o ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Food). Em nível federal, cada país tem os critérios que acha necessário. No Brasil, os padrões microbiológicos são definidos pelo Ministério da Saúde e da Agricultura. Os padrões microbiológicos para alimentos, do Ministério da Saúde (ANVISA), vigentes neste momento, são os da Resolução – RDC nº 331, de 23 de dezembro de 2019, que dispõe sobre os padrões microbiológicos de alimentos e sua apli- cação, juntamente da Instrução Normativa nº 60, de 23 de dezembro de 2019, que estabelece as listas de padrões microbiológicos para alimentos prontos para oferta ao consumidor. O microrganismo a ser analisado e seu limite aceitável pode variar conforme o grupo de alimentos. Assim, de acordo com esta RDC, quando se comparam os resultados obtidos nas amostras de alimentos, com os padrões estabelecidos, o alimento pode ser considerado satisfatório com qualidade aceitável; satisfatório com qualidade intermediária; e insatisfatório com qualidade inaceitável. Em casos de resultados insatisfatórios e os resultados satisfatórios com qualidade intermediária, devem ser investigadas possíveis causas para esses resultados e ações corretivas devem ser implementadas. A RDC nº 331 estabelece um plano de amostragem, definindo o número de uni- dades amostrais a serem coletadas, aleatoriamente, de um mesmo lote e analisado individualmente (n), o tamanho da amostra e a indicação do número de unidades amostrais toleradas com qualidade intermediária (c). Exemplificando: Na RDC nº 331, os padrões estabelecidos para Frutas e derivados, preparadas, sanificadas (higienizadas), refrigeradas ou congeladas, são: ausência de Salmonellla/25g de alimento em 10 unidades amostrais (n); e permite 10 UFC/g de Escherichia coli, em duas unidades amostrais (c), de um total de 5 unidades amostrais analisadas (n). Resultados obtidos fora desse padrão indicam que ações corretivas devem ser realizadas. Os padrões microbiológicos para água, do Ministério da Saúde, estão na Portaria nº 2.914, de 12 de dezembro de 2011, que dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. De acordo com essa portaria, em água de consumo humano, o parâmetro Escherichia coli, utilizado como indicador de contaminação fecal, deve ter valor máximo permitido (VMP) ausência em 100 mL de água. Estipula, ainda, no Artigo 28 - § 3º, alterações bruscas ou acima do usual na contagem de bacté- rias heterotróficas (aeróbias mesófilas) devem ser investigadas para identificação de irregularidade e providências devem ser adotadas para o restabelecimento da integridade do sistema de distribuição (reservatório e rede), recomendando-se que não se ultrapasse o limite de 500 UFC/mL. 17 UNIDADE Análise Microbiológica de Alimentos Material Complementar Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade: Leitura Análise Microbiológica de Alimentos: Importância do Plano de Amostragem https://bit.ly/3bti9Px Resolução – RDC nº 331, de 23 de dezembro de 2019 Dispõe sobre os padrões microbiológicos de alimentos e sua aplicação. https://bit.ly/3cwxY9n Instrução Normativa nº 60, de 23 de dezembro de 2019 Estabelece as listas de padrões microbiológicos para alimentos prontos para oferta ao consumidor. https://bit.ly/2WuCO1a Avaliação da Presença de Microrganismos Indicadores Higiênico-Sanitários em Alimentos Servidos em Escolas Públicas de Porto Alegre, Brasil https://bit.ly/3dzyaVA Análise Microbiológica de Esponjas de Uso Doméstico na Cidade de Teresina, PI https://bit.ly/2WWiUeR 18 19 Referências SILVA, N. Manual de métodos de análises microbiológicas de alimentos e água. 5. ed. São Paulo: Blucher, 2017. (e-book) TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017. (e-book) FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. (e-book) 19 Microbiologia de Alimentos Responsável pelo Conteúdo: Prof.ª Dr.ª Elisa Mara Prioli Ciapina Rochedo Revisão Textual: Prof.ª Dr.ª Luciene Oliveira da Costa Granadeiro Importância dos Microrganismos nos Alimentos Importância dos Microrganismos nos Alimentos • Entender o papel dos microrganismos nos alimentos como agentes de deterioração microbiana; • Conhecer os microrganismos patogênicos, que representam riscos à saúde, relacionados às Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA); • Conhecer os benefícios dos microrganismos relacionados ao alimento. OBJETIVOS DE APRENDIZADO • Introdução; • Importância dos Microrganismos nos Alimentos; • Alterações Químicas Indesejáveis dos Alimentos Provocadas por Microrganismos (Biodeterioração ou Deterioração Microbiana);• Doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs): Agentes Biológicos e Doenças Relacionadas; • Benefícios dos Microrganismos. UNIDADE Importância dos Microrganismos nos Alimentos Introdução Agora que você já tem uma visão geral dos microrganismos, como crescem e como podem ser controlados, vamos enfatizar a importância deles na área de alimentos. Justamente por entenderem que os microrganismos podem estar presentes em dife- rentes ambientes, é necessário estudar como eles podem interagir com os alimentos. Essa interação pode ser indesejável ou benéfica. Quando pensamos em processos de deterioração microbiana dos alimentos, as alterações químicas provocadas podem levar à total inutilização do alimento. Além disso, eles podem ser veículos de transmissão de microrganismos e/ou suas toxinas, levando às infecções e intoxicações alimentares. Você já se perguntou o porquê de um alimento se deteriorar mais rapidamente que o outro? Qual a diferença entre infecção e intoxicação alimentar? O que causam as doenças transmitidas por alimentos, as DTA? Mas, com tantas coisas ruins, os microrganismos podem mesmo trazer benefí- cios? A resposta é: sim! Muito nos beneficiamos com os produtos derivados do meta- bolismo de bactérias e fungos, basta entender e conseguir as modificações desejáveis dos alimentos, como o caso de queijos, bebidas e pães. Nesta unidade, vamos abordar esses assuntos, de modo que fique mais evidente a necessidade de aprender a conviver com os microrganismos. Importância dos Microrganismos nos Alimentos Quando pensamos em microrganismos e alimentos, é necessário analisar como essa interação pode ocorrer. Os microrganismos apresentam papéis de extrema importância nos alimentos no que diz respeito às alterações químicas indesejáveis dos alimentos, provocadas por microrganismos, que levam à deterio- ração; doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs) e uso de microrganismos na fabricação de alimentos. Alterações Químicas Indesejáveis dos Alimentos Provocadas por Microrganismos (Biodeterioração ou Deterioração Microbiana) Os alimentos podem sofrer alterações químicas indesejáveis com o crescimento dos microrganismos, como mudança de cor, sabor, odor e textura. Esse processo recebe o nome de deterioração microbiana ou biodeterioração. 