Baixe o app para aproveitar ainda mais
Prévia do material em texto
Disciplina Bioquímica Geral Professora Jamile Fabbrin Gonçalves 1º) Definição de enzimas; 2º) Propriedades das enzimas; 3º) Funcionamento das enzimas; 4º) Cinética enzimática; 5º) Inibições enzimáticas; 6º) Enzimas reguladoras. As enzimas: a mais admirável e altamente especializada das proteínas!!! • Em geral, TODAS as reações químicas no organismo são mediadas por enzimas, as quais são catalisadoras que aumentam a velocidade das reações, sem sofrer alteração no processo global. • As enzimas são centrais em TODOS os processos bioquímicos. Atuando em sequências organizadas, elas catalisam as centenas de reações que degradam passo a passo as moléculas dos nutrientes, conservam e transformam energia química e sintetizam as macromoléculas biológicas a partir dos precursores simples. • Por meio da ação das enzimas reguladoras, as vias metabólicas são altamente coordenadas para produzir uma interação harmoniosa entre as muitas atividades necessárias para manter a vida. O estudo das enzimas possui imensa importância prática! • As medidas das atividades das enzimas no plasma sanguíneo, • Em algumas doenças, especialmente, as doenças genéticas hereditárias, pode haver deficiência ou mesmo a total ausência de uma ou mais enzimas; • Para outras condições de doença, a atividade excessiva de uma enzima pode ser a causa; • As medidas das atividades das enzimas no plasma sanguíneo, eritrócitos, ou amostras de tecidos são muito importantes no diagnóstico de certas doenças. Ex.: AST/ALT elevadas → em geral, problemas hepáticos; • Muitas drogas exercem seus efeitos biológicos por meio das interações com enzimas; • E, as enzimas não são importantes somente na medicina, mas também na indústria química, no processamento de alimentos e na agricultura!!! A maioria das enzimas são proteínas • Com exceção de um grupo de RNA catalítico, TODAS as enzimas são proteínas; • A atividade catalítica da enzima depende da integridade de sua conformação nativa. Por exemplo, se a enzima for desnaturada ouconformação nativa. Por exemplo, se a enzima for desnaturada ou dissociada em suas subunidades (aminoácidos) a atividade catalítica é perdida; • As enzimas, como outras proteínas, possuem pesos moleculares diversos que variam de cerca de 12.000 a 1 milhão. 1) Co-fator: Algumas enzimas requerem a presença de um co-fator, ou seja, de um componente químico adicional podendo ser um ou mais íons inorgânicos. HOLOENZIMAS: enzimas requerem outros grupos químicos além dos seus resíduos de aminoácidos para a sua atividade 2) Coenzimas: Algumas enzimas requerem a presença de uma coenzima, ou seja, de um complexo orgânico ou molécula metalorgânica. • As coenzimas atuam como transportadoras transitórias de grupos funcionais específicos; • Muitas são derivadas de vitaminas, nutrientes orgânicos requeridos em pequenas quantidades na dieta. • Algumas enzimas requerem tanto uma coenzima quanto um ou mais íons metálicos para a sua atividade; • Uma coenzima ou co-fator que seja ligado muito forte ou covalentemente à enzima é chamado de GRUPO PROSTÉTICO; • A porção protéica de tal enzima é denominada de APOENZIMA ou APOPROTEÍNA; • Uma enzima cataliticamente ativa completa, juntamente com sua coenzima ligada e/ou co-fator é chamada de HOLOENZIMA.coenzima ligada e/ou co-fator é chamada de HOLOENZIMA. ENZIMA ATIVA!!! • As enzimas são catalisadores protéicos que aumentam a velocidade de uma reação química e não são consumidos durante a reação que catalisam. Propriedades das enzimas A) SÍTIO ATIVO • É uma região específica em forma de fenda ou bolso o qual contém cadeias laterais de aminoácidos que criam uma superfície tridimensional complementar ao substrato;tridimensional complementar ao substrato; • O sítio ativo liga o substrato formando um complexo enzima- substrato (ES); • O complexo ES é convertido em enzima-produto (EP) que posteriormente se dissocia em enzima e produto. Ligação de um substrato a uma enzima no sitio ativo. B) EFICIÊNCIA CATALÍTICA • As reações catalisadas por enzimas são, em sua