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Aldo Matos Isabel Cristina Rezende Lopes Lilian Margareth Biagioni de Lima Microbiologia e parasitologia/ Patologia e imunologia Catalogação elaborada pelo Setor de Referência da Biblioteca Central UNIUBE Matos, Aldo. M428m Microbiologia e parasitologia, patologia e imunologia / Aldo Matos, Isabel Cristina Rezende Lopes, Lílian Margareth Biagioni de Lima. – Uberaba : Universidade de Uberaba, 2017. 316 p. : il. Programa de Educação a Distância – Universidade de Uberaba. Inclui bibliografia. ISBN 978-85-7777-669-6 1. Parasitologia. 2. Microbiologia. 3. Imunologia. I. Lopes, Isabel Cristina Rezende. II. Lima, Lílian Margareth Biagioni de. III. Universidade de Uberaba. Programa de Educação a Distância. IV. Título. CDD 616.96 © 2017 by Universidade de Uberaba Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta publicação poderá ser reproduzida ou transmitida de qualquer modo ou por qualquer outro meio, eletrônico ou mecânico, incluindo fotocópia, gravação ou qualquer outro tipo de sistema de armazenamento e transmissão de informação, sem prévia autorização, por escrito, da Universidade de Uberaba. Universidade de Uberaba Reitor Marcelo Palmério Pró-Reitor de Educação a Distância Fernando César Marra e Silva Coordenação de Graduação a Distância Sílvia Denise dos Santos Bisinotto Editoração e Arte Produção de Materiais Didáticos-Uniube Revisão textual Stela Maria Queiroz Dias Diagramação Douglas Silva Ribeiro Projeto da capa Agência Experimental Portfólio Edição Universidade de Uberaba Av. Nenê Sabino, 1801 – Bairro Universitário Aldo Matos Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas pela Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Graduado em Farmácia e Bioquímica pela Universidade Federal de Ouro Preto (Ufop), graduado em Licenciatura em Ciências Biológicas pela Universidade de Uberaba (Uniube), graduado em Programa Especial de Formação Pedagógica R2-Biologia pelo Centro Universitário Claretiano de Batatais. É professor de ensino superior da Universidade de Uberaba (Uniube). Tem experiência na área de Parasitologia, com ênfase em Protozoologia Parasitária Humana, atuando principalmente nos seguintes temas: epidemiologia, Trypanosoma cruzi, assistência de enfermagem, calazar humano e chagas disease. Isabel Cristina Rezende Lopes Mestra em Patologia Clínica pela Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM). Graduada em Ciências Biológicas pela Universidade Federal de Uberlândia (UFU). Professora da Universidade de Uberaba (Uniube), dos componentes curriculares: Casos Clínicos, Bioquímica Clínica do curso de Biomedicina, Exames Complementares para o curso de Enfermagem e Ciências Morfológicas para o curso de Medicina. Professora-orientadora do núcleo de professores do PIAC (Programa Institucional de Atividades Complementares). Lílian Margareth Biagioni de Lima Mestre em Ciências-Patologia Geral e especialista em Metodologia do Ensino de Ciências pela Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM). Graduada em Ciências Biológicas (Licenciatura e Bacharelado), pela Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho (Unesp) e aperfeiçoamento em Patologia (Sorodiagnóstico) pelo Departamento de Patologia (Unesp-Botucatu). Professora da Universidade de Uberaba Sobre os autores (Uniube). Membro da Pró-Reitoria de Ensino Superior desta IES. Professora nos cursos da área da educação e da saúde nos conteúdos de Fisiologia Humana e Patologia Geral, atuando principalmente nos seguintes temas: Patologia Geral e Orientação de TCC. Coordenadora pedagógica do Pró-Saúde II (Uniube). Sumário Apresentação .............................................................................................................. IX Capítulo 1 Fundamentos e métodos no adoecimento .......................... 1 1.1 Fundamentos de Parasitologia e Microbiologia .......................................................3 1.2 Fundamentos de Imunologia ..................................................................................10 1.2.1 Funções do sistema imune ...........................................................................10 1.2.2 Mecanismos de defesa .................................................................................15 1.2.3 Defesas artificiais ..........................................................................................19 1.2.4 Métodos utilizados em Imunologia para diagnóstico de doenças ................20 1.3 Introdução ao estudo da Patologia .........................................................................21 1.3.1 Métodos de estudo em Patologia .................................................................21 1.4 Conclusão ...............................................................................................................43 Capítulo 2 Agressão: saúde e doença ................................................. 45 2.1 Etiopatogênese geral das lesões ...........................................................................47 2.1.1 Respostas localizadas às agressões ............................................................48 2.2 Agentes lesivos .......................................................................................................53 2.2.1 Agentes físicos lesivos ..................................................................................53 2.2.2 Agentes químicos lesivos ..............................................................................70 2.2.3 Agentes nutricionais lesivos ..........................................................................72 2.2.4 Agentes biológicos lesivos ............................................................................79 2.3 Lesões ou processos patológicos ..........................................................................97 2.3.1 Degenerações ..............................................................................................98 2.3.2 Morte celular ...............................................................................................100 2.4 Conclusão .............................................................................................................108 Capítulo 3 Defesa e adaptação dos seres vivos ................................111 3.1 A defesa diante dos agentes agressores .............................................................113 3.1.1 Resposta imune adaptativa ........................................................................114 3.1.2 Passo a passo da ação resposta imune adaptativa ...................................123 3.1.3 O Sistema Complemento ...........................................................................124 3.2 Citocinas ..............................................................................................................126 3.2.1 Propriedades gerais das citocinas ..............................................................126 3.2.2 Citocinas que atuam na resposta imune inata ...........................................127 3.2.3 Citocinas que atuam na resposta imune adaptativa ..................................128 3.3 Imunidade aos micróbios ......................................................................................129 3.3.1 Imunidade aos vírus ....................................................................................130 3.3.2 Imunidade a bactérias extracelulares .........................................................131 3.3.3 Imunidade a bactérias intracelulares ..........................................................132 3.3.4 Imunidade aos fungos .................................................................................133 3.4 Defesa e adaptação: o processo inflamatório ......................................................1333.4.1 Classificação da inflamação .......................................................................136 3.4.2 Células do exsudato inflamatório ................................................................136 3.4.3 Fenômenos da inflamação ..........................................................................138 3.4.4 Fenômenos x sinais cardinais da inflamação .............................................142 3.4.5 Mediadores da resposta inflamatória ..........................................................143 3.4.6 Inflamação aguda ........................................................................................144 3.4.7 Inflamação crônica ......................................................................................148 3.5 Doenças: manifestações clínicas das respostas de defesa e de adaptação ......154 3.5.1 Algumas doenças causadas por bactérias, fungos e vírus ........................155 3.5.2 Algumas doenças causadas por bactérias .................................................161 3.5.3 Algumas doenças causadas por vírus ........................................................165 3.5.4 Algumas doenças causadas por fungos .....................................................168 3.6 Alergia ...................................................................................................................169 3.7 Conclusão .............................................................................................................170 Capítulo 4 Alterações celulares e doenças causadas por protozoários ..................................................................... 