8 9 De acordo com os fatores intrínsecos dos alimentos, visto em outra unidade, os alimentos podem ser mais suscetíveis ou resistentes à deterioração, interferindo na sua vida útil. A vida útil (ou tempo de prateleira) de um alimento é o tempo que compreende o tempo entre produção e consumo do produto, sem perder suas características e qualidade. Por exemplo: alimentos como ovo, carnes frescas, aves e pescado frescos, frutas frescas e vegetais têm Aa > 0,95, assim, esses produtos serão degradados por uma série de microrganismos, tanto bactérias como fungos. Já alimentos como frutas se- cas, que têm Aa entre 0,51 e 0,89, são menos suscetíveis à deterioração e, quando degradadas, o predomínio será dos fungos que são menos exigentes em relação à Aa. Dessa forma, as frutas secas têm uma vida útil maior que as frutas frescas. Bac- térias deteriorantes precisam de, no mínimo, atividade de água de 0,9 e fungos já podem crescer a partir de Aa 0,6. Em relação ao pH, alimentos muito ácidos (pH<4) ou ácidos (pH entre 4 e 4,5) como limão, laranja, uva, azeitona têm menor condição para proliferação de microrganismos, restringindo ao crescimento de fungos e pou- quíssimas bactérias. Além dos fatores intrínsecos, fatores extrínsecos interferem na vida útil de um alimento. Enquanto os fatores intrínsecos estão relacionados às características dos pró- prios alimentos, os fatores extrínsecos dizem respeito às condições onde os alimen- tos são mantidos. Os fatores extrínsecos, como temperatura ambiental, umidade relativa do ambiente, composição gasosa do ambiente interferem no crescimento e controle dos microrganismos. Como já visto, os microrganismos apresentam uma temperatura ótima de cresci- mento – manter um alimento a uma determinada temperatura ambiente vai acelerar ou reduzir o crescimento microbiano. Importante! Relembrar a classificação dos microrganismos em relação à temperatura – psícrofilos, psicrotróficos, mesófilos, termófilos. Em relação à umidade relativa do ambiente, existe uma correlação entre a ativi- dade de água (Aa) de um alimento e a umidade relativa do ambiente (UR). Alimentos conservados em ambientes com UR superior a sua Aa tendem a absorver umidade, o que acarretará num aumento da sua atividade de água. Já os alimentos mantidos em umidade relativa menor que sua Aa tenderão a perder água, reduzindo sua Aa. Dessa forma, os alimentos devem ser estocados em locais adequados para não ocorrerem variações que acarretem deterioração dos alimentos de forma mais acelerada. 9 UNIDADE Importância dos Microrganismos nos Alimentos No que diz respeito à composição gasosa do ambiente que está o alimento, os microrganismos aeróbios, anaeróbios, os microaerófilos e os facultativos terão seu crescimento alterado de acordo com a atmosfera imposta. Atmosferas modificadas, onde o oxigênio é total ou parcialmente substituído, são empregadas para conter a proliferação dos microrganismos. As embalagens a vácuo e embalagens com diferen- tes combinações de oxigênio, nitrogênio e gás carbônico são utilizadas como recurso para aumentar a vida útil do alimento. Quando falamos em deterioração microbiana dos alimentos, temos que lembrar que os microrganismos estão utilizando o alimento como nutrientes para eles cres- cerem. Vamos ver, portanto, como ocorre a degradação dos diferentes componentes químicos presentes nos alimentos. Os carboidratos são importantes para a obtenção de energia pelos microrganismos. O metabolismo pode ser na presença de oxigênio – metabolismo oxidativo – e há predo- minância de microrganismos aeróbios e anaeróbios facultativos, gerando gás carbônico (CO2) e água (H2O) e sem acumular subprodutos (produtos intermediários do metabolis- mo). Na ausência de oxigênio, ocorre o metabolismo fermentativo (fermentação) e as bac- térias anaeróbias estritas e facultativas acumulam produtos intermediários ou finais que afetam as características dos alimentos como álcool, ácido lático, ácido acético e outros. A fermentação é definida como um processo que libera energia a partir de açúcares ou ami- noácidos e outras; não requer oxigênio (mas pode ocorrer na sua presença); utiliza uma molécula orgânica como aceptor final de elétrons como o piruvato e acetaldeído (moléculas do metabolismo microbiano) e, assim, não usa o oxigênio como aceptor final de elétrons no metabolismo; gera produtos como etanol e ácido lático. Quando se trata de consumir açúcares simples (monossacarídeos), os micror- ganismos podem realizar diferentes tipos de fermentação e essas fermentações podem ser classificadas de acordo com o produto final originado. • Fermentação lática: há produção de ácido lático e é realizada pelas bactérias do grupo lático ou bactérias láticas. Como exemplo, temos as bactérias dos gêneros Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, entre outras. Aqui, o piruvato (sinte- tizado na glicólise) é convertido a ácido lático pelo metabolismo dessas bactérias (consome moléculas de energia – ATP e coenzimas NAD+), conforme mostra a figura a seguir. Gl icó lis e Glicose Piruvato ADP NAD+2 NAD+2 2 NADH 2 NADH ATPNET 2 2 Ácido lático Re ge ne ra çã o de N AD + Figura 1 – Fermentação lática 10 11 Quando há predominância de produção de ácido lático, diz-se que a fermentação é homolática. Você Sabia? Nomenclatura científica: os nomes científicos têm origem latina e são utilizados em to- dos por cientistas em todo o mundo, independente da sua língua nativa. Para cada orga- nismo, são atribuídos dois nomes (binômio). Esses correspondem ao gênero e à espécie. Devem ser escritos sublinhados ou em itálico. O primeiro nome (do gênero) começa com a letra maiúscula e a espéciecom letra minúscula, como exemplo, tem-se: bactéria da espécie Escherichia coli. Como esse sistema atribui dois nomes para cada organismo, é chamado de nomenclatura binominal. Existe uma hierarquia taxonômica, onde os or- ganismos são agrupados de acordo com as características relacionadas. Assim temos que um grupo de espécies relacionadas forma um gênero. Gêneros relacionados formam uma família. Um grupo de famílias similares forma uma ordem e um grupo de ordens similares forma uma classe. Classes formam filos, que, por sua vez, formam reinos, que são agrupados em domínios. Os organismos podem ser referidos pelo gênero e também deve ser escrito em itálico. • Fermentação alcoólica: há predomínio da produção de etanol. Realizada prin- cipalmente por leveduras e bactérias do gênero Zymomonas. Aqui, o piruvato é convertido a CO2 e acetaldeído e, posteriormente, o etanol. Quando há for- mação de produtos como diacetil, etanol e CO2 em proporções semelhantes, diz-se que é uma fermentação heterolática. A deterioração de sucos de frutas pode ocorrer assim, e o sabor de “maçã podre” é devido à presença de baixa concentração de acetaldeído e sulfeto de hidrogênio produzidos. A capacidade dos microrganismos de realizarem essas fermentações está relacio- nada com a presença de enzimas específicas. • Fermentação ácida mista ou fórmica: os produtos oriundos dessa fermentação são ácido lático, ácido succínico, ácido acético e ácido fórmico. Altera o pH dos alimentos a valores menores que pH 6. As principais bactérias fermentadoras são da família Enterobacteriaceae, como Salmonella, Escherichia, Proteus e Shigella; • Fermentação butírica: ocorre formação de ácido butírico, ácido acético, CO2, acetona, isopropanol e n-butanol. Realizada por bactérias anaeróbias como Clostridium. São responsáveis pela deterioração de alimentos enlatados ou en- vasados, termoprocessados e estufamento da lata; • Fermentação butanodióica: similar à fermentação mista, mas com menor pro- dução de ácidos. Microrganismos como Bacillus e Serratia são importantes representantes que fazem esse tipo de fermentação e estão envolvidos na dete- rioração de ervilhas, aspargos, pêssegos e tomates enlatados. As fermentações citadas ocorrem pela utilização de açúcares simples como a glicose. Mas os polissacarídeos (macromoléculas de carboidratos) podem também ser utilizados, apesar de poucos microrganismos serem capazes de degradar os polissacarídeos. 