maioria, altamente eficientes, desde 103 até 108 vezes mais rápidas que reações não-catalisadas; • Tipicamente, cada molécula de enzima é capaz de transformar de 100 a 1000 moléculas de substrato em produto por segundo; • O número de moléculas de substrato convertidas em moléculas de produto por uma molécula de enzima em um segundo é chamado de número de renovação (turnover) ou Kcat; C) ESPECIFICIDADE • As enzimas são altamente específicas, interagindo com um ou alguns poucos substratos e catalisando apenas um tipo de reação química; D) REGULAÇÃO ENZIMÁTICA • A atividade enzimática pode ser regulada, isto é, as enzimas podem• A atividade enzimática pode ser regulada, isto é, as enzimas podem ser inibidas ou ativadas, a fim de que a velocidade de formação do produto responda às necessidades da célula; Regulação alostérica Regulação por ligação covalente reversível Regulação por clivagem proteolítica E) LOCALIZAÇÃO DENTRO DA CÉLULA • Muitas enzimas estão localizadas em organelas específicas dentro da célula; • Essa compartimentalização serve para isolar o substrato ou o produto da reação de outras reações competitivas e garante o meio favorável para a reação e organiza as milhares de enzimas presentes na célula em vias definidas. As enzimas são classificadas pelas reações que catalisam • Os nomes de enzimas mais frequentemente utilizados têm sufixo “ase” adicionado ao nome do substrato da reação (ex.: urease→hidrólise da uréia) ou à descrição da ação realizada (ex.: DNA polimerase→polimerização dos nucleotídeos para formar o DNA).nucleotídeos para formar o DNA). • E.C. (número de determinada enzima na Comissão de Enzimas). Ex.: hexoquinase (E.C. 2.7.1.1.) Ex.: hexoquinase (E.C. 2.7.1.1.) ATP :glicose fosfotransferase = Classe: transferase Subclasse: fosfotransferase Fosfotransferase com um grupo Hidroxila como receptor D-glicose como o grupo receptor da fosforila E.C 2.7.1.1 Como as enzimas funcionam? A) Alterações de energia que ocorrem durante a reação • Praticamente todas as reações químicas têm uma barreira de energia separando os reagentes dos produtos a qual é denominada ENERGIA DE ATIVAÇÃO; → Energia requerida para o alinhamento dos grupos que reagem, a formação de cargasgrupos que reagem, a formação de cargas transitórias instáveis, os rearranjos de ligações e outras transformações requeridas para a reação prosseguir em qualquer direção!!! • Energia de ativação: é a diferença entre a energia dos reagentes e a energia de um intermediário de alta energia (T*) que ocorre durante a formação do produto; • Para as moléculas reagirem, elas devem conter energia suficiente para superar a barreira de energia do estado de transição. Em geral, quanto menor a energia livre de ativação, mais rápida é a velocidade da reação. → A velocidade é aumentada por certo aumento de TEMPERATURA (agito molecular)!!! • Uma enzima permite que uma reação ocorra RAPIDAMENTE nas condições normais da célula (condições isotérmicas e pH quase neutro) → Uma enzima atua diminuindo a energia de ativação devido à formação de um complexo com o substrato que causa mudanças conformacionais e facilita a geração do produto!!! (agito molecular)!!! • A enzima NÃO altera a energia livre do sistema e, assim sendo, NÃO ALTERA O EQUILÍBRIO TERMODINÂMICO DA REAÇÃO, ou seja, a reação obedece a mudanças de energia livre do sistema sendo realizada caso seja energeticamente possível. ∆G < 1 NEGATIVA Ocorre de forma direta ∆G = 1 ZERO Está no equilíbrio ∆G > 1 POSITIVA Ocorre de forma inversa B) Química do sítio ativo • O sítio ativo NÃO é um receptáculo passivo para a ligação do substrato, mas sim uma máquina molecular complexa, empregando uma diversidade de mecanismos químicos para facilitar a conversão do substrato em produto; • O sítio ativo frequentemente atua como um molde• O sítio ativo frequentemente atua como um molde molecular flexível que se liga ao substrato em umaestrutura geométrica similar ao estado de transição da molécula → A ENZIMA ESTABILIZA O SUBSTRATO EM SEU ESTADO DE TRANSIÇÃO (LIGAÇÃO NÃO-COVALENTES!), AUMENTANDO MUITO A CONCENTRAÇÃO DO INTERMEDIÁRIO