173 4.1 Protozoários intestinais .........................................................................................175 4.1.1 Protozoários com habitat no intestino delgado ...........................................176 4.1.2 Protozoários com habitat no intestino grosso .............................................182 4.2 Protozoários sanguíneos e tissulares ...................................................................188 4.3 Distúrbios locais da circulação .............................................................................206 4.3.1 Hiperemia ....................................................................................................207 4.3.2 Hemorragia ..................................................................................................212 4.3.3 Edema .........................................................................................................218 4.3.4 Trombose ....................................................................................................220 4.3.5 Embolia........................................................................................................227 4.3.6 Infarto ..........................................................................................................230 4.3.7 Choque ........................................................................................................234 4.4 Resposta imunológica aos parasitos ....................................................................236 4.4.1 Resposta imune adaptativa aos parasitos ..................................................236 4.4.2 Imunoematologia .........................................................................................237 Capítulo 5 Alterações celulares e doenças causadas por metazoários, imunologia dos tumores e doença autoimune ................. 241 5.1 Doenças causadas por nematelmintos ................................................................243 5.1.1 Nematelmintos intestinais que realizam o Ciclo de Loss ...........................245 5.1.2 Nematelmintos intestinais que não passam pelos pulmões ......................252 5.1.3 Nematelmintos sanguíneos e teciduais ......................................................255 5.2 Doenças causadas por platelmintos .....................................................................257 5.2.1 Taenia solium e Taenia saginata .................................................................258 5.2.2 Hymenolepis nana ......................................................................................260 5.2.3 Echinococcus granulosus ...........................................................................262 5.2.4 Schistosoma mansoni .................................................................................264 5.3 Profilaxia e controle das verminoses intestinais ...................................................268 5.4 Crescimento e diferenciação celular ....................................................................271 5.4.1 Regulação do crescimento celular ..............................................................272 5.4.2 Distúrbios do crescimento celular ...............................................................274 5.4.3 Alterações da diferenciação celular ............................................................282 5.4.4 Alterações do crescimento e da diferenciação celular ...............................285 5.4.5 Doenças autoimunes ..................................................................................299 O adoecimento é um processo de grande complexidade que, do ponto de vista biológico, envolve uma agressão, a consequente resposta de defesa do organismo e as alterações anatômicas e/ou funcionais decorrentes das interações entre o agente agressor e o organismo agredido. Classicamente, a defesa do organismo refere-se ao campo da Imunologia, as alterações temporárias ou permanentes causadas pela agressão, bem como os agentes agressores, físicos, químicos ou biológicos, são assuntos da Patologia, da Parasitologia (helmintos e protozoários), da Microbiologia (vírus, bactérias e fungos). Os desafios no estudo das doenças estão em transitar, com segurança, entre a investigação científica e o ensino-aprendizagem; entre os avanços tecnológicos e científicos e a arte e a ciência de ensinar; entre pesquisar e fazer intervenção por meio de projetos educativos. Para vencer esses desafios, é preciso dedicação aos estudos e a compreensão de que tudo está interligado: saúde, educação, economia, cultura, natureza e meio ambiente. Acrescente conceitos e curiosidades à composição destes capítulos, revendo os textos lidos. Nunca utilize as dificuldades como um problema para esse ou qualquer assunto. Com isso, esperamos que admire o desafio de aprender e saber Biologia. Este livro, que se intitula Microbiologia e Parasitologia / Patologia e Imunologia, compõe- se de cinco capítulos. A seguir, de forma sucinta, os conteúdos que foram cuidadosamente selecionados para ajudá-lo(a) na sua formação profissional. Apresentação X UNIUBE No primeiro capítulo, intitulado “Fundamentos e métodos no adoecimento”, iniciaremos os estudos abordando alguns conceitos elementares e os principais métodos aplicados à Parasitologia. Com certeza, você não sentirá dificuldades. Afinal, quem nunca ouviu falar em amebas, lombrigas ou giárdia? Mesmo porque, os protozoários e os helmintos são temas já abordados em outra disciplina, como na Zoologia dos invertebrados. O que vamos fazer nesse capítulo é organizar essas informações e complementá-las, focando as doenças parasitárias. Além desses aspectos, ainda, nesse capítulo, serão estudados os principais métodos de estudo utilizados na investigação do processo de adoecimento. Assim sendo, esperamos que, ao final desse estudo, você compreenda o princípio e a utilização dos métodos e técnicas. “Agressão: saúde e doença” corresponde ao capítulo dois deste livro, em que estudaremos alguns aspectos da saúde e da doença. O tema saúde x doença permite múltiplas abordagens, que envolvem desde os processos biológicos até as interações sociais. Você perceberá que, do ponto de vista biológico, o foco central é o adoecimento. Nesse processo, percebemos que uma agressão desvia o organismo do estado de equilíbrio ou homeostase e provocanele uma reação no sentido de retomar o estado de equilíbrio, ou seja, na prática, o organismo reage pela resposta imunológica e por reações heterólogas. O equilíbrio pode, ou não, ser reestabelecido e, na verdade, existe uma infinidade de novas situações de equilíbrio possíveis diante de uma agressão. Todas essas possibilidades configuram desde a cura até as diferentes apresentações de doença. Assim, diante de uma agressão, o organismo defende-se, podendo adaptar-se a um novo ponto de equilíbrio ou apresentar processos patológicos e adoecer. Nessa interação entre agente agressor e organismo agredido, exercem papéis importantes UNIUBE XI a resposta imunológica a vírus, a bactérias e a fungos e os processos patológicos resultantes que, de um modo geral, estão envolvidos na defesa do organismo e na busca de um novo ponto de equilíbrio. O capítulo seguinte foi intitulado “Defesa e adaptação dos seres vivos”. Nesse capítulo três, você será levado a conhecer os fundamentos e métodos de estudo do adoecimento e abordar o binômio saúde x doença, sob o aspecto biológico. Desse modo, iremos elencar, com maior completude, os mecanismos de defesa e as estratégias de adaptação do organismo diante de uma agressão. As parasitoses assumem grande importância nos países subdesenvolvidos e naqueles em desenvolvimento, porque sua ocorrência e suas consequências estão diretamente relacionadas às condições de vida da população: condições sanitárias, hábitos alimentares, cultura e acesso a serviços, entre outros. Nesse sentido, o estudo do capítulo quatro, “Alterações celulares e doenças causadas por protozoários”, estará voltado para os fatores biológicos que condicionam a ocorrência e a gravidade das doenças parasitárias. Para tanto, não podemos perder de vista tudo o que já foi estudado sobre agressão, defesa, adaptação e doença. É o momento de articular esses conhecimentos! Começaremos estudando as doenças causadas por protozoários parasitas, que são objeto de estudo desse capítulo. No quinto e último capítulo, “Alterações celulares e doenças causadas por metazoários, imunologia dos tumores e doença autoimune”, abordaremos as alterações celulares e as doenças causadas por metazoários. Assim, chegamos ao momento de estudar as agressões causadas pelos metazoários. A maioria desses seres unicelulares e eucariotos são de vida livre. Entre os metazoários parasitos de humanos, existe uma XII UNIUBE diversidade de habitat e de mecanismos de agressão. Isso determina uma diversidade na resposta imunológica e nas apresentações clínicas. Nesse capítulo cinco, não temos a pretensão de esgotar um tema verdadeiramente extenso. Mas, aqui, você encontrará orientações para seu estudo e informações que lhe ajudarão em seus estudos. Com o objetivo de organizar as alterações celulares e doenças causadas por metazoários, imunologia dos tumores e doença autoimune, apresentaremos, na primeira parte desse capítulo, os protozoários intestinais, seguidos dos protozoários sanguíneos e tissulares. A segunda parte será constituída pelos temas: distúrbios do crescimento e da diferenciação celular, decorrentes de alterações nos mecanismos que regulam estes processos, além da imunologia dos tumores e doenças autoimunes. Como você pode perceber, trata-se de um livro criteriosamente construído, com uma quantidade expressiva de informações. Cabe a você ler, reler, interpretar, refletir, registrar, comparar e articular teoria e prática nas disciplinas Microbiologia e Parasitologia / Patologia e Imunologia. Bons estudos! Aldo Matos Isabel Cristina Rezende Lopes Lilian Margareth Biagioni de Lima Introdução Fundamentos e métodos no adoecimento Capítulo 1 Prezado aluno, o adoecimento é um processo de grande complexidade que, do ponto de vista biológico, envolve uma agressão, a consequente resposta de defesa do organismo e as alterações anatômicas e/ou funcionais decorrentes das interações entre o agente agressor e o organismo agredido. Classicamente, a defesa do organismo refere-se ao campo da Imunologia, as