11 UNIDADE Importância dos Microrganismos nos Alimentos Destaca-se a degradação do: • Amido: reserva energética da célula vegetal que pode ser utilizado por bactérias e bolores que produzem a enzima amilase; • Celulose: presente na parede das células vegetais degradada por poucas bacté- rias celulolíticas que produzem enzima celulase, mas por muitos bolores. Figura 2 – Na figura, é possível ver o micélio branco/verde do bolor crescendo no tomate Fonte: Getty Images Pectinas encontradas ligadas à parede da célula vegetal e espaços intercelulares dos tecidos vegetais. Sua degradação ocorre por microrganismos pectinolíticos, que produzem enzimas como pectinesterase, levando à deterioração chamada “podri- drão mole”. Figura 3 – Nota-se a alteração na textura e cor das frutas Fonte: Getty Images Em relação à degradação das proteínas, elas são macromoléculas formadas pela união de monômeros de aminoácidos. Os aminoácidos (que tem grupo nitrogenado na sua composição) são unidos por meio de ligações peptídicas formando os peptí- deos e posteriormente, formam as macromoléculas de proteínas. As ligações pep- tídicas podem ser degradadas por meio de enzimas. Assim, uma proteína pode ser degradada até peptídeo por meio da enzima proteinase, e o peptídeo pode ser de- gradado até aminoácido por meio da enzima peptidase. Os microrganismos utilizam 12 13 as moléculas menores, e não as proteínas intactas, pois estas não podem atravessar a membrana plasmática dos microrganismos. A ruptura da proteína provoca amolecimento dos tecidos e alteração no aroma. A putrefação é um tipo de deterioração microbiana facilmente detectável, onde ocorre formação de substâncias como mercaptanas que tem odor pútrido. Pode ocorrer o processo de descarboxilação do aminoácido, onde o grupo carboxila é removido. Assim, geram-se grupos aminas voláteis que podem ser utilizadas como parâmetro de controle em pescados. A deterioração de pescado também é detectada pela formação de ácido fórmico, acético, butírico e outros. Na deterioração de proteínas, ocorre a produção de Sulfeto de Hidrogênio (H2S). Essa substância confere o odor de “ovo podre” nos alimentos deteriorados e é produzida a partir de aminoácidos contendo enxofre como a cisteína ou metionina. Uma alteração observada na deterioração das proteínas é o aumento do pH, que serve como indicador de degradação e monitoramento do produto. Importante! Na degradação de carboidratos, nota-se diminuição do pH e na deterioração de proteí- nas, há elevação de pH. Já a degradação de lipídeos é mais limitada. Os triglicerídeos são os principais lipídeos encontrados em alimentos. A presença de água irá determinar a ocorrência da degradação como em alimentos gordurosos, onde a presença de água permite o crescimento microbiano, como creme de leite, manteiga e margarina. As gorduras e óleos puros não são atacados por microrganismos devido à ausência de água. A rancificação é a deterioração da gordura. Esse processo pode ter participação microbiana (microrganismos lipolíticos), como também pode ser um processo que não depende dos microrganismos. Os microrganismos como as bactérias Pseudomonas fragi, Staphylococcus aureus, bolores como Aspergillus flavus, Penicillium roqueforti e leveduras como Cândida lipolytica, produzem lipases que quebram os lipídeos, liberando os ácidos graxos que os formam. Alterações na viscosidade do alimento podem ser observadas nos processo de degradação (decomposição) do alimento. Alguns microrganismos produzem polissa- carídeos durante seu crescimento. Essas substâncias alteram o alimento promovendo a formação de limo superficial em alimentos sólidos (limosidade) e aumento da visco- sidade dos alimentos líquidos. Bactérias como Leuconostoc mesenteroides, Bacillus subtilis e Escherichia coli são exemplos de microrganismos que utilizam sacarose e maltose para a produção de açúcares mais complexos como as dextranas. Leites e sucos concentrados podem ter sua viscosidade aumentada por causa do crescimento dessas bactérias. Outra alteração muito comum é da cor do alimento. Muitas bactérias produzem pigmentos. Esses pigmentos podem ser hidrossolúveis, difundindo-se no alimento, sendo visualizados não apenas onde tem o crescimento do microrganismo. Já os pigmentos lipossolúveis são visíveis onde há o crescimento microbiano. Bactérias, 13 UNIDADE Importância dos Microrganismos nos Alimentos como a Serratia, liberam um pigmento variando de róseo a vermelho. Bactérias Flavobacterium liberam pigmentos amarelados e laranja. Chromobacterium liberam substância de cor violeta. As Pseudomonas produzem pigmentos variados sendo alguns fluorescentes de coloração amarelo-esverdeada quando sob luz ultravioleta. Importante! Leveduras têm preferência por degradar carboidratos e lipídeos. Sua ação sobre proteínas é quase inexistente. Dessa forma, os vegetais, ricos em carboidratos, são habitat desses microrganismos. Podem crescer na superfície de líquidos de alimentos ácidos como picles, sucos envasados em jarras de vidro e em tanques de fermentação. Seu metabolismo pode elevar o pH do produto favorecendo o crescimento de outros microrganismos. A levedura Zigosaccharomyces bailii é osmófila, crescendo em meio com até 70% de glicose. Os bolores são, em sua maioria, aeróbios e degradam polissacarídeos (amido e pectina). Os bolores, quando crescem formam o micélio, tornam o produto inaceitável, pois é visível. Nessa fase, o alimento já pode estar todo ocupado, no seu interior, pelas hifas (filamentos).Os “bolores de armazenamento” provocam deterioração de grãos ou cereais armazenados como os Aspergillus e Penicillium. Algumas espécies produzem toxinas (micotoxinas). Frutas, cereais e hortaliças são deterioradas por bolores. Alguns bolores são psicrotrófilos, deteriorando alimentos refrigerados. No quadro, estão relatados alguns exemplos deterioração microbiana por grupos de alimentos. Vale lembrar que os alimentos estão mais suscetíveis à degradação quando os fatores intrínsecos e extrínsecos são mais propícios para o crescimento microbiano. Tabela 1 Grupo de Alimentos Alterações/ Microrganismos Leites e derivados Contaminação pode ocorrer durante a ordenha, no transporte, processamento e armazenamento, alternado sabor e odor: ácidos (fermentação lática e butírica); amargo (degradação de proteínas); ranço (degradação da gordura). Alteração de cor azul (Pseudomonas syncyanea); amarela (Pseudomonas syncyanea e Flavobacterium); vermelha (Serratia marcescens e Micrococcus roseus). A viscosidade ocorre no leite, creme ou soro do leite; as bactérias liberam polissacarídeo (material da cápsula) que é viscoso, mesmo em baixas temperaturas (Enterobacter spp; Lactococcus lactis; Lactobacillus spp). Produção de gás formado no processo de fermentação (bactérias do grupo coliformes, Clostridium spp; Bacillus). Carnes e derivados Alimento que propicia crescimento de muitos microrganismos por ter alta Aa, nutrientes e pH favorece crescimento. Limosidade superficial provacada por Pseudomonas, Micrococos, leveduras, bolores (depende da Aa). Mudança de cor: verde, marro ou cinza por causa de sulfeto de hidrogênio produzido por bactérias (Lactobacillus viridescens, Enterococcus faecalis, Leuconostoc, Pseudomonas spp); vermelha (Serratia marcescens); branco ou creme (leveduras); pontos brancos e verdes (bolores). Rancificação: microrganismos lipolíticos (Pseudomonas, Bacillus, leveduras e bolores). Odor e sabor: acidificação, fermentação lática, putrefação (bactérias do grupo coliformes e Clostridium spp). Frangos Deteriorado principalmente por bactérias do conteúdo intestinal, com aparecimento de limosidade na superfície, odores. (Pseudomonas e leveduras). Pescado Condições de Aa, pH próximo à neutralidade, nutrientes propícias para crescimento de mi- crorganismos com deterioração mais rápida que outros produtos cárneos. Crescimento de muitos microrganismos psicrotrófilos devido ao habitat (temperatura da água é mais baixa). As principais bactérias deteriorantes fazem parte da microbiota natural do pescado (Pseudo- monas e Shewanella). Produção de amônia, etanol, acetona, metanol, acetaldeído e sulfeto de hidrogênio e outros. 