Prática 4 - Caracterização de Lipídios

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE – FURG ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS – EQA DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL PROF. ANDREA MENEZES LOPES
CARACTEIZAÇÃO DE LIPÍDIOS
Alessandra Costa Ribeiro - 131412 Daiana Lilge Sodré – 127119 Jônatas Külzer - 137971
Pablo de Freitas Teófilo - 120923
Rio Grande – RS 2022
1. INTRODUÇÃO
Os lipídeos são compostos que apresentam uma estrutura molecular bastante variada, e possuem diversas funções nos organismos, como reserva energética, isolante térmico, além de colaborar na membrana plasmática das células. Como característica, os lipídeos apresentam insolubilidade em solventes polares e sua solubilidade em solventes apolares, como éter e clorofórmio. 
	As principais classes de lipídeos biológicos são os ácidos graxos, triacilgliceróis, glicerol, fosfolipídios, esfingolipídios e esteroides. Os ácidos graxos são ácidos monocarboxilicos anfipáticos, geralmente com uma cadeia longa, com número par de átomos de carbono e sem ramificações, podendo ser saturada ou possuir uma ou mais insaturações. Ácidos graxos livres são raros em organismos, sendo mais frequentemente encontrados ligados a álcoois, que pode vir a ser o glicerol ou esfingosina. 
Os lipídeos provenientes da ligação entre o ácido graxo e o glicerol são os triacilgliceróis, que representam cerca de 98 a 99% das gorduras naturais, enquanto demais compostos como monoacilglicerois, diacilglicerois, ácidos graxos livres fosfolipídios e substancias não saponificáveis contendo esteróis, representam apenas de 1 a 2%. 
As gorduras e óleos são uma mistura complexa de triacilgliceróis, cuja composição depende do organismo que os produz. As gorduras são ricas em ácidos graxos saturados, logo apresentam uma maior facilidade de empacotamento devido a conformação de suas moléculas, o que explica sua solidez em temperatura ambiente. Já os óleos são mais ricos em ácidos graxos insaturados, o que dificulta a interação intermolecular, os tornando líquidos em temperatura ambiente. 
1.1 SAPONIFICAÇÃO
Em uma reação de saponificação um triacilglicerol é hidrolisado na presença de uma base, formando sais de ácidos graxos ou sabões, como está representado na figura 1. Sabões de metais alcalinos são solúveis, enquanto os que contem metais alcalinos terrosos e metais pesados são insolúveis. 
Figura 1 – Reação de saponificação.
1.2 HIDROGENAÇÃO
Com a reação de hidrogenação pode se aumentar o grau de saturação de uma gordura insaturada pela adição de hidrogênio às duplas ligações (figura 2). Está reação é de grande importância na indústria, porque permite a conversão de óleo liquido em gorduras plásticas para a produção de margarinas, gorduras e outros produtos semissólidos.
Figura 2 – Reação de hidrogenação 
1.3 RANCIFICAÇÃO
A exposição do lipídio ao ar por um certo tempo pode resultar em alterações químicas denominadas rancificação. O oxigênio ataca ácidos graxos com duas ou mais ligações para formar peróxidos, originando produtos de sabor desagradável e toxico para as células (Figura 3). A hidrogenação parcial dos óleos diminui a tendencia à oxidação, aumentando assim sua estabilidade. 
Figura 3 – Reação de Rancificação.
2 METODOLOGIA
2.1 Materiais e reagentes
· Pipetas graduadas e pipeta de Pasteur;
· Proveta;
· Tubo de ensaio grande;
· Estante para tubos de ensaio;
· Espatula;
· Béquer;
· Tubos de ensaio com e sem tampa;
· Pinça para tubo de ensaio;
· Bastao de vidro;
· Óleo de soja;
· Hidroxido de sódio;
· Solventes: água, etanol a 95% e éter etílico;
· Solução de cloreto de cálcio a 10%;
· Solução saturada de cloreto de sódio;
· Solução de hidroxido de sódio a 2 mol.L-1;
· Solução de hidróxido de potássio a 0,1%;
· Ácido acético concentrado;
· Solução de fenolftaleina a 0,1%;
Figura 4 – Materiais e Reagentes utilizados durante a pratica. 
2.2 Método
2.2.1 Solubilidade dos triacilgliceróis
1)	Numere três tubos de ensaio e coloque, separadamente, em cada um deles 2 mL de água, etanol e éter etílico.
2)	Adicione 1 mL de óleo de soja a cada tubo e agite. 
3)	Deixe em repouso por quatro minutos.
4)	Verifique a solubilidade do óleo em cada tubo e justifique, preenchendo a o esquema a seguir:
Tabela 1 – Solubilidade do óleo de soja.
	Solventes
	H2O
Água
	CH3CH2OH
Etanol
	(CH3CH2)2
Éter
	Solubilidade
	