alterações temporárias ou permanentes causadas pela agressão, bem como os agentes agressores, físicos, químicos ou biológicos, são assuntos da Patologia, da Parasitologia (helmintos e protozoários), da Microbiologia (vírus, bactérias e fungos). Além desses aspectos, ainda, nesse capítulo, serão estudados os principais métodos de estudo utilizados na investigação do processo de adoecimento. Assim sendo, esperamos que, ao final desse estudo, você conheça o princípio e a utilização dos métodos e técnicas estudados. Ao finalizar os estudos deste capítulo, esperamos que você seja capaz de: Objetivos 2 UNIUBE 1.1 Fundamentos de Parasitologia e Microbiologia 1.2 Fundamentos de Imunologia 1.3 Introdução ao estudo da Patologia 1.4 Conclusão Esquema • definir Patologia; • indicar os principais métodos de estudo utilizados em Patologia; • explicar o princípio e a utilização do método morfológico; • descrever as técnicas do método morfológico para análise dos processos patológicos em níveis macro e microscópicos; • explicar o princípio e a utilização do método imuno- istoquímico e de suas técnicas; • explicar o princípio e a utilização da Biologia Molecular e de suas técnicas; • conceituar parasitismo; • indicar os principais métodos de estudo aplicados à Parasitologia; • indicar os principais métodos de estudo aplicados à Microbiologia; • explicar o princípio dos métodos de exames parasitológicos; • conceituar Imunologia; • descrever os componentes da resposta imunológica e suas respectivas funções. UNIUBE 3 Vejamos, agora, os conceitos fundamentais e os principais métodos aplicados à Parasitologia. Com certeza, você não sentirá dificuldades. Afinal, quem nunca ouviu falar em amebas, lombrigas ou giárdia? Mesmo porque, os protozoários e os helmintos são temas já abordados nos conteúdos de Zoologia. O que vamos fazer agora é organizar essas informações e complementá-las, focando as doenças parasitárias. Precisamos de início, rever o conceito de parasitismo. Pense aí com você mesmo. Então? Já pensou? Fundamentos de Parasitologia e Microbiologia1.1 Em capítulos anteriores, você encontra o seguinte conceito para parasitismo: [...] em princípio, considerada negativa, esse tipo de interação é caracterizado por espécies que vivem às expensas de outra, atacando-a diretamente e afetando- a desfavoravelmente, porém, dependendo dela para sua sobrevivência [...] (BARNES; RUPPERT, 1996, p.6). Na abordagem das doenças infecciosas, ao falarmos em parasitos, imediatamente pensamos nos vermes e nos protozoários que parasitam o intestino do homem ou de animais. No entanto, bactérias, vírus e fungos causadores de doenças podem também ser considerados parasitos, porque durante a infecção, vivem à custa do organismo infectado. De fato, o ponto crucial na relação de parasitismo é que o parasito depende do hospedeiro para viver. Mas, chegou o momento de ampliarmos esse conceito. Vamos lá! Corriqueiramente, costumamos relacionar os parasitos com doenças intestinais que se manifestam com diarreia e cólica. Porém, só existe doença quando há sinais e sintomas. Em várias Sinais São as alterações fisiológicas ou anatômicas possíveis de serem observadas diretamente, como os sangramentos, ou medidas, como a temperatura corporal na febre ou o ritmo dos batimentos cardíacos. Sintomas São alterações subjetivas, que, portanto, não podem ser medidas, como a dor. 4 UNIUBE pessoas, uma parasitose pode ser assintomática. Dizemos, então, que a pessoa com parasitose está doente, quando ela apresenta sinais e sintomas, como, por exemplo, a diarreia. No caso da pessoa com parasitose não apresentar sinais e sintomas, dizemos que ela está com uma infecção assintomática. Por exemplo, apenas 10% das pessoas infectadas por Entamoeba histolytica, o agente da amebíase, apresentam diarreias. Portanto, estas pessoasestão infectadas e doentes. As demais são assintomáticas e, portanto, estão infectadas, mas não estão doentes. Também vale lembrar que existem parasitos cujo habitat não é o intestino, como por exemplo, o Trypanosoma cruzi, causador da doença de Chagas, que habita fibras musculares lisas, fibras musculares estriadas cardíacas e tecido nervoso. E, afinal, os parasitos existem apenas para nos causar prejuízo? Atualmente, acredita-se que não. Alguns estudos comparando populações com alto índice de parasitoses intestinais a populações pouco parasitadas indicam que ter parasitoses intestinais na infância pode diminuir os riscos da pessoa tornar-se alérgica ou mesmo de desenvolver doenças autoimunes. Infecção Penetração e desenvolvimento ou multiplicação de um agente infeccioso dentro do organismo de humanos ou de animais. Uma doença autoimune ocorre quando nosso sistema de defesa, o sistema imunológico, passa a agredir nosso próprio organismo. Você estudará, nos próximos capítulos, a resposta de defesa do nosso organismo frente a agentes agressores e entenderá melhor como isso acontece. PARADA OBRIGATÓRIA UNIUBE 5 Você consegue imaginar como identificaram a relação entre parasitismo intestinal e menores riscos para alergias e doenças autoimunes? Essa relação foi identificada ao se observar e comprarar a ocorrência de alergias entre populações com altos índices de parasitismo intestinal e populações pouco parasitadas. O que ajudou a definir essa questão foi a aplicação dos recursos da Estatística aos dados coletados na observação. Isso mesmo! A Estatística que você estudou nas etapas anteriores. Do que vimos até agora, podemos concluir que: • infecção é diferente de doença; • nem toda pessoa parasitada está doente; • nem todo parasito habita o intestino; • a infecção por parasitos intestinais pode diminuir os riscos de a pessoa parasitada desenvolver alergias ou doenças autoimunes. Considerando essas informações, as parasitoses não devem ser encaradas apenas como doenças, porque a maioria das pessoas infectadas são hospedeiros assintomáticos. Mas, no estudo das infecções por parasitas, devem ser consideradas, também, suas características epidemiológicas, isto é, o modo de transmissão e a distribuição de casos na população. Esses hospedeiros assintomáticos são dispersores da infecção. Nas parasitoses intestinais, por exemplo, os hospedeiros assintomáticos servem de fonte de contaminação do ambiente (água, solo, alimentos etc.) com formas infectantes que darão início à infecção em outras pessoas que as ingerirem. Também os assintomáticos, uma vez diagnosticados, engrossarão o número de pessoas infectadas e a prevalência de parasitoses intestinais fornece uma ideia do desenvolvimento Prevalência Número de casos de uma doença (novos e antigos), em uma população, em um dado momento. Geralmente, a prevalência é expressa em porcentagem da população atingida pela doença avaliada. 6 UNIUBE Estudaremos algumas doenças causadas por protozoários e outras causadas por vermes em outros capítulos mais adiante. E para que estudamos as parasitoses, afinal? Estudamos essas doenças para fazer prevenção da infecção, para diminuir sua prevalência e para entender porque algumas pessoas infectadas desenvolvem doença e outras não. socioeconômico da comunidade. Quanto menos desenvolvida for a comunidade, isto é, quanto mais precárias forem as condições de vida das pessoas, maior a prevalência de parasitoses intestinais. Para a maioria dos protozoários intestinais, excetuando-se os coccídeos, a forma infectante que sai nas fezes é o cisto. Para a maioria dos vermes, a forma infectante que sai nas fezes são os ovos, exceto para os poucos vermes que penetram por meio da pele e mucosas, cuja forma infectante são as larvas. SAIBA MAIS Uma das ações que compõem as estratégias para fazer prevenção e diminuir a prevalência é diagnosticar precocemente a infecção, quer seja sintomática ou assintomática. Para as parasitoses intestinais, podemos usar o método de exames parasitológicos de fezes, nos quais observamos amostras de fezes ao microscópio em busca de formas evolutivas dos parasitos intestinais, que porventura tenham sido evacuadas. O Quadro 1, a seguir, apresenta um resumo das principais técnicas empregadas para esse fim. UNIUBE 7 Técnica Princípio Formas evoluti-vas que detecta Utilização Direto ou “a fresco” Visualização da amos- tra bruta de fezes sem nenhum procedimento especial Trofozoítos de protozoários Diagnóstico de pro- tozooses intestinais Método Hoffman Pons e Janer ou HPJ Sedimentação espon- tânea das formas evo- lutivas Cistos de proto- zoários e ovos de helmintos Diagnóstico de pro- tozooses, helminto- ses intestinais Wiilis Flutuação das formas evolutivas em solução saturada de sal ou de açúcar Ovos de helmin- tos Diagnóstico de hel- mintoses intestinais Faust Centrífuga-flutuação das formas evolutivas em solução de sulfato de zinco a 33% Cistos de proto- zoários Diagnóstico de pro- tozooses intestinais Kato-Katz Quantificação da carga parasitária de vermes Ovos de vermes Diagnóstico de hel- mintoses intestinais e estimativa da po- pulação de vermes no intestino do hos- pedeiro Baerman-Moraes Termotropismo e hidro- tropismo das larvas de vermes Larvas de helmin- tos Diagnóstico de hel- mintoses nas quais podem ser encon- tradas larvas nas fezes, especialmen- te estrongiloidíase Quadro 1: Resumo as principais técnicas de exame parasitológico de fezes Para encontrar trofozoítos de protozoários parasitos intestinais, devemos utilizar o Método Direto, também conhecido como Exame a Fresco. Nesse método, examinam-se ao microscópio amostras de fezes recém-eliminadas, ou seja, com menos de uma hora de evacuadas. Após esse prazo, os trofozoítos morrem e não serão mais encontrados. 