14 15 Grupo de Alimentos Alterações/ Microrganismos Ovos Interior do ovo estéril, mas casca pode ser contaminada por material fecal da ave, gaiola ou ninho, água de lavagem, manipulação ou embalagem. Casca e cutícula retardam entrada no microrganismo. Clara tem pH alto que limita crescimento. Na gema, ocorre degradação com participação mais de bactérias levando à alteração de cor e odor: pontos verdes (Pseudomo- nas fluorescens), pontos coloridos (Pseudomonas, Acinetobacter), pontos pretos (Proteus spp); produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) que causa odor e pressão interna pela produção do gás (esse gás é formado pela grande quantidade de enxofre no ovo). A gema tende a perder sua película e formato característico. Pode ocorrer contaminação por bolores. Figura 4 Fonte: Getty Images Alimentos enlatados ou envasados Ocorre contaminação quando tem contaminação do alimento por falhas na costura da lata, deterioração pré-tratamento, subprocessamento (tratamento térmico inadequado). Bactérias anaeróbias e anaeróbias facultativas, além das microaerófilas.(espécies de Clostridium, espécies de Bacillus, Lactobacillus). Bolores e leveduras participam. Estufamento da lata por degradação microbiana ou não. Produtos de origem vegetal Ocorre a podridão mole pela degradação da pectina, principalmente pela bactéria Erwinia carotovora, Pseudomonas, Clostridium e Bacillus. Provoca sabor desagradável e odor desa- gradáveis e aparência úmida. Degradação acentuada por fungos causa amolecimento do vegetal, áreas marrons ou cor creme. Os danos causados nas películas e cascas favorecem a entrada dos microrganismos. O contato direto com o solo, rico em microrganismos, aumenta a carga microbiana dos ali- mentos e pequenas fissuras podem levar à deterioração mais rápida do alimento. A colhei- ta, o manuseio e a estocagem devem ser adequados para evitar perdas pela deterioração. Sucos de fruta e vegetais O pH varia de 2,4 para o limão e 4,2 para o de tomate. Desenvolve leveduras e bolores, mas bactérias acidófilas podem estar presentes. Ocorre fermentação alcoólica por leveduras formadoras de uma película na superfície e bolores. Ocorre fermentação lática por espé- cies de Lactobacillus e alteração da viscosidade por Leuconostoc e Lactobacillus. Cereais e farinhas Microbiota do solo pode estar presente. Bacillus e bolores são os principais deteriorantes e podem crescem dependendo da condição de umidade. Açúcares e doces Raramente sofrem deterioração, mas podem ser contaminados por Bacillus, Clostridium, Leuconostoc e bolores na presença de água. A figura mostra o crescimento de bolores em geleia que, apesar da grande quantidade de açúcar, tem Aa que favorece crescimento de bolores. Figura 5 Fonte: Getty Images Condimentos e nozes Mais difícil de sofrer deterioração pela baixa Aa e alto teor de gordura nas nozes. Podem aparecer bolores e deve-se ter cuidado com armazenamento por causa da umidade rela- tiva do ar que altera a Aa, favorecendo o crescimento de bolores e produção de toxinas. 15 UNIDADE Importância dos Microrganismos nos Alimentos Doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs): Agentes Biológicos e Doenças Relacionadas Hoje em dia, são cada vez mais frequentes refeições realizadas fora de casa e com- pra de alimentos em porções menores, fatiados, minimamente processados, pronto para consumo. O armazenamento e manuseio inadequados, a falta de higienização correta são motivos de grande preocupação, uma vez que colocam em risco à saúde. A segurança alimentar deve ser uma das principais preocupações dos estabelecimen- tos que comercializam alimentos. Dessa forma, outro aspecto de importante na área de microbiologia de alimen- tos, é o estudo sobre Doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs) e sua relação com os microrganismos. Existem mais de 250 tipos de DTA e elas podem ser causadas por produtos quí- micos (como metais pesados e pesticidas); por toxinas naturais de plantas, mas, tam- bém, podem ocorrer por causa de microrganismos patogênicos como bactérias, fun- gos, vírus e parasitas. Vários surtos de DTAs foram relatados no Brasil e no mundo. Microrganismos patogênicos são aqueles que causam doenças, os quais promo- vem modificações no funcionamento das células, acarretando sintomas clínicos de- sagradáveis e podem levar à morte. Microrganismos deteriorantes prejudicam o alimento, e microrganismos patogênicos preju- dica a saúde do consumidor. Um microrganismo pode ser deteriorante e patogênico. A contaminação microbiana dos alimentos pode ocorrer de diversas maneiras, conforme relatado em outra unidade. Mas cabe aqui ressaltar que muitas DTAs são provocadas por manipulação inadequada que transfere os microrganismos da micro- biota normal do corpo até o alimento. Outras doenças estão relacionadas com o con- tato do alimento com a água contaminada. Assim, algumas doenças transmitidas por alimentos de origem microbiana têm relação com doenças transmitidas pela água. As doenças microbianas de origem alimentar podem ser subdivididas em: • Infecções alimentares: quando ocorre a ingestão de alimentos com os micror- ganismos patogênicos, e estes se aderem, proliferam e colonizam o intestino. Podem invadir e penetrar no tecido gastrointestinal (microrganismos invasivos), como podem, também, produzir toxinas, que alteram o funcionamentoda célu- la. Exemplos: Salmonella, Vibrio cholerae, Escherichia coli e outras; • Intoxicações alimentares: quando ocorre a ingestão dos alimentos com as toxinas produzidas pelos microrganismos. Assim, bactérias como Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus forma emética e fungos produtores de micotoxinas, são responsáveis por intoxicações alimentares por liberarem suas toxinas nos alimentos. 16 17 Importante! Prestem atenção na diferença entre infecção e intoxicação alimentar. Infecção alimen- tar quando você consome o alimento com o microrganismo patogênico. Intoxicação é quando você ingere o alimento com a toxina produzida pelo microrganismo. Importante lembrar os nomes dos microrganismos patogênicos! A seguir, estão listados alguns microrganismos patogênicos importantes em alimentos: • Bactérias Gram-positivas: » Clostridium botulinum; » Clostridium perfringens; » Bacillus cereus; » Staphylococcus aureus; » Listeria monocytogenes. • Bactérias Gram-negativas: » Escherichia coli patogênica: » E. coli enteropatogênica clássica (EPEC); » E.coli enteroinvasora (EIPEC); » E.coli enterotoxigênica (ETEC); » E. coli enterro-hemorrágica (EHEC). » Salmonella; » Vibrio cholerae; » Campylobacter sp; » Shigella; » Yersinia enterocolitica » Aeromonas hydrophilla. • Fungos produtores de micotoxinas: » Aspergillus spp; » Penicillium spp; » Fusarium spp; » Claviceps spp; » Aspergillus spp. • Vírus: » Hepatite A; » Poliomielite; » Rotavírus; » Vírus Norwalk (Norovírus). 