REATIVO QUE PODE SER CONVERTIDO NO PRODUTO, ACELERANDO A REAÇÃO. Modelo chave-fechadura Interações Fracas entre a Enzima e o Substrato são otimizadas no estado de transição • O requerimento de interações fracas para impulsionar a catálise é uma razão por que as enzimas são tão grandes, pois elas devem oferecer grupos funcionais para as interações iônicas, pontes de hidrogênio e outras, posicionando esses grupos para que a energia de ativaçãoposicionando esses grupos para que a energia de ativação seja otimizada no estado de transição; • A enzima não será capaz de interagir com outras moléculas que não estão arranjadas de maneira a formar interações especificas com o seu sitio ativo, neste caso o substrato é pobre para a enzima. • Parte da força diretiva para ligar um substrato polar (reagente) a uma superfície polar complementar de uma enzima é o aumento da ENTROPIA à medida que a enzimaENTROPIA à medida que a enzima desloca as moléculas de água ordenadas do substrato. MUITAS ENZIMAS CATALISAM REAÇÕES COM DOIS OU MAIS SUBSTRATOS hexoquinase • Na maior parte das reações duas ou mais moléculas de substratos diferentes ligam-se à enzima e participam na reação; • As reações enzimáticas com dois ou mais substratos usualmente envolvem a transferência de um átomo ou grupo funcional de um substrato a outro. • Essas reações seguem um de vários caminhos: Os 3 principais fatores que afetam a velocidade da reação 1) Temperatura • A velocidade da reação aumenta com a temperatura devido ao aumento da interação entre as moléculas (agitação molecular). Entretanto, um elevação maior da temperatura diminui a velocidade da reação como resultado da desnaturação protéica da enzima. → A temperatura ótima para a maioria das enzimas animais está entre 35 e 40ºC, porém as enzimas das bactérias termófilas, encontradas em fontes de água quente, apresentam temperatura ótima em torno de 70ºC. 2) pH 1) Efeito do pH sobre a ionização do sítio ativo: o processo catalítico geralmente requer que a enzima e o substrato tenham determinados grupos químicos em estado ionizado ou não-ionizado. Ex.: a atividade catalítica pode exigir que um grupo amino da enzima esteja na forma protonada (-NH3+), mas em pH alcalino, esse grupo não está protonado e, assim a velocidade da reação diminui. • A concentração de H+ afeta a velocidade da reação basicamente de duas maneiras: 2) Efeito do pH sobre a desnaturação enzimática: valores extremos de pH também podem levar à desnaturação da enzima. → O pH ÓTIMO VARIA DE ACORDO COM A ENZIMA. Ex.: a pepsina é uma enzima digestiva do estômago apresentando atividade máxima em pH 2, enquanto outras enzimas desnaturam em pH tão ácido. 3) Substrato • Em geral, em baixas concentrações de substrato, a velocidade da reação é proporcional à concentração do substrato; • A maioria das enzimas exibe uma cinética de Michaelis-Menten, onde CURVA HIPERBÓLICAcinética de Michaelis-Menten, onde obtêm-se um platô na velocidade da reação devido a altas concentrações de substrato refletindo a SATURAÇÃO, pelo substrato, de todos os sítios ativos disponíveis nas moléculas enzimáticas presentes. enzimas regulatórias do tipo alostéricas!!! ≠ HIPERBÓLICA CINÉTICA ENZIMÁTICA • A velocidade da reação enzimática, expressa como velocidade inicial (V0), aumenta com o incremento na concentração de substrato (S), quando é mantido constante o número de moléculas enzimáticas. • Esse aumento continua até um ponto em que é atingida aponto em que é atingida a velocidade máxima de uma reação (Vmáx) → Este ponto representa o ponto de SATURAÇÃO da enzima, isto é, quando todos os sítios ativos disponíveis nas moléculas enzimáticas presentes estão ocupados pelo substrato. CURVA HIPERBÓLICA • Em 1913, os pesquisadores Michaelis e Menten deduziram uma equação que retrata a relação entre a concentração de substrato e a velocidade da reação → Equação de Michaelis-Menten. ** • A constante de Michaelis-Menten (Km) é definida como a concentração de substrato necessária para atingir metade da Vmáx. • O Km, de modo geral, representa o grau de afinidade que a enzima tem por seu substrato (o significado atual de Km depende de aspectos específicos do mecanismo de reação como o número e as velocidades relativas das etapas individuais da reação); • O valor de Km é pode variar grandemente de enzima para enzima, e mesmo para diferentes substratos da mesma enzima. hexoquinase Apresenta maior afinidade pela glicose que pelo ATP EQUAÇÃO DE LINEWEAVER-BURKE ou equação de duplos-recíprocos • Torna linear a equação de Michaelis-Menten (hiperbólica) → é muito utilizada para calcular Km e Vmáx, assim como para determinar o mecanismo de ação de inibidores enzimáticos.