8 UNIUBE Para diagnosticar as doenças parasitárias cujo agente encontra-se nos tecidos, podemos realizar biópsias, processadas com técnicas de imunoistoquímica, que serão descritas ao longo desse capítulo. Quando o parasito mantiver-se em grande quantidade na corrente sanguínea, como no caso da fase aguda da doença de Chagas, podemos proceder ao exame direto, ao microscópio, de uma gota do sangue periférico, recém-coletado. Também, é possível confeccionar esfregaços de sangue, em lâminas de microscopia, corando pelos corantes Leishman ou Giemsa que coram e evidenciam a presença dos parasitos no sangue. Ainda, em casos de parasitos que habitam o sangue dos tecidos, ou mesmo de parasitos intestinais cuja aplicação do exame parasitológico de fezes tenha limitações, podemos usar técnicas imunológicas, nas quais são detectados anticorpos contra o parasito em amostras de sangue do hospedeiro. Para o estudo dos fungos e das bactérias, são utilizadas as técnicas de cultura, para seu isolamento e crescimento aliadas à confecção de lâminas coradas por diferentes técnicas, a fim de estudar sua morfologia e propriedades tintoriais. Já os vírus, seres extremamente pequenos e parasitos intracelulares obrigatórios, exigem a utilização de microscopia eletrônica para estudar sua morfologia. Outras técnicas, como a dosagem dos metabólitos por meio de métodos bioquímicos e também as técnicas de análise de biologia molecular, estas já apresentadas nesse capítulo, podem ser utilizadas no estudo das agressões causadas por fungos, bactérias e vírus. A identificação das bactérias é inicialmente baseada em sua morfologia e na coloração de Gram. O principal corante na coloração de Gram é o cristal violeta, o qual pode penetrar na parede bacteriana. UNIUBE 9 As bactérias que retêm o cristal violeta na sua parede são classificadas como gram-positivas e aquelas que não o retêm, são gram-negativas. De forma semelhante ao estudo das bactérias, para estudar a morfologia dos fungos são realizadas culturas e confeccionadas lâminas coradas. Os meios para a culturae os corantes utilizados variam de acordo com a espécie de fungo ou de bactéria que se estuda. Caro estudante, os métodos parasitológicos de estudo servem para identificar o agente de uma infecção, mas, como já foi mencionado, nem todas as pessoas infectadas estão doentes. Para entender por que algumas pessoas infectadas desenvolvem sinais e sintomas e outras não, estudam-se a resposta de defesa contra o agressor e as características peculiares do agente infeccioso. As características peculiares do agente podem ser estudadas pelos métodos apresentados nesses capítulos, tais como a análise de suas proteínas de superfície e das suas enzimas e, mais recentemente, por meio das técnicas de Biologia molecular. Ao longo do estudo da Agressão e da Defesa, você perceberá o quanto a relação entre o parasito e o hospedeiro é importante para definir a evolução de uma infecção para cura, infecção assintomática, doença aguda, doença crônica ou morte. Em um primeiro olhar, observando esses métodos de estudos aplicados à parasitologia, podemos ser seduzidos por toda essa tecnologia. No entanto, veremos mais adiante que também existe o olhar para as doenças parasitárias à luz das condições de vida, que configuram fatores de risco para ocorrerem parasitoses. Essa última abordagem faz parte da realidade de muitos brasileiros e permitirá a contextualização dos temas de parasitoses, quando você, futuro professor, preparar sua aula. 10 UNIUBE Imunologia, do latim: immunitas significa “isento de taxa”, ou melhor, livre ou isento de doença. Apesar de o conceito de contágio e a presença de germes serem conhecidos desde 1546, foi somente com o experimento do médico inglês Edward Jenner, em 1798, que a Imunologia ficou realmente conhecida. Observando a evolução da varíola, doença causada por vírus que, na época, estava associada à alta morbidade e mortalidade, principalmente de crianças, o médico observou que os indivíduos que trabalhavam em fazendas e que tinham contato com a varíola bovina (ordenhadores, por exemplo), desenvolviam lesões locais, nas mãos e nos pulsos, porém, não desenvolviam a doença humana. Em seu experimento, revolucionário na época, porém muito condenado e perigoso, inoculou material obtido da lesão da mão dos ordenhadores (pus da lesão) no braço de um menino de somente oito anos. Após dois meses, inoculou no mesmo menino, material proveniente de um paciente com varíola humana, e o menino desenvolveu apenas ferida local. Jenner concluiu, então, que a exposição do menino à varíola bovina tinha concedido proteção, ou imunidade à infecção pela forma humana da doença, iniciando então os estudos da Imunologia, ou o estudo da resposta do organismo a substâncias estranhas. 1.2.1 Funções do sistema imune Os estudos atuais mostram que o sistema imunológico atua em nosso organismo de diversas maneiras, sendo várias as funções por ele desempenhadas, como: • combate aos microrganismos invasores; • limpeza: retirada de células mortas, renovação de tecidos; • rejeição a transfusões sanguíneas, transplantes e enxertos; Fundamentos de Imunologia1.2 UNIUBE 11 • desenvolvimento de memória imunológica: importante na prática da vacinação, por exemplo; • ação ativa contra as células alteradas que diariamente surgem em nosso corpo como resultado de mitoses anormais e que se não forem destruídas ou retiradas podem originar tumores. Para desempenhar tais funções, o sistema imunológico é formado pelas células de defesa e pelos órgãos linfoides. Vamos, então, conhecer cada um desses componentes. As células que compõem o sistema imune agem como um exército, em que cada função é desempenhada por componentes específicos, tais como: • leucócitos ou glóbulos brancos do sangue: divididos em subpopulações com funções próprias; • linfócitos: são as principais células do sistema imunológico e correspondem de 20 a 30% dos glóbulos brancos totais. Morfologicamente são ovoides com núcleo grande e citoplasma abundante; Veja uma imagem de um linfócito no site: http://www.alunosonline.com.br/biologia/sangue.html PESQUISANDO NA WEB • linfócitos T ou “timo-dependentes”: são muito importantes e entre as suas inúmeras funções, podemos citar a ativação da resposta imunocelular, pela participação do Linfócito T auxiliar (Ta); ativação de outros linfócitos, como o Linfócito T citotóxico (Tc), Linfócito T reguladores, cuja principal função é inibir a resposta imunológica, linfócitos Th17, secretores de IL-17, envolvidos na defesa contra microrganismos e na mediação da inflamação, e outros tipos celulares, como os macrófagos, por exemplo; controlam a resposta imune: responsáveis pela supressão da produção de anticorpos 12 UNIUBE • neutrófilos ou neutrófilos segmentados: são os mais abun- dantes e correspondem a 60% dos leucócitos totais. Entre as suas funções, estão a fagocitose do invasor, especialmente bactérias, e a participação no processo inflamatório, com a formação do “pus”. Na morfologia, apresenta grânulos no citoplasma e núcleo com vários lóbulos (ou segmentos); após a destruição do invasor; são capazes de desenvolver células de memória; • linfócito B: associados à resposta imune-humoral; entre as suas funções estão a produção de anticorpos específicos contra diversos antígenos e a capacidade de desenvolver células de memória; • anticorpo: proteína plasmática, secretada pelas células B, que medeia a imunidade humoral, ligando-se aos antígenos e desencadeando mecanismos efetores que os eliminam; • antígeno: molécula capaz de desencadear resposta imunológica; • linfócito NK, natural killer, ou, ainda, matadoras naturais: participam da imunidade inata, além de estarem associadas à destruição de células tumorais, células infectadas por vírus, entre outras; • monócitos: correspondem a, aproximadamente, 3% dos leucó- citos totais; são responsáveis por fagocitarem organismos invasores, além de serem precursoras dos macrófagos. Morfologicamente, são agranulares com núcleo grande em forma de ferradura; Veja uma imagem de um monócito no site: http://www.alunosonline.com.br/biologia/sangue.html PESQUISANDO NA WEB Veja uma imagem de um neutrófilo no site: http://www.alunosonline.com.br/biologia/sangue.html PESQUISANDO NA WEB UNIUBE 13 • eosinófilos: correspondem a 2% dos totais e estão presentes nos tratos digestivo e respiratório, sendo frequentes nos processos parasitários e alérgicos. São células que apresentam grânulos que se coram pela eosina, ficando com aspecto bem característico; Veja uma imagem de um eosinófilo no site: http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Eosinophil.jpg PESQUISANDO NA WEB • basófilos: somente 1% dos leucócitos totais participa da reação do choque anafilático. São células com grânulos muito grandes, compostos de histamina e heparina, e que chegam a “mascarar” o núcleo. Veja uma imagem de um basófilo no site: http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:PBBasophil.jpg PESQUISANDO NA WEB Além das células descritas anteriormente, outros tipos celulares do sistema imune estão presentes nos tecidos. São eles: • macrófagos: originadas a partir dos monócitos que migraram para o tecido conjuntivo. São bastante importantes, participando da imunidade inata por meio da fagocitose e destruição de microrganismos invasores. Participam da apresentação do invasor, necessária para a ativação da resposta imune adaptativa, além de serem responsáveis pela limpeza de tecidos necrosados, remoção de restos celulares, entre outros. Possuem formato ameboide por estarem constantemente emitindo pseudópodes; 14 UNIUBE Veja uma imagem de um macrófago no site: http://www.icb.usp.br/mol/4-19macrofago3.html PESQUISANDO NA WEB • mastócitos: células que armazenam substâncias da inflamação, como histamina e heparina, participando assim das reações alérgicas e de hipersensibilidade, como, por exemplo, na asma, picada de insetos, reação à penicilina etc. Veja uma imagem de um mastócito no site: http://www.virtual.epm.br/material/histologia/histo/fig15.htmPESQUISANDO NA WEB Os órgãos linfoides são locais onde ocorre a produção de células que vão agir no combate aos agentes externos. Podem ser: • primários: naqueles onde ocorrem as principais fases do amadurecimento dos linfócitos. Exemplo: Timo (linfócito T) e Medula óssea (linfócito B). • secundários: participam da resposta imune. São locais onde as células terminam o seu amadurecimento e vão estar prontas para agir (ativação final das células). Exemplos: – linfonodos: pequenos e localizados no trajeto dos vasos linfáticos (axila, pescoço, inguinais), filtram a linfa, removem vírus, bactérias, células mortas, além de estarem associados à maturação de linfócitos T e B; – tonsilas: localizadas na cavidade bucal, estão associadas à proteção da mucosa; UNIUBE 15 – baço: local de maturação e liberação dos linfócitos T e B, além de promover limpeza do organismo, destruição de hemácias velhas, entre outras. O sistema imunológico compreende todos os mecanismos pelos quais um organismo multicelular se defende de invasores externos, como bactérias, vírus, protozoários, fungos. Existem dois tipos de mecanismos de defesa: os inatos ou não específicos e o sistema imunitário adaptativo. Iremos estudar cada um deles. 