	
	
2.2.2 Acidez Livre
1)	Numere dois tubos de ensaio com tampa de rosca.
2)	Ao primeiro, adicione 2 mL de óleo de soja e 3 mL de água. Agite.
3)	Adicione três gotas de fenolftaleina a 0,1% (indicador de pH).
4)	Adicione duas gotas de KOH a 0,1%.
5)	Ao segundo tubo, adicione 3 mL de água.
6)	Adicione duas gotas de KOH a 0,1%.
7)	Tampe os tubos e agite-os vigirosamente por 5 min.
8)	Deixe-s em repouso por 4 min, observe o desaparecimento da cor rosa e explique.
9)	Anote os resultados e de a reação ocorrida com ácidos graxos livres. Justifique.
Tabela 2 – Acidez livre dos triacilgliceróis.
	
	Antes de agitar
	Após agitação
	Coloração do tubo-controle
	
	
	Coloração do tubo com óleo de soja
	
	
2.2.3 Reação de Saponificação dos Triacilgliceróis
1)	Em um tubo de ensaio grande, adicione 1 mL de óleo de soja.
2)	Com o auxílio de uma espátula, adicione um pequeno fragmento de hidróxido de sódio ou de potássio.
3)	Em seguida, adicione 10 mL de etanol medidos em uma proveta.
4)	Aqueã o tubo em banho-maria e deixe ferver por 10 min.
5)	Apague o gás, retire o tubo e coloque-o em banho de água fria por 5 min.
6)	Adicione 15 mL de água destilada. homogenize com o auxílio de um bastão de vidro. Observe a solução límpida de sabão de sódio. Agite o tubo e justifique sua observação.
7)	Escreva a reação de saponificação ocorrida com a trioleína (principal triacilglicerol no óleo de soja).
2.2.4 Separação dos Ácidos Graxos
1)	Separe 3 tubos da reação anterior.
2)	Ao primeiro tubo, acrescente duas gotas de fenolftaleina a 0,1%.
3)	Adicione 10 gotas de ácido acético concentrado. Agite o tubo e deixe-o em repouso por 5 min.
4)	Observe a separação da mistura em duas camadas. A camada superior, amarela e gordurosa, corresponde a ácidos graxos.
5)	Escreva a reação do sabão com o ácido acético e justifique o resultado
6)	Reserve essa reação para o uso posterior.
2.2.5 Formação de Sabões Insolúveis
1)	Ao segundo tubo contendo sabão, adicione o mesmo volume de água e, em seguida, 5 gotas da solução de cloreto de cálcio a 10%. Verifique o aparecimento de um precipitado branco abundante. Observe a separação do sabão insolúvel. 
2)	Escreva a reação do sabão com o cloreto de cálcio e justifique o resultado.
2.2.6 Formação de Sabões por Salificação
1)	Ao terceiro tubo contendo sabão, adicione o mesmo volume de água e, em seguida, igual volume de solução saturada de cloreto de sódio. Observe a separação do sabão.
2)	Escreva a reação do sabão com NaCl.
2.2.7 Ressaponificação dos Ácidos Graxos
1)	Coloque 5 mL de água em um tubo de ensaio.
2)	Transfira, utilizando cuidadosamente uma pipeta de Pasteur, 4 gotas do ácido graxo formado no experimento de separação de ácidos graxos, para o tubo contendo água.
3)	Adicione 10 gotas da solução de hidróxido de sódio a 2 mol. L-1.
4)	Agite o tubo e verifique a formação de espuma.
5)	Escreva a reação ocorrida entre o ácido graxo e o NaOH e justifique o resultado.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Solubilidade dos Triacilgliceróis.
Afim de verificarmos a solubilidade dos triacilgliceróis, adicionamos 1 mL em tubos de ensaio contendo diferentes solventes, como água, etanol e éter. A tabela 3 no mostram os resultados observados experimentalmente. 
Tabela 3 – Solubilidade do óleo de soja observada.
	Solventes
	H2O
Água
	CH3CH2OH
Etanol
	(CH3CH2)2
Éter
	Solubilidade
	Insolúvel 
	Solubilidade
 Parcial
	Solúvel
.
Após a agitação dos solventes, os tubos serem mantidos em repouso durante 4 minutos, foi possível observar que o óleo de soja é insolúvel em água. No etanol, ocorreu a formação de fases, porém com uma solubilidade parcial. Por fim, no éter ocorreu a solubilização praticamente total do óleo. 
Isso pode ser explicado com a polaridade dos solventes. A água éo solvente mais polar que utilizamos e o éter é o menos apolar, como os lipídios tem caráter, principalmente, apolar, eles vão apresentar uma solubilidade maior em solventes apolares. Como o etanol apresenta uma polaridade mediana entre os três ocorreu uma solubilidade parcial, porem com uma separação de fases, por conta da diferença na densidade dos líquidos. 
3.2 Acidez Livre.
Para podermos mensurar a acidez livre dos triacilgliceróis adicionamos 2 mL de óleo de soja e 3 mL de água destilada, separadamente, em dois tubos com tampa. Nestes também foram adicionadas três gotas do indicador de pH fenolftaleina 0,1% e duas gotas de hidróxido de potássio (KOH). Os tubos então foram tampados e agitados vigorosamente. Os resultados são demonstrados na tabela 4.
Tabela 4 – Acidez livre do óleo de soja observada.
	