17 UNIDADE Importância dos Microrganismos nos Alimentos Segundo o Ministério da Saúde, os principais agentes envolvidos em surtos de DTA no Brasil, nos últimos anos, foram as bactérias Salmonella spp., Escherichia coli e Staphylococcus aureus, além de Norovírus. Nesta unidade, serão descritos alguns exemplos de doenças de origem alimentar causadas por microrganismos patogênicos. No entanto, é importante consultar o material complementar para detalhes dessas e das outras doenças provocadas pe- los microrganismos. Intoxicação Alimentar por Bactérias Doença/microrganismo: Botulismo/Bactéria: Clostridium botulinium É uma intoxicação causada pela ingestão de toxinas pré-formadas nos alimentos. O período de incubação até aparecerem os sintomas pode ser de 12 a 36 horas, dependendo da quantidade de toxina ingerida. Pode causar problemas gastrintesti- nais como náuseas, vômitos e diarreia, mas esses não são os efeitos da neurotoxina. A neurotoxina provoca fadiga e fraqueza muscular, problemas de visão, paralisia da musculatura que controla a respiração, levando à morte em três a cinco dias por parada respiratória. Trata-se de bacilos Gram-positivos; possuem flagelo; formam esporos; anaeróbios estritos; PRODUTORES DE TOXINAS (neurotoxinas – toxinas que atuam no neurô- nio). Crescem em temperaturas de 3,5ºC até 50ºC; pH de 4,6 até 9. Encontram-se amplamente distribuído na natureza, como o solo e sedimentos aquáticos. Por serem anaeróbios, podem se manter em alimentos enlatados. Controle Evitar germinação dos esporos e proliferação das células para impedir a produção da neurotoxina. Conservantes químicos são utilizados em carnes para o controle do botulismo. Tratamento térmico elevado é necessário para a destruição dos endóspo- ros. As neurotoxinas são termolábeis, sendo destruída à temperatura de 80ºC por 30 minutos, ou a 100ºC por poucos minutos. Doença/microrganismo: Síndrome diarreica e Síndrome emética/Bactéria: Bacillus cereus • Síndrome diarreica: causada pela toxina diarreica, provocando gastroenterite. Período de incubação de 8 a 16 horas, causa diarreia intensa, dores abdominais. Alimentos envolvidos são vegetais crus e cozidos, pescado, massas, sorvete, leite, carnes e outros. A toxina diarreica é uma enterotoxina (atua nas células intesti- nais), termolábil (sensível ao calor) que pode ser destruída a 55ºC por 20 minutos; • Síndrome emética: ocasionada pela toxina emética que provoca vômitos. Perí- odo de incubação curto de 1 a 5 horas, causando vômitos, náuseas e mal-estar geral, com diarreia durante 6 a 24 horas. Está associada a alimentos farináceos, contendo cereais como arroz. Aquecimento é insuficiente para destruir os es- poros. A toxina é termorresistente em temperaturas de 126ºC por 90 minutos. 18 19 A bactéria é um bacilo Gram-positivo, aeróbio, mesófilo, com flagelos, produtor de esporos. Multiplicam-se entre 10ºC a 48ºC; pH entre 4,9 a 9,3; Aa 0,95. Pro- dutores de toxinas. Encontrado, principalmente em solo, contaminando facilmente vegetais, cereais como o arroz, superfície de carnes e pode ser encontrado no leite. Controle Consumir os alimentos recém-preparados não oferece risco, pois, para a produção da toxina, é necessária elevada carga microbiana (107 e 109 células). Tratamento térmico como vapor sob pressão, fritura e assar em forno quente destroem as formas vegetativas e esporos. Cozimento abaixo de 100ºC pode não destruir esporos. Doença/microrganismo: Intoxicação alimentar pela enterotoxina estafilocócica/Bactéria: Staphylococcus aureus Período de incubação para aparecimento dos sintomas varia de 30 minutos a 8 horas após a ingestão do alimento contaminado. Sintomas são náuseas, vômitos, câimbras abdominais, diarreia e sudorese, calafrios, queda de pressão, dores de ca- beça e raríssimas vezes, febre. Esses sintomas dependem da quantidade da toxina ingerida e suscetibilidade do indivíduo. Essa toxina é termorresistente, não sendo eliminada no processo de pasteurização. Essas bactérias são cocos gram-positivos (estafilococos); anaeróbias facultativas; mesófilas e temperatura para produção da toxina entre 10ºC e 46ºC. A enterotoxina aparece entre 4 a 6 horas. O valor de pH varia entre 4 a 9,8, e atividade de água de 0,86. São as únicas bactérias que crescem nesta Aa. Os homens e animais são os principais reservatórios, sendo que a cavidade nasal é o principal habitat. A partir daí, contaminam água, leite, superfícies. Os manipuladores de alimentos que apre- sentem mãos e braços com feridas são importantes fontes de contaminação. Os ani- mais como o gado pode ser fonte de contaminação, principalmente quando a vaca está com mastite. Caso o leite seja contaminado, poderá ocorrer intoxicação. Leite, cremes, tortas recheadas com creme, atum, frango, presunto, podem ter essa toxina. Controle O aquecimento é importante e manter os alimentos sob-refrigeração. Sabe-se que para a produção da toxina, é necessária uma carga microbiana elevada, o que é inibida sob-refrigeração. Mas é importante a higienização correta das mãos dos manipuladores para evitar alta carga microbiana no alimento já preparado. Intoxicação alimentar por toxinas fúngicas (micotoxinas) Além da deterioração, os bolores podem produzir toxinas quando se multiplicam – as micotoxinas. Quando ingeridas com os alimentos, causam alterações prejudi- ciais em homens e animais causando a micotoxicoses. Mais de 100 toxinas podem ser produzidas por bolores e um único bolor pode produzir mais de uma micotoxina. Dessa forma, é importante descartar os alimentos que apresentam bolores, pois não dá para saber se liberaram toxinas ou não! 19 UNIDADE Importância dos Microrganismos nos Alimentos As aflatoxinas são as micotoxinas mais estudadas. São produzidas pelo fungo Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, em temperaturas de 23ºC a 26ºC. Encontradas em amendoim, castanhas, semente de algodão, milho e outros cereais. Figura 6 – A Figura mostra milho contaminado com Aspergillus spp Fonte: Getty Images Pequena quantidade é suficiente para causar danos hepáticos e hemorragias no trato gastrointestinal. Essas toxinas não são inativadas por calor, e amendoins torrados podem conter essa toxina. O emprego de sulfitos pode inativar essas toxinas. Além da aflatoxina, fungos do gênero Aspergillus podem produzir ocra- toxinas e esterigmatocistina. Bolores do gênero Penicillium podem produzir diferentes toxinas como rubratoxina (milho), patulina(encontrada em sucos de frutas), citrinina e citreoviridina são encontra- dos em alimentos fermentados. Essas toxinas afetam os rins e provocam hemorragias. Figura 7 – Na imagem, é possível ver colônias dos fungos Penicillium spp (colônia verde à esquerda) e Aspergillus spp (colônia mais clara à direita) Fonte: Getty Images 20 21 Infecção alimentar por bactérias (alguns exemplos) Doença/microrganismo: Febre tifoide (Salmonella typhi), Febres entéricas (Salmonella paratyphi) , enterocolites (demais salmonelas) A febre tifoide causa sintomas mais graves como diarreia, vômito, febre alta e septicemia (multiplicação no sangue). A febre entérica e demais salmoneloses mani- festam-se com sintomas um pouco mais leves de vômito, diarreia, febre e dores abdo- minais. Salmonella é um dos microrganismos mais frequente nas doenças e surtos, e pode ser transmitida por alimentos e água. Inclusive, é um microrganismo que deve ser monitorado e está na legislação como parâmetro de controle microbiológico de água e alimentos. A Salmonella é um bacilo Gram-negativo, não possui esporo, anaeróbia faculta- tiva e a maioria é tem flagelo. O pH ótimo é em torno de 7 e temperatura de 35 a 37 ºC. Estão distribuídas em diversos ambientes, sendo o trato intestinal do