1.2.2 Mecanismos de defesa Você já tomou alguma vacina? Sabe a sua ação no seu organismo? Pois bem, vacinação é uma estratégia desenvolvida a partir de conhecimentos no campo da imunologia. Vamos, então, conhecer um pouco sobre a resposta imune. A resposta imune é uma sequência de eventos desencadeada por um corpo estranho (antígeno), com o objetivo de eliminá-lo. Para que um antígeno possa ser destruído, é necessário que ocorra a ligação deste ao anticorpo específico (reação Ag-Ac). Os anticorpos são capazes de reconhecerem uma grande diversidade de antígenos. A resposta imune pode ser didaticamente dividida em resposta imune inata e resposta imune adaptativa. Vamos, então, entender o que elas significam e realizam. 1.2.2.1 Resposta imune inata É a primeira linha de defesa contra os microrganismos invasores. Está presente desde o nosso nascimento. Ela é muito importante, visto que vivemos em contato constante com eles (pense em uma pessoa 16 UNIUBE espirrando em um elevador lotado, por exemplo), muitas vezes ela consegue eliminar esses micróbios e quando não consegue eliminá-los, os mesmos são capazes de estimular a resposta adaptativa. São componentes da resposta imune inata: • as barreiras naturais do corpo: superfície corporal (pele), pelos corporais, sobrancelhas, unhas, cutícula, lágrima, saliva, muco, pH do estômago, flora bacteriana normal entre outros, todos impedindo ou dificultando a invasão do organismo; • as células do sistema imune: fagócitos como neutrófilos, macró- fagos, linfócitos NK, não dependem de contato prévio (não precisam ser ativados), para atacar os microrganismos patogênicos, porém agem sempre da mesma maneira independente da natureza do patógeno (vírus, bactérias, mais ou menos virulentos) e, também, não desenvolvem memória imunológica; • as citocinas: produzidas após a reação antígeno-anticorpo. As principais citocinas da resposta imune inata são: • Fator de Necrose Tumoral (TNF): principal mediador da resposta imune à inflamação. Atua principalmente contra bactérias gram- negativas. Produzido por fagócitos mononucleares ativados. Exis- tem dois tipos: TNF tipo I e TNF tipo II. Principal função está ligada ao recrutamento e à ativação de neutrófilos e monócitos para o local da infecção; • Interferons tipo 1: produzidos por fagócitos mononucleares, partici- pam da resposta imune inata contra vírus. Suas principais funções são inibir a replicação viral e aumentar a expressão de moléculas do complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC classe I); • IL-1: produzida principalmente por macrófagos, células endoteliais e algumas células epiteliais. Participa da resposta inflamatória por meio da indução à febre por ação no hipotálamo, síntese de proteínas de fase aguda e no processo de migração de neutrófilos; • IL- 6: produzida principalmente por macrófagos, células endoteliais e células T. Participam da síntese hepática de proteínas de fase aguda e atuam na proliferação de células B; UNIUBE 17 • IL-12: produzida principalmente por macrófagos e células dendríticas. Atuam na diferenciação de células T e na produção de interferon; • IL-15 = produzida principalmente por macrófagos. Estimula a proliferação de células NK e células T de memória (Células TCD8+); • IL-18: produzida principalmente por macrófagos. Participa da produção de interferon; • Quimiocinas: família de citocinas homólogas. As principais células produtoras são os macrófagos, as células endoteliais, as células T, os fibroblastos e as plaquetas. Sua principal função é estimular o movimento e a migração de leucócitos para o local da infecção, quimiotaxia. 1.2.2.2 Resposta imune adaptativa A imunidade inata, muitas vezes não é eficiente o bastante para destruir o microrganismo invasor; porém, ela é capaz de ativar a resposta imune adaptativa para que essa entre em ação. Apesar de ser mais lenta, ela é específica, mais potente e desenvolve memória imunológica, concedendo proteção mais duradoura. Participam da resposta imune adaptativa: • sistema imune celular: com a participação dos linfócitos T (T-auxiliar, T-citotóxico); • sistema imune humoral: participação dos linfócitos B e produção dos anticorpos específicos; • citocinas: controlam a diferenciação e proliferação dos linfócitos. As principais citocinas da resposta imune adaptativa são: • Interleucina-2 (IL-2): produzida principalmente por células T, função de estimular a apoptose, proliferação e ativação de células NK e células B; • Interleucina-4 (IL-4): produzida principalmente por células T CD4+ e mastócitos. Produção de IgE, proliferação de macrófagos, diferenciação TH2; 18 UNIUBE • Interleucina-5 (IL-5): produzida principalmente por células T CD4+. Produção e ativação de eosinófilos, produção de IgA e proliferação de células B; • Interleucina-13 (IL-13): produzida principalmente por células T CD4+. Produção de muco pelas células epiteliais. Inibe a ativação dos macrófagos; • Fator de crescimento e transformação - β (TGF- β): produzida principalmente por células T, macrófagos e outros tipos celulares. Inibe a proliferação e função efetora das células T, inibe a ativação de macrófagos. Produção de IgA; • Interferon - γ (INF- γ): produzido por células T (TH1, Células TCD8+, células NK). Aumenta função microbicida de macrófagos. Atua na resposta TH1 e aumenta a expressão de moléculas MHC de classe I e classe II; • Linfotoxina (LT): produzida por células T, responsável pela ativação de neutrófilos. A resposta imune adaptativa pode ser dividida em resposta imune humoral em que são produzidos anticorpos pela ativação de linfócitos B e resposta imune mediada por células, em que predominam linfócitos TCD8+ citotóxicos. A resposta imune citotóxica é favorecida pela produção de citocinas Th1 (IL-2, TNF, INF-γ), e a resposta imune humoral é influenciada pela produção de citocinas Th2 (IL-4, IL-5, IL-10). A resposta Th1 está relacionada à defesa contra protozoários, bactérias intracelulares e vírus, enquanto a resposta Th2 é mais efetiva contra os helmintos e bactérias extracelulares (Quadro 2). UNIUBE 19 Característica Imunidade Inata Imunidade Adaptativa Origem Desde o nascimento Entra em ação quando a ina-ta não é suficiente Constituintes Barreiras naturais do corpo (pele, pelos, saliva...) Células: macrófagos, linfóci- tos NK, neutrófilos Linfócitos T e B Sistema Imune Celular e Hu- moral Ação Imediata, rápida Lenta Especificidade Inespecíficas (agem sempre da mesma forma) Específicas Memória Sem memória imunológica Possuem memória imunoló-gica Quadro 2: Tipos de imunidade e suas principais características 1.2.3 Defesas artificiais Existem algumas maneiras de se promover a saúde,ou seja, induzir o sistema imunológico a trabalhar sem que seja preciso ficar doente. Uma prática bastante difundida e estimulada é a vacinação. Na vacinação, são injetados, no organismo, vírus atenuados ou parte desses vírus, uma toxina bacteriana ou mesmo bactérias mortas, para que o organismo reconheça o invasor e trabalhe para produzir anticorpos específicos sem que seja preciso adoecer. Como o organismo vai trabalhar para produzir anticorpos específicos, dizemos que a vacinação é um tipo de imunização ativa. Porém, imagine uma pessoa que levou uma picada de uma cobra venenosa. Essa é uma situação de emergência, em que não dá para esperar que o organismo trabalhe até que sejam produzidos os anticorpos específicos, pois cada minuto é importante. Nesse caso, a pessoa tem que ser tratada o mais rápido possível, com os anticorpos prontos, contra o veneno daquela cobra, ou seja, tem que ser inoculada com o soro. Como nesse caso o organismo já recebe os anticorpos prontos, dizemos que se trata de uma imunização passiva. 