	Antes de agitar
	Após agitação
	Coloração do tubo-controle
	Rosa
	Rosa
	Coloração do tubo com óleo de soja
	Parcialmente Rosa
	Branca
Como nesta pratica utilizamos o indicador de pH fenolftaleina a solução deve ficar rosada em se em meio básico e incolor em meio ácido.
 No tubo 2, foi adicionado água destilada e hidróxido de potássio, então a coloração da solução se manteve rosa mesmo após a agitação devido à presença apenas de íons OH- em solução. Já no tubo 1, onde adicionamos óleo de soja observamos que a solução ficou branca após a agitação, o que indica o aumento da acidez do meio. 
Os lipídios são moléculas anfipáticas que se organizam na forma de micelas. Desta forma, eles expõem a cabeça polar e escondem a cauda apolar. Contudo, quando o tubo é agitado, as micelas são desfeitas, liberando ácidos graxos, constituintes dos triacilgliceróis, que ficam livres e reduzem o pH da solução, aumentando a acidez do meio e mudando sua coloração de rosa para branca.
3.3 Reação de Saponificação dos Triacilgliceróis.
Nesta etapa, adicionamos em um tubo de ensaio grande, 1 mL de óleo de soja. Em seguida, adicionamos uma pequena quantidade de hidróxido de sódio (uma ponta de espátula) e 10 mL de etanol. O tubo foi então aquecido por 10 min até a evaporação do etanol e é observada a formação de uma pasta esbranquiçada. Após, adicionamos 15 mL de água destila e homogeneizamos a solução com um bastão de vidro. Depois destes procedimentos podemos observar a formação de uma espuma na solução, que indica a formação do sabão de sódio. A figura 5 representa a reação de saponificação entre a trioleína, o principal triacilglicerol no óleo de soja, e o hidróxido de sódio. 
Figura 5 – Reação de saponificação entre a trioleína e o hidróxido de sódio
3.4 Separação dos Ácidos Graxos.
Na separação dos ácidos graxos utilizamos parte do sabão formado anteriormente no tópico 3.3, porém adicionamos mais 2 gotas do indicador de pH fenolftaleina 0,1% e 10 gotas de ácido acético. Agitamos e deixamos em repouso por 5 minutos. Após este tempo é possível observar uma camada superior gordurosa na amostra. A reação ocorrida nesta pratica está representada na figura 6.
Figura 6 – Equação da separação de ácido graxo por ácido acético.
O ácido graxo separado é facilmente perceptível pois este é praticamente insolúvel em água. 
3.5 Formação de Sabões Insolúveis.
