AULA 6 REAL TIME

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Real-Time PCR
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Cockerill FR III. Arch Pathol Lab Med. 2003;127:1112
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Qual o problema com os géis de Agarose?
* Precisão ruim
* Baixa sensibilidade
* Baixa resolução
* Não-automatizado
* Discriminação apenas pelo tamanho
* Resultados não numéricos
* Não é confiável quantitativamente
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Real-Time PCR
Real-time PCR monitora a fluorescência emitida durante a reação como um indicador da produção de amplificado em cada ciclo de PCR
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Vantagens do Real-time PCR
 
* Não influenciado por amplificação não específica 
* A amplificação pode ser monitorada em tempo real 
* Não ocorre processamento pós-pcr 
(baixo risco de contaminação) 
* Ciclagem ultra-rápida (30 minutos a 2 horas)
* Requer 1000x menos RNA que os ensaios convencionais
*confirmação da amplificação específica em tempo real
* Mais específico, sensível e reprodutivo
* Não tão mais caro do que o PCR convencional
(excetuando-se o custo do equipamento)
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Real-time PCR desvantagens
 
* Não é ideal para multiplex 
* A padronização requer alto treinamento técnico e suporte 
* Alto custo do equipamento
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* Variação intra- e inter-ensaio
* Labilidade do RNA
* Contaminação por DNA (na análise de mRNA)
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Princípios do Real-time
Baseado na detecção e quantificação de uma molécula fluorescente reporter
* O primeiro aumento significativo na quantidade de amplificado de PCR (CT - threshold cycle) correlaciona-se com a quantidade inicial de amostra alvo template 
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A série com cinco diluições da amostra aparenta chegar ao plateau no mesmo lugar, mesmo a fae exponencial claramente mostrar uma diferença entre os pontos através da série de diluições. Isso demonstra o fato de que se as medidas fossem tiradas na fase de plateau, os dados não representariam as quantidades iniciais de material alvo
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Princípios do Real-Time
 
Três métodos principais para ensaios quantitativos: 
1. Sondas hidrolizáveis
(TaqMan, Beacons, Scorpions) 
2. Sondas hibridizáveis
(Light Cycler)
3. Agentes ligantes ao DNA
(SYBR Green)
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(www)
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Van der Velden, Leukemia 2003
Princípios das Técnicas de Real Time Quantitativo
SYBR Green I: SA fluorescência emitida pelo SYBR Green é enormemente aumentada após a ligação ao DNA dupla fita. Durante a fase de extensão, mais e mais Cyber Green vai se ligar ao produto de PCR, resultando em um aumento de fluorescência. Conequentemente, durante cada ciclo do PCR mais sinal fluorescente será detectado. 
Sondas hidrolizáveis: As sondas hidrolizáveis são conjugadas com um fluorocromo quencher, o qual absorve a fluorescência do fluorocromo reporter, enquanto a sonda está intacta. Porém, duratne a amplificação da sequencia alvo, a sonda hidrolizável é retirada e susequentemente hidrolizada pela Taq polimerase. Isso resulta na separação do quencher do reporter, e consequentemente a fluorescência do reporter passa a ser detectada. Durante cada ciclo de PCR essa fluorescência vai aumentar devido ao acúmulo exponencial de fluorocromos reporters. 
Sondas de hibridização: Nessa técnica, uma sonda é marcada com um fluorocromo doador na extremidade 3’ e uma segunda sonda – adjacente – é marcada com um fluorocromo receptor. Quando os dois fluorocromos estão próximos (1-5 nucleotídoes de distância), a luz emitida pelo doador vai excitar o receptor (FRET). Isso resulta em emissão de fluorescência, a qual vai ser detectada durante a fase de anelamento. Após cada ciclo de PCR, mais sondas de hibridização podem ligar, resultando em aumento do sinal fluorescente.
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Wittwer, 1997 (www)
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Sondas TaqMan
FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer 
Atividade exonuclease 5’ da Taq polimerase
 