20 UNIUBE 1.2.4 Métodos utilizados em Imunologia para diagnóstico de doenças Os testes ou imunoensaios são técnicas desenvolvidas a fim de detectar e quantificar antígenos e anticorpos, ou outras substâncias antigênicas. Nas últimas décadas, houve grande avanço nos diagnósticos sorológicos, que se tornaram mais rápidos, simples de serem realizados e cada vez mais específicos. Citaremos agora alguns testes sorológicos utilizados em laboratório de análises clínicas: • Imunodifusão: nesta técnica, o antígeno ou o anticorpo permanece fixo ao suporte e o outro se difunde até a precipitação completa; • Imunoeletroforese: combinação de duas técnicas: eletroforese em gel e imunodifusão. Nesta técnica, a identificação da substância estudada é feita a partir de suas propriedades eletroforéticas e coeficientes de difusão; • Ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA): método utilizado para quantificação de antígeno imobilizado em superfície sólida pelo uso de anticorpo específico ligado a uma enzima de maneira covalente; • Imunofluorescência: técnica em que uma molécula pode ser detectada por meio da utilização de um anticorpo marcado com uma sonda fluorescente (fluoresceína). Baseia-se na capacidade de as moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder a reatividade específica com o antígeno; • Reação em cadeia da polimerase (PCR): método em que podemos copiar e ampliar sequências específicas de DNA. Utilizado em Biologia Molecular. Baseia-se na utilização de sequências de oligonucleotídeos complementares às extremidades das sequências do DNA a ser ampliado; • Western blot: técnica analítica em que os anticorpos são usados para detectar a presença de uma ligação do antígeno a uma matriz sólida; • Southern blot: técnica usada para determinar a organização do DNA genômico na presença de um gene em particular; UNIUBE 21 • Nefelometria: técnica sensível para quantificar as reações de precipitação entre antígenos e anticorpos; • Turbidimetria: técnica utilizada para quantificação de antígenos e anticorpos, por meio da quantidade de luz transmitida em relação a incidente; • Citometria de fluxo: identifica células por meio de sinais gerados pelas células em suspensão quando interceptadas por um feixe de luz. Terminamos aqui o nosso estudo sobre fundamentos da Imunologia. Daremos continuidade, abordando agora a Patologia. Introdução ao estudo da Patologia1.3 Prezado aluno, você sabe o que é patologia? Etimologicamente, o termo patologia significa o estudo das doenças (do gr. pathos=doença, sofrimento, e logos= estudo, doutrina). Segundo Brasileiro (2006, p.12), a Patologia pode ser conceituada como a “ciência que estuda as causas das doenças, os mecanismos que as produzem, as sedes e as alterações morfológicas e funcionais que apresentam”. Assim como toda ciência, a Patologia tem seus métodos de estudo, sendo importante para o estudante ou o profissional da área biológica, o conhecimento básico dos métodos de estudo utilizados em Patologia. 1.3.1 Métodos de estudo em Patologia Você utiliza algum método para os seus estudos? Você acha importante a utilização de métodos para estudar? 22 UNIUBE Quadro 3: Métodos de estudo em Patologia: princípios, técnicas e utilização Método Princípio Técnica Utilização Morfológico Observação e aná- lise da morfologia macroscópica, dos órgãos ou parte deles, e microscó- pica, de células ou de tecidos Citopatologia Diagnóstico de neo- plasias malignas e lesões precursoras e detecção de agen- tes infecciosos e parasitários em nível celular Anatomopa- tologia Diagnóstico de le- sões ou processos patológicos no nível macroscópico, ou seja, do órgão ou parte dele e micros- cópico, ou seja, do tecido Prezado aluno, a utilização de método é importante em todas as áreas do conhecimento. A Patologia, não podendo ser diferente, também se utiliza de métodos e de suas técnicas que colaboram no estudo das doenças. Como os métodos de estudo em Patologia são inúmeros, iniciaremos nossos estudos indicando resumidamente, no Quadro 3, a seguir, os métodos convencionais e técnicas de maior aplicação para investigação ou para diagnóstico das doenças, seus princípios e utilização. UNIUBE 23 Imunocitoquímica/ Imunoistoquímica Conjunto de pro- cedimentos nos quais se utilizam anticorpos como reagentes espe- cíficos para de- tecção de antí- genos presentes em células ou tecidos, respecti- vamente Imunofluo- rescência Detecção de antí- geno com a utiliza- ção de anticorpos marcados com fluo- resceína Imunoenzi- mática Detecção de antí- geno com a utiliza- ção de anticorpos marcados com enzima Cultura celular Consiste na manutenção e multiplicação in vitro ou in vivo das células vivas – Análise do metabo- lismo e do compor- tamento celular Citometria Consiste na determinação quantitativa de componentes celulares Citofotome- tria ou Cito- metria estática Determinação do DNA nuclear em le- sões proliferativas, como nas neopla- sias malignas, em células coradas em esfregaços ou em cortes histológicos Citometria de fluxo Determinação do conteúdo de DNA celular nas neopla- sias e % de células que estão em mul- tiplicação ativa em células em suspen- são tratadas com fluorocromos 24 UNIUBE Morfometria Consiste na reali- zação de medidas das dimensões dos órgãos ou parte deles, tecidos, cé- lulas ou de seus constituintes, por meio da utilização de oculares mi- crometradas ou de outros recursos Macroscopia Estudos quantitati- vos sobre os mais di- versos aspectos das lesões ou doenças em órgãos ou partes deles Microscopia Estudos quantitati- vos sobre os mais diversos aspectos das lesões ou doen- ças em tecidos ou células Autorradio- grafia Procedimento que permite a identifica- ção de elementos radioativos incorpo- rados às células ou tecidos – Estudo dos distúr- bios do crescimento e da diferenciação celular, como ocorre nas neoplasias Biologia Mole- cular Procedimentos que permitem identificar qualitativamente e quantitativamente as macromoléculas Hibridação Molecular Identificação da se- quência de DNA con- tida em uma amostra (célula ou tecido) Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Identificação e ampli- ficação de sequên- cias específicas de DNA em uma amos- tra (célula ou tecido) Técnicas de Análise em Larga Escala - Projeto Ge- noma Identificação das várias alterações genéticas respon- sáveis pelos casos de maior incidência de tipos de câncer; doenças infecciosas e genéticas UNIUBE 25 Fluorocromos São substâncias químicas fluorescentes que, conjugadas à amostra, permitem a sua visualização utilizando-se a microscopia de fluorescência. Neoplasias (neo=novo; plasia=formação) nova formação tecidual, proliferação celular anormal, sem controle e autônoma, com redução ou perda da capacidadede se diferenciar, em consequência de alterações nos genes que regulam o crescimento e a diferenciação celular. SAIBA MAIS A seguir, faremos uma breve abordagem sobre os métodos mais utilizados para a pesquisa e o diagnóstico. 1.3.1.1 Método morfológico Segundo Brasileiro et al (2004), o estudo macro e microscópico das doenças constitui a forma tradicional de análise em Patologia, tanto para investigação quanto para diagnóstico. Os exames utilizados na análise de células, tecidos ou órgãos, são, respectivamente: • exames citológicos; • exames anatomopatológicos. • Citopatologia: consiste na análise da forma das células obtidas a partir de métodos esfoliativos (descamação natural, raspados, secreções, líquidos) e aspirativos (punções de órgãos). A Citologia foi consagrada por George Papanicolaou que iniciou suas pesquisas sobre Métodos esfoliativos Técnicas que permitem a retirada de células de superfícies orgânicas, como mucosas ou epitélios, por descamação, raspagem, entre outras. 26 UNIUBE Figura 1: Citologia Papanicolaou. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. Locais de obtenção do material para análise citológica: • raspados (pele ou mucosas como a cervicovaginal); • secreções (árvore traqueobrônquica, cistos, tubo digestório); • líquidos (serosas, urina, líquor, escarro, entre outros); citologia esfoliativa em 1917, tendo estabelecido, em 1928, a citologia diagnóstica e o diagnóstico de carcinoma uterino a partir da secreção vaginal de mulheres, constituindo-se em um importante meio de diagnóstico de neoplasias e de detecção de agentes infecciosos e/ou parasitários. Seu emprego mais comum é o popularmente chamado de “exame preventivo” ou “Papanicolaou” (Figura 1), que visa à detecção de formas iniciais do câncer e de lesões pré-cancerosas do colo uterino. Papanicolaou Técnica de obtenção de células da região cérvico-vaginal, por raspagem. UNIUBE 27 • punção aspirativa com agulha fina (lesões nodulares de tireoide, mama, linfonodos, entre outras). Formas de obtenção das amostras para análise citológica: • aspirados com agulha fina (PAAF); • impressão de tecidos sólidos (imprint), ver Figura 4; • técnica esfoliativa (esfoliação); • ultrassonografia. Segundo Montenegro e Franco (1999, p. 286), os exames citológicos podem ser divididos em dois grandes grupos: citologia aspirativa e citologia esfoliativa. A citologia aspirativa consiste na aspiração de células de uma lesão de órgãos palpáveis, como mama, tiroide, gânglios linfáticos, próstata, glândula salivar, entre outros. Também denominada de Punção Aspirativa por Agulha Fina (PAAF), essa técnica de PAAF, empregada a partir de 1920, tornou-se popular nos anos 70, e consiste no isolamento manual do campo a ser aspirado e na introdução de uma agulha fina (20, 23 ou 25 mm comprimento ou 0,6 mm diâmetro) acoplada a uma seringa estéril de 10 a 20 ml (Figura 2) podendo ser utilizada agulha de calibre maior (40 x 12 mm), quando tratar-se de neoplasias de consistência dura. Imprint Citologia de impressão, método de obtenção de células por contato direto da área do material (biópsia) a ser analisado com uma superfície, por exemplo, lâminas de citologia. Citologia aspirativa Estudo das alterações morfológicas de células obtidas de uma região apalpável/ superficial do organismo utilizando seringa e agulha, ou seja, por aspiração. Citologia esfoliativa Estudo das alterações morfológicas de células obtidas pelo método esfoliativo. 28 UNIUBE Figura 2: Técnica de PAAF. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. O espécime obtido na aspiração é colocado sobre a lâmina seca e limpa, confeccionando-se o esfregaço (Figura 3), e este deve ser fixado para preservação das estruturas celulares. O fixador mais empregado é o álcool etílico a 95%. Figura 3: Esfregaço. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. Esfregaço Técnica utilizada para matéria orgânica, por exemplo, células obtidas por esfoliação ou punção, que consiste em espalhar uma gota deste material sobre uma lâmina de vidro formando uma fina película para uma melhor observação à microscopia. Fixador Substância química natural ou sintética que age paralisando as reações químicas celulares preservando, desta forma, as estruturas teciduais para a sua análise. UNIUBE 29 Figura 4: Imprint de linfonodo para pesquisa de metástase de câncer de mama. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. Observe a Figura 4: Já a citologia esfoliativa é o estudo de células que são raspadas com equipamentos como os da Figura 5, a seguir, ou que descamam naturalmente de uma superfície (Figura 6). Figura 5: Equipamentos de coleta utilizados na esfoliação. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. 30 UNIUBE Figura 6: Coleta de material por esfoliação. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. Compreende a citologia cérvico-vaginal e a citologia de líquidos (cavidades, lavados, urina) e escarro. Com a amostra de células obtidas, faz-se um esfregaço conforme demonstrado anteriormente (Figura 3). No caso de exames colpocitológicos, para detecção de câncer de colo uterino, o esfregaço deve ser fixado, ainda úmido, em álcool etílico a 95%. Para a preservação da estrutura celular e conservação dos detalhes citológicos, os esfregaços devem ser imediatamente fixados, podendo ser utilizados o álcool etílico ou metílico. A escolha depende do tipo de material, do objeto de estudo e do tipo de coloração a ser utilizada (MAGALHÃES, 2001). IMPORTANTE! Exame colpocitológico ou exame de Papanicolaou Método utilizado para analisar e detectar as lesões cervicais, ou seja, do colo uterino. UNIUBE 31 Colorações em citologia Corantes são substâncias químicas cujos radicais ácidos ou básicos de seus componentes reagem com os radicais ácidos ou básicos dos tecidos com a emissão de uma cor, utilizadas para a observação e análise das células ou de estruturas teciduais à microscopia. Os corantes Papanicolaou e Papanicolaou modificado (Shorr) (Figura 7) são os mais utilizados em citologia humana, permitindo uma análise mais precisa do núcleo e nucléolo, facilitando a observação das alterações morfológicas nucleares, sugestivas de neoplasias. SAIBA MAIS Figura 7: Citologia: células colunares. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. • Anatomopatologia, segundo Brasileiro et al. (2004), consiste na análise macros- cópica (Figura 8) ou microscópica (his- tológica) (Figura 9), das alterações morfo- lógicas presentes nas amostras obtidas para diagnóstico e/ou tratamento. Anatomopatologia Estudo das alterações morfológicas dos órgãos ou tecidos. 32 UNIUBE Figura 8: Aterosclerose. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. Figura 9: Tecido pulmonar com pigmentação de hemossiderina (seta). Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. Formas de obtenção das amostras: • biópsias: (bios: vida; opsis: ver) retirada de amostras da lesão para diagnóstico; dentre elas, temos as endoscópicas, as cureta-gens, por agulha, por trepanação ou dirigidas por aparelhos especiais, como: colposcopia, ultrassonografia e biópsia cerebral estereotáxica; • peças cirúrgicas: que podem ser simples, como a retirada de um único órgão, ou composta/radicais, em que, além do órgão principal, UNIUBE 33 também são ressecados outros órgãos importantes no diagnóstico, tais como os linfonodos, por exemplo; • punção–biópsia: realizada em lesões nodulares (viscerais), neces- sitando muitas vezes do auxílio de equipamentos especiais, como raios-X, ultrassom, tomografia, entre outros; • necropsia: (nekros: morto; opsis: ver) é o exame anatomopatoló- gico post-mortem sistemático dos órgãos ou parte deles, de seres humanos ou animais, para determinar a causa da morte e conhecer as lesões e doenças existentes na espécie analisada. Serve como valioso instrumento de pesquisa e excelente método de ensino- aprendizagem. São de grande interesse em Saúde Pública, pois tornamas estatísticas sobre as doenças mais confiáveis, e como fonte de órgãos para transplantes. As biópsias são denominadas ablativas ou excisionais quando se retira (extirpa) toda a lesão. A biópsia é incisional quando se retira apenas parte da lesão. Autópsia (auto: próprio, opsis: ver) é o exame post-mortem sistemático dos órgãos (de seres humanos) ou parte deles, para determinar a causa da morte e conhecer as lesões e as doenças existentes. REGISTRANDO Independentemente da forma de obtenção do material a ser colhido, alguns cuidados devem ser tomados, para um diagnóstico correto. As amostras obtidas, depois de fixadas, serão analisadas macros- copicamente pelo patologista, que obterá fragmentos representativos destes espécimes, para o seu estudo microscópico ou histopatológico. O exame macroscópico consiste na análise de características que são observadas a olho nu, sem necessitar de equipamentos ópticos. As características que podem ser observadas a olho nu são: cor, consistência, textura, densidade, dimensões, tamanho, peso, superfície de corte e do órgão, entre outros aspectos (Figura 10). 34 UNIUBE Figura 10: Esteatose hepática. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. Para o exame microscópico (histopatológico), as amostras, uma vez fixadas, devem ser desidratadas e diafanizadas, passando por concentrações progressivas de álcool e xilol e incluídas em parafina (Figura 11), o que permite cortes de 3µm a 5µm em um aparelho chamado micrótomo (Figura 12). Figura 11: Blocos de parafina. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. UNIUBE 35 Figura 12: Micrótomo rotativo. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. Os cortes, após serem desparafinizados, são corados pela coloração hematoxilina-eosina (HE), coloração de rotina e universal. Em algumas situações, além da coloração de rotina, podem-se utilizar colorações especiais. PARADA OBRIGATÓRIA O exame microscópico permite avaliar as alterações no tecido, ao nível celular (Figura 13). 36 UNIUBE Técnica de congelação: É uma técnica de diagnóstico, realizada durante atos cirúrgicos, que consiste em: 1. retirar a amostra que se deseja analisar (biópsia) (procedimento feito no centro cirúrgico); 2. envolver a amostra em uma gaze embebida em soro fisiológico; 3. levar a amostra envolta em gaze imediatamente ao laboratório de Anatomia Patológica para ser analisada; 4. congelar a amostra no aparelho denominado criostato, aparelho com temperatura interna em torno de -20ºC (Figura 14); AMPLIANDO O CONHECIMENTO Figura 13: Tecido hepático com hiperemia. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. UNIUBE 37 Figura 14: Aparelho criostato para exame de congelação. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. 1.3.1.2 Imunoistoquímica Segundo Brasileiro (2004, p. 9), imunoisto- química é o conjunto de procedimentos que utiliza anticorpos como reagentes específicos para detecção de antígenos ou elementos estranhos às células (imunocitoquímica) ou aos tecidos (imunoistoquímica), como os vírus, fungos, bactérias entre outros agentes infecciosos presentes em células ou tecidos. 5. realizar os cortes no criostato e dispor os cortes obtidos em lâminas para sua análise histológica. Imunoistoquímica Método de detecção de substâncias imunorreativas (antígenos) presentes nos tecidos, utilizando anticorpos marcados com reagentes, por exemplo, enzimas ou fluorocromos. 38 UNIUBE É uma técnica essencialmente qualitativa e foi realizada pela primeira vez em meados do século passado, quando se utilizou produtos fluorescentes para marcação de anticorpos para detecção de antígenos teciduais. Hoje, a imunoistoquímica, graças à sua sensibilidade e especificidade, ocupa lugar de destaque na Patologia, tanto para investigação quanto para diagnóstico. Segundo Brasileiro (2004, p. 9), os antígenos presentes em células ou tecidos podem ser determinados por sua ligação ao anticorpo. Para o seu reconhecimento, os anticorpos utilizados devem ser marcados com algum produto que possa ser visualizado ao microscópio em preparados citológicos, em cortes histológicos de amostras incluídas em parafina ou em cortes obtidos pela técnica de congelação, conforme descrito anteriormente. As substâncias de marcação mais utilizadas são as fluorescentes ou enzimas. Dependendo do tipo de marcação utilizada, teremos as técnicas: • imunofluorescência: marcação com substâncias fluorescentes. • imunoenzimática: marcação com enzimas. Na imunofluorescência, o composto fluorescente mais utilizado é o isotiocianato de fluoresceína, que emite luz verde-brilhante quando Os anticorpos são obtidos in vivo, ou seja, em animais vivos, como, rato, coelho, cavalo, quando injetamos neste animal o antígeno atenuado, ou seja, incapaz de provocar a doença (não virulento), mas capaz de estimular a resposta imune do hospedeiro a ele (patogênico). IMPORTANTE! Doença Conjunto de alterações morfológicas e/ ou funcionais que se manifestam por meio de sinais e sintomas. UNIUBE 39 estimulado por luz ultravioleta. Nesta técnica, o microscópio utilizado é o de fluorescência, equipado com fonte de luz ultravioleta. No entanto, na técnica imunoenzimática, há formação de um composto colorido no local da reação antígeno-anticorpo, que é gerado pela ação da enzima sobre um substrato apropriado. A enzima mais frequentemente utilizada é a peroxidase, razão pela qual a técnica é denominada comumente de técnica de imunoperoxidase. O tetra-hidrocloreto de 3,3’ diaminobenzidina (DAB) é o substrato mais comumente utilizado e confere coloração marrom no local da reação. Outras substâncias cromógenas utilizadas como substrato são: aminoetilcarbazol e cloronaftol. A imunoistoquímica é utilizada para detecção de neoplasias como marcadores celulares e na pesquisa de receptores para hormônios ou para fatores de crescimento, em tumores malignos conforme se vê nas figuras 15 e 16 a seguir. Figura 15: Membrana de células de câncer de mama corada com anticorpo c-erb-B2. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. 