homem e de animais o principal reservatório. As aves tem papel fundamental de disseminação desta bactéria, pois são assintomáticas e liberam a bactéria nas fezes. Dependendo da espécie, a Salmonella coloniza o canal ovopositor das aves e contamina a gema, antes de formar a casca. Muito importante o controle dessa bactéria entre as aves. A salmonelose está envolvida no consumo de carnes de aves e outros produtos cárneos, além de ovo, leite cru ou pasteurizado de forma incorreta. Comida à base de ovo, saladas, sorvete, cremes podem ter a bactéria. Controle é feito por altas temperaturas. Lembre-se de cozinhar bem os ovos antes de ingerir! Doença/microrganismo: Cólera (Vibrio cholerae) Cólera é uma doença que acomete diversos países com vários relatos de pande- mia. A bactéria entra no organismo via oral, resiste à acidez do estômago e chega ao intestino delgado. Nesse local, produz e libera uma toxina – a toxina colérica. Essa toxina altera o fluxo de íons nas células intestinais e no transporte de água, ocasio- nando diarreia moderada a intensa. Nos casos mais graves, pode haver a perda de 1 litro de fezes por hora, levando à rápida desidratação que pode ocasionar a morte do indivíduo. Importante! Alguns autores descrevem o conceito de toxinfecção alimentar, que são doenças que resultam da ingestão de microrganismos no alimento e, quando estão no organismo da pessoa, esses microrganismos liberam a toxina. É o caso do cólera, causado pelo Vibrio cholerae! Assim, podemos ter: a infecção alimentar (ingestão dos microrganismos pa- togênicos), a intoxicação alimentar (ingestão das toxinas nos alimentos – não precisa ingerir o microrganismo) e, em alguns casos, a toxinfecção (ingestão do microrganismo patogênico que libera toxina dentro do corpo da pessoa). 21 UNIDADE Importância dos Microrganismos nos Alimentos São bacilos Gram-negativos, curvos, com flagelo, anaeróbios facultativos. Reser- vatório natural é o intestino e a contaminação é por contaminação da água com fezes. A falta de saneamento básico favorece a disseminação dessa bactéria em am- bientes marinhos e outros. O controle pode ser feito por condições de higiene básicas e cocção dos alimentos, principalmente, alimentos marinhos. Doença/microrganismo: Gastroenterites/Escherichia coli A Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, facultativo e uma das bactérias mais encontradas no trato intestinal. Sua presença em alimentos e água é indicativo de con- dições sanitárias insatisfatórias, e é uma das bactérias que deve ser analisada como pa- drão microbiológico em água e alimentos para consumo, estabelecido por legislação. Mas, além disso, algumas linhagens de Escherichia coli são patogênicas, e apre- sentam variações nos sintomas devido às características específicas delas. Assim, são agrupadas em cinco classes. • Escherichia coli enteropatogência clássica (EPEC): causa gastroenterite em crianças, principalmente. Apresentam diarreia, dores abdominais, vômitos e febre; • Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC): invadem as células epiteliais e rompem essas células, provocando disenteria, com eliminação de sangue e muco nas fe- zes. Provoca ainda, dores abdominais, febre e mal-estar geral; • Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC): produzem enterotoxinas (toxinas que atuam nas células intestinais – enterócitos). Provocam diarreia aquosa que leva à desidratação, dores abdominais, febre baixa e náuseas. Em casos de pes- soas desnutridas, leva à desidratação grave; • Escherichia coli enterro-hemorrágica (EHEC): causa colite hemorrágica que provoca dores abdominais severas e diarreia com grande quantidade de sangue nas fezes e ausência de febre. O gado é o principal reservatório dessa bactéria e os surtos relatados foram associados a consumo de carne de hambúrguer; • Escherichia coli enteroagregativa (EAggEC): o mecanismo como coloniza o intestino ainda não está claro, mas sabe-se que ela provoca diarreia persistente, principalmente, em crianças, por alterarem as células do intestino delgado, difi- cultando o processo de absorção. Doença/microrganismo: Listeriose/Listeria monocytogenes A listeriose é uma doença que pode apresentar sintomas semelhantes à gripe acompanhada de febre moderada e diarreia. Entretanto, essa bactéria pode dissemi- nar pelo corpo atingindo o sistema nervoso, coração. Em mulheres grávidas, pode haver infecção do feto e, no recém-nascido pode causar meningite. Além de gestan- tes, a listeriose é particularmente perigosa em idosos e pessoas com comprometi- mento do sistema imunológico. Trata-se de um bacilo Gram-positivo, não formador de esporo, anaeróbio faculta- tivo, com flagelos, crescem em baixas temperaturas como 2,5ºC até 44ºC. Existem 22 23 relatos de sobrevivência em alimentos congelados e suporta repetidos congelamen- tos e descongelamentos. Assim, deve-se ter cuidado especial no processo de conge- lamento de alimentos. Essa bactéria foi encontrada em diferentes ambientes como solo, água, vegetais, seres humanos e animais, entre eles gado, galinhas, cachorros, porcos, além de artrópodes, peixes e larvas de insetos. Os alimentos envolvidos na contaminação são leite cru e pasteurizado, queijos, carne bovino, embutidos, carne moída, além de produtos de origem vegetal e refeições preparadas. O controle do microrganismo deve ser feito nos pontos de origem da matéria- -prima para evitar as chances de contaminação, como limpeza de equipamentos, impedir a entrada de animais no local de processamento de alimentos, evitar o con- tato do produto final com a matéria-prima, evitando, assim, a contaminação cruzada. Infecção alimentar por vírus Vírus são parasitas intracelulares obrigatórios. Podem ser encontrados em alimentos e água. O vírus da Hepatite A é transmitido pela via fecal-oral, sendo a água e os alimen- tos contaminados os principais veículos de transmissão. O vírus passa pela mucosa intestinal e vai para o fígado. Os moluscos podem reter muitos vírus quando culti- vados em águas contaminadas. Esses vírus suportam temperaturas de até 60ºC, e é grande o risco de infecção pela ingestão de alimento cru. O vírus da poliomielite atinge o sistema nervoso, e tem como hospedeiro o ho- mem e o intestino é seu habitat. Água, verduras cruas e mariscos são importantes vias de transmissão. Felizmente, existe a vacina para a poliomielite, pois o poliovírus pode sobreviver em água não tratada por até 160 dias. As gastroenterites provocadas por Rotavírus são mais comuns em crianças, nos meses de inverno. Interferem na reabsorção de fluídos intestinais, resultando em diarreia. O processo infeccioso se instala cerca de 48 horas, e os sintomas podem durar até 5 dias. As gastroenterites provocadas por vírusNorwalk (Norovírus) são mais frequentes nos meses de verão e podem afetar crianças e adultos. Provocam diarreia que varia o tempo de duração. Benefícios dos Microrganismos Alguns microrganismos são muito utilizados na indústria de alimentos. Conhecen- do o metabolismo desses microrganismos, é possível ajustar as condições de cultivo para obter os produtos de fermentação de interesse. Como é o caso dos processos de produção de bebidas (cerveja, vinho), vinagre, álcool, iogurte, queijos, pães. Além 23 UNIDADE Importância dos Microrganismos nos Alimentos disso, existem os fungos comestíveis e alimentos probióticos que favorecem a micro- biota intestinal e o bom funcionamento do organismo. Para produção de queijos, utilizam-se: Propionibacterium para queijo suíço; Penicillium spp para queijo azul (gorgonzola), Roquefort e Camembert maturados por fungos. Os orifícios de diversos queijos são resultados do metabolismo que produz dióxido de carbono (CO2). Figura 8 – Na imagem, é possível visualizar detalhes do fungo Penicillium roquefort no queijo Fonte: Getty Images Para produção de iogurte, pode utilizar uma cultura mista de Streptococcus thermophillus e Lactobacillus bulgaricus, o que garante acidez, sabor e aroma. Essas bactérias são mantidas a 45ºC por várias horas, até obter o produto final. A espécie de levedura Saccharomyces cerevisiae é uma das mais utilizadas na panificação. O CO2 liberado na fermentação forma as bolhas típicas de pães fermen- tados. A liberação do gás é maior em condições aeróbias. Em condições anaeróbias, esse fungo produz, principalmente, etanol, como na produção da cerveja. Figura 9 – Na imagem, é possível verificar a formação das bolhas resultantes do metabolismo da levedura Fonte: Getty Images 24 25 Os vinhos são produzidos a partir de frutas, onde as leveduras utilizam os açúca- res disponíveis. Bactérias também podem ser utilizadas na produção de vinho, onde ocorre a fermentação ácido-lática. No saquê, vinho de arroz japonês, é utilizado inicialmente o fungo Aspergillus para converter o amido do arroz em açúcares que podem ser fermentados posteriormente. Para a produção de vinagre, utilizam-se as bactérias Acetobacter e Gluconobacter, pois elas conseguem produzir ácido acético a partir do etanol. Produtores de vinho que deixavam o vinho exposto ao ar percebe- ram que ele azedava por causa do crescimento de bactérias que convertiam o etanol em ácido acético. Em relação aos fungos comestíveis, existem 3 espécies mais comumente culti- vadas e consumidas no Brasil: Agaricus bisporus, conhecido como champignon de Paris; Lentinula edodes, como Shiitake; e Pleurotus, como Shimeji ou Hiratake, todos apresentam características nutricionais excelentes, com alto teor de proteínas e fibras alimentares, além do baixo teor e lipídeos e fonte considerável de fósforo. (ver material complementar). Figura 10 – Shiitake Fonte: Getty Images Figura 11 – Champignon Fonte: Getty Images O uso de probióticos está muito difundido por promover benefícios ao organismo. Pode-se definir probiótico como culturas puras ou mistas de microrganismos vivos como bactérias láticas e outras bactérias ou leveduras aplicadas como células secas ou em um produto fermentado, que, quando aplicadas aos animais ou ao homem, tem efeitos benéficos ao hospedeiro promovendo o balanço de sua microbiota intes- tinal. A microbiota intestinal exerce papel importante nas reações bioquímicas do hospedeiro, além de impedir que microrganismos patogênicos exerçam seus efeitos maléficos. O desequilíbrio dessa microbiota pode resultar na proliferação de pató- genos. Entre as bactérias empregadas como probióticos, têm-se, principalmente, as dos gêneros Bifidobacterium e Lactobacillus, além das Enterococcus faecium e Streptococcus thermophilus (Saiba mais: ver material complementar). 25 UNIDADE Importância dos Microrganismos nos Alimentos Material Complementar Indicações para saber mais sobre os assuntos abordados nesta Unidade: Vídeos Rotting Watermelon Decomposition Timelapse Footage https://youtu.be/S12zZhdOckc Tomato Timelapse – Zeitraffer Tomaten https://youtu.be/3ymRs2kd02c Fish Eaten By Maggots Timelapse https://youtu.be/9S5_OJxK0p0 Strawberry Yogurt Timelapse https://youtu.be/K4R9GbxtweY Cervejaria Ambev – Por dentro da produção de cerveja https://youtu.be/GveXHbIZhss Leitura Surtos Alimentares no Brasil – Dados atualizados em junho de 2018 Doenças Transmitidas por Alimentos e surtos no Brasil. https://bit.ly/3bxup1y Deterioração Microbiana dos Alimentos https://bit.ly/364hLpm Doenças Transmitidas por Alimentos: Causas, Sintomas, Tratamento e Prevenção https://bit.ly/2WAl18Q Microorganismos Causadores de Doenças de Origem Alimentar https://bit.ly/2zEJQaY Doenças Transmitidas por Alimentos e Principais Agentes Bacterianos envolvidos em Surtos no Brasil: Revisão https://bit.ly/2WAdg2S Doenças Transmitidas por Alimentos, Principais Agentes Etiológicos e Aspectos Gerais: uma Revisão https://bit.ly/3cMjwdL Manual Integrado De Prevenção e Controle de Doenças Transmitidas por Alimentos https://bit.ly/2LxT8rM Surtos de Doenças Transmitidas por Alimentos no Brasil https://bit.ly/3bAqyAK Valor Nutricional de Cogumelos Comestíveis https://bit.ly/2zC4okq Aspectos Tecnológicos de Alimentos Funcionais Contendo Probióticos https://bit.ly/362AGB2 26 27 Referências BONITA, R.; BEAGLEHOLE, R.; KJELLSTRÖN, T. Epidemiologia básica. 2. ed. São Paulo: Santos, 2010. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008. (e-book) LEVINSON, W. Microbiologia médica e imunologia. 13. ed. Porto Alegre: AMGH, 2016. (e-book) 27 Microbiologia de Alimentos Responsável pelo Conteúdo: Prof.ª Drª. Elisa Mara Prioli Ciapina Rochedo Revisão Textual: Prof.ª Aline Gonçalves Crescimento e Controle de Microrganismos Crescimento e Controle de Microrganismos • Conhecer as fases do crescimento microbiano; • Entender quais fatores favorecem o crescimento microbiano, ressaltando as características in- trínsecas dos alimentos que promovem a sobrevivência ou a multiplicação dos microrganismos; • Conhecer medidas de controle de microrganismos, visando eliminar riscos à saúde do consumidor; • Entender como o controle dos microrganismos pode prevenir ou retardar o surgimento de alterações indesejáveis nos alimentos. OBJETIVOS DE APRENDIZADO • Crescimento dos Microrganismos; • Controle dos Microrganismos. UNIDADE Crescimento e Controle de Microrganismos Contextualização Os microrganismos apresentam ampla diversidade metabólica, o que permite que colonizem diferentes ambientes. Uma vez presentes, os microrganismos podem se multiplicar devido a fatores de crescimento que interferem nas suas taxas metabó- licas. Conhecer os fatores que influenciam o crescimento microbiano é importante porque permite controlar esse aumento, favorecendo a multiplicação deles quando for desejável, como no caso de fazer um pão, iogurte ou queijo, ou para inibir e até eliminar os microrganismos em uma superfície ou alimento. Sabendo-se como o microrganismo cresce e quais as características que os ali- mentos apresentam que favorecem isso, é possível controlar esse crescimento, pro- longando o tempo para o consumo do alimento. Você já se perguntou qual a importância de uma embalagem a vácuo no controle dos microrganismos? Por que manter os alimentos em geladeira? Muito bem, esses assuntos serão discutidos nesta unidade, portanto, bom estudo! 