* INIBIÇÃO ENZIMÁTICA • Os inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem com a catálise, diminuindo ou parando as reações enzimáticas; • Os inibidores enzimáticos estão entre os agentes farmacêuticos mais utilizados (ex.: aspirina). INIBIÇÃO ENZIMÁTICA 1) REVERSÍVEL 2) IRREVERSÍVEL 1A)COMPETITIVA 1B)NÃO-COMPETITIVA 1) Inibição enzimática REVERSÍVEL • Os inibidores reversíveis ligam-se às enzimas por meio de ligações NÃO-COVALENTES, de modo que a diluição do complexo enzima- inibidor resulta na dissociação do inibidor reversivelmente ligado e na recuperação da atividade enzimática. COMPETITIVA NÃO-COMPETITIVA INIBIÇÃO REVERSÍVEL 1A) Inibição enzimática REVERSÍVEL COMPETIVIVA • Esse tipo de inibição ocorre quando o INIBIDOR LIGA-SE REVERSIVELMENTE AO MESMO SÍTIO ATIVO QUE O SUBSTRATO OCUPARIA e, dessa forma, compete com o substrato por esse sítio devido a sua similaridade estrutural; ES • Este tipo de inibição é revertida quando suficiente quantidade do substrato desloca o inibidor do sítio ativo. • O complexo EI não gera nenhum produto; Ex.: Estatinas → grupo de drogas anti-lipidêmicas que inibe competitivamente o primeiro passo da síntese do colesterol. ES EI E 1B) Inibição enzimática REVERSÍVEL NÃO-COMPETITIVA • Esse tipo de inibição ocorre quando o INIBIDOR E O SUBSTRATO LIGAM-SE A SÍTIOS DIFERENTES NA ENZIMA e, dessa forma, não competem pelo mesmo sítio. Este tipo de inibidor pode ligar-se tanto à enzima livre (E) quanto ao complexo ES; • A união do inibidor à enzima induz uma mudança conformacional na enzima, reduzindo a taxa de formação do ESE reduzindo a taxa de formação do complexo ES e/ou reduzindo a taxa de degradação de ES para formar o produto; • Este tipo de inibidor não bloqueia a união do complexo ES. Entretanto, ES não forma nenhum produto enquanto o inibidor estiver unido à enzima → este tipo de inibição não pode ser revertido com o aumento da concentração de substrato. Ex.: alguns moduladores de enzimas alostéricas! EI ESI 2) Inibição enzimática IRREVERSÍVEL • Os inibidores irreversíveis são aqueles que se ligam de forma COVALENTE com a enzima ou DESTROEM UM GRUPO FUNCIONAL ESSENCIAL para a atividade da enzima, ou aqueles que formam uma LIGAÇÃO NÃO-COVALENTE PARTICULARMENTE ESTÁVEL com a enzima. Ex.:COMPOSTOS ORGANOFOSFORADOS, os quais são frequentemente usados como antiparasitários nos animais domésticos. Estes compostos inibem a AChE domésticos. Estes compostos inibem a enzima acetilcolinesterase (AChE) (responsável pela hidrólise do neurotransmissor acetilcolina) causando efeitos neurotóxicos. ***Organofosforados também inibem outras enzimas que possuem serina no sítio ativo. Ex.: tripsina, elastase, fosfoglicomutase e quimotripsina. • No metabolismo celular, grupos de enzimas trabalham juntas em vias sequenciais para realizar um certo processo metabólico; • Nessas reações o PRODUTO da reação de uma enzima torna-se o SUBSTRATO da próxima enzima; ENZIMAS REGULADORAS SUBSTRATO da próxima enzima; • Essas enzimas reguladoras aumentam ou diminuem sua atividadeem resposta a certos sinais celulares; • Dessa forma elas ajustam a velocidade das reações, permitindo que a célula alcance suas necessidades energéticas e de biomoléculas requeridas no crescimento e reparo celular. A B C D E F E1 E2 E3 E4 E5 1) Enzimas alostéricas: funcionam por meio da ligação de compostos reguladores não-covalentes e reversíveis, chamados MODULADORES ou EFETORES ALOSTÉRICOS, que são geralmente metabólitos pequenos ou co-fatores; As enzimas reguladoras