40 UNIUBE Figura 16: Núcleos de células de carcinoma de mama corados com receptor de estrógeno-alfa. Foto: Lilian Margareth Biagioni de Lima. Além disso, ela é usada na identificação da sede primária de tumores desconhecidos e na análise de amostras de suas metástases. Essa técnica também é utilizada na detecção de doenças infecciosas e parasitárias de importância clínica, como vírus, bactérias, fungos e protozoários. 1.3.1.3 Biologia Molecular Atualmente, torna-se necessária a preocupação dos patologistas com as alterações moleculares que podem preceder as alterações morfológicas, possibilitando diagnósticos cada vez mais precoces e precisos e, consequentemente, tratamentos mais eficazes. Assim sendo, as técnicas de Biologia Molecular têm contribuído enormemente, pois fornecem a identificação de proteínas e ácidos nucleicos (DNA ou RNA) com informações tanto qualitativas quanto quantitativas. As técnicas utilizadas são: • Hibridação molecular UNIUBE 41 • Reação em cadeia da polimerase (PCR) O PCR permite a reação de amplificação de sequências específicas de DNA de forma automatizada, em ciclos que se repetem. O produto final desta reação é composto por uma grande quantidade do DNA amplificado, juntamente com o DNA original presente no início da reação. Veja no site indicado uma imagem de hibridação in situ fluorescente (FISH), para o diagnóstico da Leucemia mieloide crônica: <http://labpath.blogspot.com/2011/07/fish.html>. PESQUISANDO NA WEB Tem como aplicação a identificação de uma sequência de bases de um DNA presente em uma amostra (célula ou tecido), utilizando-se um fragmento de DNA (sonda) que é marcado com uma substância (radioativa ou biotinilada) que permite revelar a reação de hibridação. Ao final de uma reação, com 35 ciclos de amplificação e com duas horas de duração, por exemplo, uma única molécula de DNA dará origem a cerca de 10 bilhões de cópias,permitindo sua visualização e manipulação (BRASILEIRO, 2004, p.17). CURIOSIDADE Se o produto final obtido for submetido a uma separação eletroforética, em um gel de agarose, e corado com um corante que se liga ao DNA como o brometo de etídio, por exemplo, teremos uma banda, visível à luz ultravioleta, na região correspondente ao peso molecular do fragmento de DNA que foi amplificado. 42 UNIUBE • Técnicas de Análise em Larga Escala - Projeto Genoma As técnicas de análise em larga escala são importantes na detecção de neoplasias, doenças infecciosas e genéticas. Nas neoplasias, é possível identificar as várias alterações genéti- cas responsáveis pelos casos de maior incidência de tipos de câncer em determinadas famílias. Utilizando-se técnicas de PCR e de sequenciamento de DNA, tem-se obtido sucesso na área de diagnóstico precoce e prognóstico. Além disso, por meio da utilização das técnicas de PCR e Hibridação in situ, podem-se detectar as mutações no genoma, tais como, translocações, amplificações ou deleções. Por meio da comparação dos genes que são expressos nas amostras normais e nas tumorais, pode-se definir a assinatura molecular, ou seja, conjunto de genes expressos de maneira coordenada, porém distinta, nos tumores e nos tecidos normais (BRASILEIRO, 2004, p. 19). Nas doenças infecciosas, os agentes infectantes possuem sequências específicas de ácidos nucleicos e que podem ser reconhecidas pelas técnicas de Biologia Molecular, por exemplo, PCR (BRASILEIRO, 2004, p. 20). Nas doenças genéticas, nas alterações genéticas, utilizando-se a PCR feita em DNA de célula do indivíduo suspeito, as mutações podem ser reconhecidas com precisão. Assim, pode-se tanto confirmar o diagnóstico da doença como fazer o aconselhamento genético (BRASILEIRO, 2004, p. 19). Veja no site indicado uma imagem do resultado da eletroforese de uma reação de PCR: <http://commons.wikipedia.org/wiki/File:0285fig1.gif.> PESQUISANDO NA WEB UNIUBE 43 Os desafios no estudo das doenças estão em transitar, com segurança, entre a investigação científica e o ensino/aprendizagem; entre os avanços tecnológicos e científicos e a arte e a ciência de ensinar; entre pesquisar e fazer intervenção por meio de projetos educativos. Para vencer esses desafios, é preciso dedicação aos estudos e a compreensão de que tudo está interligado: saúde, educação, economia, cultura, natureza e meio ambiente. Nesse capítulo, estudamos que, no processo de adoecimento, nosso organismo reage a agressões de diferentes naturezas buscando manter a homeostase. Na interação com o agente agressor, o organismo lança mão de mecanismos de defesa e, nesse contexto, surgem alterações anatômicas e funcionais. Diferentes métodos e técnicas são utilizados para estudar o processo de adoecimento, sendo esses métodos agrupados em parasitológicos, microbiológicos, imunológicos e patológicos. Conclusão1.4 Resumo Referências ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J.S. Imunologia celular e molecular. 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2005. ARAGUAIA, Mariana. Sangue. In: Alunos online. Disponível em: <http://www. alunosonline.com.br/biologia/sangue.html>. Acesso em: 28 jan. 2012. BARNES, Robert D.; RUPPERT, Edward E. Zoologia dos invertebrados. 6. ed. São Paulo: Roca, 1996. BRASILEIRO FILHO, Geraldo Bogliolo. Patologia Geral. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. 44 UNIUBE BRASILEIRO FILHO, Geraldo Bogliolo. Patologia. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. EOSINOPHIL.JPG. 2006. Altura: 171 pixels. Largura: 145 pixels. 6 KB. Formato JPEG. Disponível em:<http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Eosinophil.jpg>. Acesso em: 28 jan. 2012. MACROPHAGE.PNG. Altura: 174. Largura: 149. 17 KB. Formato PNG. Disponível em: <http://en.wikipedia.org/wiki/File:Macrophage.png>. Acesso em: 28 jan. 2012. MAGALHÃES, Adelaide M. et al. Estudo comparativo entre citopatologia e histopatologia no diagnóstico de neoplasias caninas. Pesq. Vet. Bras. v. 21, n. 1 Rio de Janeiro. Jan./mar, 2001. MASTÓCITO. Disponível em: <http://www.virtual.epm.br/material/histologia/histo/ fig15.htm>. Acesso em: 28 jan. 2012. MONTENEGRO, Mário Rubens; FRANCO, Marcello. Patologia. Processos Gerais. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 1999. NEVES, David Pereira. Parasitologia humana. 10. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2005. PBBASOPHIL.JPG. 2005. Altura: 170 pixels. Largura: 150. 3 KB. Formato JPEG. Disponível em:< http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:PBBasophil.jpg>. Acesso em: 28 jan. 2012. REY, L. Parasitologia: Parasitas e doenças parasitárias do homem nas Américas e na África. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1991. RUBIN, Emanuel et al. Rubin. Patologia. Bases clinicopatológicas da Medicina. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. Aldo Matos Isabel Cristina Rezende Lopes Lilian Margareth Biagioni de Lima Introdução Agressão: saúde e doençaCapítulo 2 Abordaremos, nesse capítulo, alguns aspectos da saúde e da doença. Estamos iniciando um tema que pode ser apenas da Biologia, ou, também, um tema transversal. Na verdade, estamos lidando com saúde e doença continuamente, seja conosco mesmo, com amigos ou familiares. Você, futuro professor, será corresponsável pela saúde dos seus alunos e, ainda, dos familiares deles. Portanto, temos a responsabilidade de auxiliar nossos alunos a desenvolverem habilidades para evitarem doenças, manterem-se saudáveis e difundirem a cultura de hábitos saudáveis entre seus familiares e amigos. O tema saúde x doença permite múltiplas abordagens que envolvem desde os processos biológicos até as interações sociais. Nesse momento do seu curso, abordaremos apenas os aspectos biológicos. Posteriormente, teremos a oportunidade de retomar esse tema e agregar a discussão de outros aspectos de natureza social, econômica e política envolvidos na manutenção da saúde e no processo de adoecimento. Você perceberá que, do ponto de vista biológico, o foco central é o adoecimento. Nesse processo, percebemos que uma agressão desvia o organismo do estado de equilíbrio ou homeostase e 46 UNIUBE Ao final desse estudo, esperamos que você seja capaz de: • conceituar doença sob o aspecto biológico; • conceituar saúde sob o aspecto biológico; • descrever os principais mecanismos de agressão; • identificar os agentes agressores físicos, químicos e biológicos; • explicar os processos patológicos reversíveis e irreversíveis; Objetivos provoca nele uma reação no sentido de retomar o estado de equilíbrio, ou seja, na prática, o organismo reage pela resposta imunológica e por reações heterólogas. O equilíbrio pode, ou não, ser reestabelecido e, na verdade, existe uma infinidade de novas situações de equilíbrio possíveis diante de uma agressão. Todas essas possibilidades configuram desde a cura até as diferentes apresentações de doença. Assim, diante de uma agressão, o organismo defende-se, podendo adaptar-se a novo ponto de equilíbrio ou apresentar processos patológicos e adoecer. Nessa interação entre agente agressor e organismo agredido, exercem papéis importantes a resposta imunológica a vírus, a bactérias e a fungos e os processos patológicos resultantes que, de um modo geral, estão envolvidos na defesa do organismo e na busca de um novo ponto de equilíbrio. Assim, caro aluno, abordaremos, nesse capítulo, as bases biológicas do processo de agressão, defesa, adaptação e adoecimento. UNIUBE 47 • identificar a origem e explicar o processo evolutivo dos processos patológicos; • explicar os mecanismos que originam os processos patológicos; • descrever a importância do Sistema Imunológico; • explicar a morfologia e fisiologia das células e órgãos do Sistema Imune; • conceituar e diferenciar imunidade inata e adaptativa; • compreender os mecanismos imunológicos efetivos e específicos contra vírus, bactérias e fungos. 2.1 Etiopatogênese geral das lesões 2.2 Agentes lesivos 2.3 Lesões ou processos patológicos 2.4 Conclusão
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