* Temperatura de anelamento 100 C maior do que primers
* Não pode haver Gs consecutivos) 
* G+C entre 30-80%
* Mais Cs do que Gs
* nenhum G na extremidade 5'
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FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer 
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Mocellin et al. Trends Mol Med 2003 (www)
Atividade Exonuclease 5' da DNA Polimerase 
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TaqMan 5’ Exonuclease
Além dos dois convencionais primers, os quais são específicos para a sequência alvo, um terceiro primer é desenhado para se ligar especificamente a um sítio no meio da sequência alvo. Esse primer é marcados com dois fluorocromos, um reporter, na extremidade 5’ e um quencher, na extremidade 3’. Devido a extremidade 3’ estar bloqueada, esse primer não pode iniciar a síntese de novas fitas de DNA. Durante reação de PCR, a Taq sintetiza uma nova fita de DNA inciando no primer forward, mas quando a enzima aproxima-se da sonda, sua atividde de processamento degrada o primer P3, e o quencher e o reporter não estão mais na mesma molécula, o queleva a um aumento da emissão de fluorescência, com sua intensidade sendo facilmente detectada.
Human Molecular Genetics 2. NCBI Books
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TaqMan Primers
 
* Tm parecidos (58-600 C)
* 15-30 bases de tamanho 
* Conteúdo de G+C 30-80%
Sem sequencias de nucleotídeos repetidos
* não mais de dois G+C no final 3’
Sem G no final 5‘
* tamanho médio do amplificado 50-150 bp (max 400)
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Detecção de produtos amplificados específicos em amostras contendo concentrações iniciais diferentes de DNA. 
(A) Utilizou-se 100,000 (vermelho), 10,000 (verde), 1,000 (laranja), 100 (azul), and 10 (roxo) cópis de DNA genômico humano. As curvas mostram aumento da fluorescência em oito amostras replicadas em cada concentração inicial. 
(B) Gráfico da concentração inicial de DNA vs. Ciclo demonstram a natureza quantitativa dos valores de endpoint. (R2 = 0.974)
Linear After The Exponential (LATE) PCR
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SYBR Green
 (sonda de ligação a DNA dupla fita)
* Emite grande fluorescência após ligar-se a DNA dupla fita
* desvantagem: ligação não-específica
* Requer otimização extensiva
* Amplicons grandes emitem maior fluorescência 
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Fluoresces when bound
to dsDNA
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SYBR Green
(1) No começao da amplificação, a reação contêm DNA desnaturado, primers, e a sonda. As moléculas não ligadas emitem fluorescência fraca, produzindo um background queé subtraído durante a análise. A ligação ao DNA dupla fita resulta em aumento marcante da fluorescência, principalmente durante a elongação da fita. Durante a desnaturação da molécula do DNA, a fluorescência baixa.
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Ensaios que não requeiram especificidade dos ensaios baseados em sonda.
Screening inicial de diversos experimentos, antes de passar para ensaios com sonda
* Quando o sistema de PCR está otimizado, sem dímeros de primers ou amplicons não-específicos, ex. DNA genômico
Quando escolher SYBR Green
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Quando NÃO escolher SYBR Green
* Ensaios de discriminação de alelos
* Reações multiplex
* Amplificação de transcritos mais raros
* Detecção de patógeno em baixa escala
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Princípios do Real-Time
 