Mais uma vez utilizamos o sabão formado no tópico 3.3, porém agora adicionamos o mesmo volume de água e, em seguida, 5 gotas da solução de cloreto de cálcio 10%. Rapidamente podemos perceber a formação de um precipitado branco no tubo. Nesta reação, ocorre uma reação de troca iônica, em que o íon sódio é substituído pelo íon cálcio, resultando na formação do sabão de cálcio, que tem como característica ser insolúvel, duro e não formar espuma. A figura 7 abaixo representa a reação de formação do sabão de cálcio. 
Figura 7 – Equação de formação do sabão de cálcio.
3.6 Separação de Sabões por Salificação.
A um terceiro tubo do sabão formado no tópico 3.5, adicionamos o mesmo volume de água, e em seguida, igual volume de uma solução saturada com cloreto de sódio. Nesta reação, representada pela equação da figura 8, ocorre a dissociação do sabão de sódio e do cloreto de sódio, como a solução está com um excesso de Ca+ a reação tende para a dissociação do sabão de sódio e formação do cloreto de sódio. 
Figura 8 – Reação de separação do sabão de sódio por salificação.
3.7 Ressaponificação dos Ácidos Graxos.
Em um novo tubo adicionamos 5 mL de água destilada. Então coletamos o ácido graxo obtido na separação de ácidos graxos (3.4), e adicionamos a este tubo com água e 10 gotas de hidróxido de sódio. Ao agitarmos o tubo podemos perceber a formação de espuma, que indica a ressaponificação de ácidos graxos. E diferente da saponificação, neste processo não é necessário aquecimento, porque foram utilizados ácidos graxos livres. 
4 CONCLUSÃO
Através dos experimentos realizados nesta pratica, podemos verificar que o óleo de soja apresenta solubilidade total em éter, que é um solvente apolar, enquanto para água e etanol, solventes mais polares, a solubilidade é reduzida ou não observada. Também realizamos o teste de acidez livre em triacilgliceróis, onde foi possível observar através da mudança de coloração a formação de ácidos graxos livres em solução. A saponificação dos lipídeos foi realizada mediante adição de hidróxido de sódio em aquecimento e posteriormente a precipitação do sabão de cálcio com a substituição do sódio pelo cálcio foi analisada, a seguir realizamos a separação dos ácidos graxos e sua ressaponificação. 
Com estás praticas foi possível um entendimento maior sobre as propriedades físico-químicas e manipulações com triacilgliceróis presente no óleo de soja. 
5 REFERÊNCIAS
LEHNINGER, T. M., NELSON, D. L. & COX, M. M. Princípios de Bioquímica.
6ª Edição, Ed. Artmed. 2014.
MARZZOCO, A.; TORRES, B.B. Bioquímica Básica. 4ª ed., Ed. Guanabara Koogan, 2015.
FOGAÇA, J. Reação de saponificação. Manual da Química. Disponível em <https://www.manualdaquimica.com/quimica-organica/reacao-saponificacao.htm> acessado em 14/11/2022.
LIBERATO, M. C. T. C; OLIVEIRA, M. S. C.; Bioquimica. 2° ed. Fortaleza - Ceará: Editora UAB/UECE, 2019.