8 9 Crescimento dos Microrganismos As condições necessárias para o crescimento microbiano interferem no metabolis- mo dos microrganismos. Neste tópico, será discutido o crescimento de fungos e bac- térias, principalmente. Sabendo-se que vírus não tem metabolismo próprio, sendo um parasita intracelular obrigatório, e que o processo de multiplicação ocorre pela replicação dentro das células, eles não serão discutidos neste tópico de crescimento microbiano. Toda vez que ouvir o termo“crescimento microbiano”, saiba que se refere ao au- mento do número de células e não ao tamanho das células. Células isoladas de bac- térias e fungos são invisíveis a olho nu, entretanto, com o aumento do número dessas células, ocorre a formação de colônias, e estas, sim, são visíveis. Não existe geração espontânea, portanto, se cresceu uma colônia de bactérias ou fungos é porque havia uma célula naquele local. Para essa célula inicial dá-se o nome de Unidade Forma- dora de Colônia (UFC). Dentre os fatores que favorecem o crescimento dos microrganismos, destacam-se os físicos e químicos, como: temperatura, pH, pressão osmótica, atmosfera gasosa (oxigênio, gás carbônico); fatores nutricionais, como fonte de carbono, nitrogênio, enxofre e outros. Discutiremos a importância desses fatores e como os microrganismos são classifi- cados de acordo com as suas necessidades metabólicas. • Temperatura: é um fator físico que interfere na atividade das enzimas meta- bólicas porque a velocidade das reações enzimáticas cresce com o aumento da temperatura, até um ponto em que as enzimas são danificadas pelo calor e as células param de crescer. Os microrganismos apresentam uma temperatura considerada ótima para seu metabolismo. Essa temperatura ótima é aquela em que a espécie cresce melhor, mais rapidamente. Além da temperatura ótima, existe a temperatura mínima de crescimento, que é a menor na qual as espécies podem crescer, e a máxima, que é a maior temperatura na qual a espécie pode crescer. Os microrganismos apresentam variações nessa temperatura ótima, no entanto, é possível classificá-los em três grupos principais, de acordo com as faixas de temperatu- ra que eles preferem, em psicrófilos (preferem o frio), mesófilos (gostam de temperaturas moderadas) e termófilos (preferem o calor). A tabela a seguir mostra as temperaturas e faixas de temperaturas de crescimento de bactérias de acordo com sua classificação. Tabela 1 – Temperaturas de crescimento bacteriano Temperatura Mínima (°C) Ótima (°C) Máxima (°C) Psicrófilos –10 15 20 Mesófilos 10 25 a 40 50 Termófilos 40 50 a 60 70 9 UNIDADE Crescimento e Controle de Microrganismos As faixas e as temperaturas não são determinadas de maneira rígida. Desta forma, pode se distinguir, ainda, grupos microbianos classificados como: • Psicrotrófilos: crescem a 0 °C e têm temperaturas ótimas de crescimento entre 20 e 30 °C, não podendo crescer acima de 40 °C. Esse grupo é importante na área de microbiologia de alimentos, pois crescem muito bem em refrigeradores, sendo responsáveis pela deterioração de alimentos em baixa temperatura; • Termófilos extremos: crescem muito bem em temperaturas acima de 80 °C e podem sobreviver até a 121 °C. A maioria desses microrganismos vive em fontes termais associadas a atividades vulcânicas, o que não representa possibi- lidade de crescimento em alimentos na temperatura ambiente; Importante! Os mesófilos são os microrganismos mais comuns e os principais que causam doenças (os patogênicos), uma vez que crescem muito na temperatura do corpo humano; e os princi- pais causadores de deterioração dos alimentos. Daí a importância de manter os alimentos em baixas temperaturas, pois retardará muito o crescimento dos organismos mesófilos. • pH: este é um fator físico-químico determinante para o crescimento de micror- ganismos, pois influencia ação de enzimas no metabolismo. A faixa de pH para crescimento de bactérias está em torno da neutralidade, entre pH 6,5 e 7,5. Entretanto, algumas bactérias toleram bem a acidez e são chamadas de acidófilas. A maioria das bactérias não cresce em pH abaixo de 4 e muitos alimentos demo- ram mais para serem degradados por essa razão, como picles e alguns queijos. Quanto aos fungos, estes crescem em uma faixa de pH entre 5 e 6; • Pressão osmótica: este é um fator importante porque está relacionado à dis- ponibilidade de água para os microrganismos, e todo ser vivo precisa de água para sua sobrevivência. Essa pressão é a força com a qual a água se move por meio da membrana plas- mática de uma solução contendo baixa concentração de substâncias dissolvidas (solutos) para outra contendo alta concentração de solutos. Considerando uma célula microbiana, quando esta é colocada em um ambiente hipertônico (com alta concentração de solutos), a célula perde água, pois a água se move do meio hipotônico para o meio hipertônico, inibindo o crescimento do microrganismo. Desta forma, peixe salgado e frutas em calda, por exemplo, são conservados pela retirada da água de qualquer microrganismo que esteja nesses alimentos. A bactéria ou o fungo perderá água para o alimento e assim não poderá realizar suas atividades metabólicas. Isso não quer dizer que o microrganismo morrerá, mas terá seu crescimento inibido; • Atmosfera gasosa (oxigênio): os microrganismos necessitam de quantidades va- riadas de gases como oxigênio e gás carbônico. De acordo com a necessidade de 10 11 oxigênio, pode-se dividir os microrganismos em aeróbios obrigatórios, anaeróbios obrigatórios, anaeróbios facultativos, anaeróbios aerotolerantes e microaerófilos. A figura a seguir mostra o crescimento microbiano de acordo com a disponibilida- de de oxigênio nos frascos. Considerando a sequência dos frascos da esquerda para a direita, temos: Figura 1 – Crescimento bacteriano Fonte: Adaptado de Getty Images • Microrganismos aeróbios obrigatórios: crescem somente em altas concentra- ções de oxigênio a 21% disponível em atmosfera padrão (crescimento aeróbio); • Microrganismos anaeróbios obrigatórios: crescimento ocorre somente onde não há oxigênio, uma vez que não toleram oxigênio, pois não têm enzimas que neutralizam as formas tóxicas do oxigênio (crescimento anaeróbio); • Microrganismos anaeróbios facultativos: crescimento ocorre tanto na pre- sença quanto na ausência de oxigênio, mas ocorre, preferencialmente, onde há mais oxigênio (crescimento aeróbio e anaeróbio); • Microrganismos anaeróbios aerotolerantes: toleram o oxigênio, mas o cres- cimento ocorre na ausência de oxigênio (crescimento anaeróbio, mas pode con- tinuar na presença de oxigênio); • Microrganismos microaerófilos: necessitam de concentrações mais baixas de oxigênio de 1% a 15% presentes na atmosfera (crescimento aeróbio). Desta forma, quando um alimento é embalado a vácuo, retirando o ar da em- balagem, espera-se inibir o crescimento dos microrganismos aeróbios que podem deteriorar o alimento, conservando este por mais tempo. Fatores nutricionais Além da água, um dos fatores mais importantes para o crescimento dos microrga- nismos é o carbono. Ele é o elemento químico do esqueleto estrutural de proteínas, lipídeos e carboidratos, indispensáveis para a vida e sua manutenção. Além do car- bono, os seres vivos necessitam de fontes de nitrogênio, enxofre, fósforo para síntese de proteínas, DNA e RNA, além de fosfolipídios da membrana plasmática. Potássio, magnésio e cálcio também são requeridos para o metabolismo celular. 11 UNIDADE Crescimento e Controle de Microrganismos Outros elementos minerais podem ser necessários, mas em quantidades muito pequenas, que são chamados de elementos-traços. Estes incluem o ferro, cobre, mo- libdênio e zinco, os quais são essenciais às funções de certas enzimas. Os microrganismos, fungos e bactérias podem ser cultivados em laboratório utili- zando-se meios de cultura apropriados. Meio de cultura é uma solução de nutrientes que favorece o crescimento dos microrganismos de interesse. Existem vários meios de cultura disponíveis para o crescimento microbiano, que permite estudar melhor os microrganismos e suas exigências nutricionais. Não existe um único meio de cultura que supra as necessidades de todos os microrganismos. Entretanto, existem os meios de cultura definidos para fungos e bactérias, os quais são utilizados para realizar análises microbiológicas em água e alimentos, de acordo com a legislação que estabelece os padrões microbiológicos desses itens. Esse assun- to
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