Três métodos de detecção quantitativa: 
1. Sondas de Hidrólise
(TaqMan, Beacons, Scorpions) 
2. Sondas Hibridizáveis
(Light Cycler)
3. Agentes ligantes ao DNA
(SYBR Green)
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Mocellin et al. Trends Mol Med 2003 (www)
Molecular Beacons
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Bustin SA. J Mol Endocrinol 2002 (www)
Scorpions
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Threshold Cycle
* threshold cycle (CT value) é o ciclo aonde um aumento significativo na quantidade de amplificado é primeiramente detectado
É o parâmetro usado para quantificação
* CT valor de 40 ou mais significa nenhuma amplificação
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O gráfico de amplificação contêm as informações necessárias para a quantificação de DNA ou RNA. A lina é o nível de detecção ou o ponto a partir do qual a fluorescência atinge um nível maior do que o do background. A linha é colocada na fase exponencial da amplificação para uma leitura mais correta. O ciclo no qual a amplificação atinge essa linha é chamado de Cycle Threshold, CT. Esses dois valores são importantes para a análise de dados. 
O Que é CT?
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Van der Velden. Leukemia 2003 (www)
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(www)
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DRn
* Rn+ é o valor de detecção de reação contendo todos os componentes (amostra de interesse); Rn- é o valor de Rn detectada no controle sem amostra (valor basal)
* DRn é a diferença entre Rn+ and Rn-. É um indicador da magnitude do sinal gerado
pelo PCR.
* DRn é plotado contra o número d ciclos para produzir a curva de amplificação e dar o valor de CT.
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O que é DRn?
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O que é DRn?
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Nigel Walker, NIEHS (www)
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Controle Interno
(Padronização)
* Usar um gene abundante e constantemente expresso
* Os mais amplamente utilizados são os menos confiáveis
* Melhor correr um teste de validação antes com o controle interno
* Combinações devem ser utilizadas 
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Seleção do controle interno
Sabek et al. Transplantation 2002 (www)
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Multiplexing
* TaqMan: diferentes sondas para cada fragemtno (FAM, TET, VIC and JOE) 
* SYBR green: diferentes pontos de anelamento para cada fragmento
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Detecção Real-time de quatro diferentes DNAs retrovirais em formato multiplex. Quatro ensaios são conduzidos em tubos selados, cada qual com 100,000 moléculas de cada retrovírus. Cada reação contém quatro sets de primers específicos para HIV-1, HIV-2, HTLV-I, and HTLV-II e quatro molecular beacons, cada um específico para cada amplicons e marcado com um fluoróforo diferente. Vet JA et al. PNAS 1999
Multiplex Real-Time PCR
(fluorescein-labeled molecular beacon)
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Multiplex Real-Time PCR
(fluorescein-labeled molecular beacon)
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I. Desenvolvimento do ensaio
	A. Seleção da sequência
	B. Seleção dos primers e sondas
	C. Seleção do quencher e controle interno
	D. AValidação do ensaio
II. Setup
	A. Um ou dois passos no PCR
	B. Settings do termociclador
III. Análise de dados
	A. Settings do baseline e threeshold
	B. Curvas padrões
	C. Variabilidade inter- vs intra-ensaio
	D. Normalização da amostra
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One-Step ou Two-Step PCR
one-step real-time realiza transcrição reversa e PCR num mesmo sistema em um mesmo tubo
* two-step RT-PCR, esses dois passos são realizados separadamente
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Sample Layout
20 unknowns in triplicate, standard curve, NACs and NTC
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 Interpretação
 * Análise da curva de anelamento 
 * Quantificação absoluta
 * Quantificação relativa 
	
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Van der Velden. Leukemia 2003
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Read SJ et al. J Clin Microbiol 2001
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Real-Time PCR Aplicações - I
* Quantificação de expressão gênica
* Controle de qualidade e validação de ensaio
* Biossegurançã e estabilidade do material genômico
* Eifcácia da terapía com drogas e monitoração
* Quantificação viral 
* Detecção de patógenos 
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Real-Time PCR Aplicações- II
* Medidas de danos ao dna (instabilidade de microsatellite) 
* Ensaios de exposição a radiação
* Imagem in vivo de processos celulares 
* Estudos de DNA Mitocondrial 
* Detecção de metilação
* Detecção de inativação de cromossomos (X)
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Real-Time PCR Aplicações - III
* Determinação da identidade de loci de HLA de alto polimorfismo 
Monitoramento de rejeição de transplantes
* Genotipagem (discriminação de alelos) 
 - Trissomias e genes de cópia única
 - Genótipos com microdeleção
 - Haplotipagem
 - Análise quantitativa de microsatélites 
 - Diagnóstico pré-natal através de células fetais
 - Diagnóstico de processos carcinogênicos
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Allelic Discrimination Using TaqMan Probes
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Barrois M et al. Clin Genet 2004
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