são moduladas de várias maneiras 2) Enzimas reguladas por modificação covalente reversível; 3) Enzimas são ativadas quando segmentos peptídicos são removidos por clivagem proteolítica -> reação irreversível. Regulação alostérica Regulação por ligação covalente reversível Regulação por clivagem proteolítica • Enzimas alostéricas apresentam alterações de conformação induzidas pela ligação de um ou mais moduladores -> interconvertem formas mais ativas e menos ativas. • Moduladores podem ser: ***Inibitórios 1) As enzimas alostéricas sofrem alterações de conformação em resposta à ligação de moduladores • Moduladores podem ser: ***Inibitórios ***Estimuladores • Enzimas Homotrópicas: o modulador é o próprio substrato; • Enzimas Heterotrópicas: o modulador é uma molécula outra que o substrato. CONFORMAÇÃO molecular: o arranjo espacial dos grupos substituintes, SEM quebrar nenhuma ligação, são livres para assumir posições diferentes no espaço devido à liberdade de rotação em volta das ligações simples. Ex.: Etano (C-C). Relembrando... Forma elipsada Forma escalonada A interconversão das duas formas de etano ocorre milhões de vezes por segundo! Subunidade reguladora Subunidade catalitica Sitio regulador com alta especificidade pelo modulador Muda a conformação • Diferenças estruturais -> além do sítio ativo, as enzimas alostéricas possuem um ou mais sítios alostéricos para a ligação do modulador (nas enzimas homotrópicas o sítio ativo e o sítio regulador são os mesmos); • As enzimas reguladoras são geralmente MAIORES e MAIS COMPLEXAS que as enzimas não-alostéricas (a maioria possui duas ou mais subunidades). As propriedades das enzimas alostéricas são distintas das enzimas não-reguladoras simples: subunidades). Ligação com o modulador Aspartato transcarbamilase • Em algumas vias metabólicas, a enzima reguladora é especificamente inibida pelo produto final da via toda a vez que a [produto] exceder os requerimentos celulares; Em muitas vias uma etapa reguladora é catalisada por uma enzima alostérica: requerimentos celulares; • Quando a reação da enzima reguladora é diminuída, todas as enzimas subseqüentes operam em velocidades reduzidas à medida que seus substratos são depletados; • As enzimas alostéricas não exibem saturação com o substrato quando a [S] for alta; • Produzem uma curva de saturação sigmóide e não hiperbólica. Enzimas alostéricas são reguladas As propriedades cinéticas das enzimas alostéricas divergem do comportamento de Michaelis e Menten: Enzimas alostéricas são reguladas pelas necessidades celulares Relembrando... [S] >> [E] Saturação As enzimas que seguem o comportamento de uma curva hiperbólica são ditas seguirem a cinética de Michaelis e Menten. Por quê ocorre a alteração de curva hiperbólica para sigmóide? Vo aumenta A curva torna-se sigmóide porque, no exemplo, o S atua como modulador positivo (um ativador) à as subunidades [S] = [modulador] [S] aumentada ativador) à as subunidades atuam cooperativamente à o S se liga tanto ao sitio ativo quanto ao sitio regulador à alterando a conformação da enzima à aumentando a afinidade da ligação do S das moléculas subseqüentes do substrato. Fosforila Grupos que modulam a atividade de enzimas covalentemente: A fosforilação é o tipo mais comum de modificação reguladora!!! 2) Algumas enzimas reguladoras sofrem modificação covalente reversível Adenina Uridila Metila ADP-ribosila Grupos fosforila afetam a estrutura e a atividade catalítica das proteínas *** Ligação de grupos fosforilas a resíduos de aminoácidos de uma proteína *** Remoção de grupos fosforilas de resíduos de aminoácidos de uma proteína proteínas quinases proteínas fosfatases • Exemplo de regulação pela fosforilação: Glicogênio fosforilase Glicogênio fosforilase ocorre em duas formas: • Fosforilase a (mais ativa) → fosforilada • Fosforilase b (menos ativa) → desfosforilada • Para algumas enzimas, um precursor inativo chamado zimogênio é clivado para formar a enzima ativa; • Esse tipo de reação é irreversível; 2) Algumas enzimas são reguladas pela clivagem proteolítica de um precursor enzimático • Esse tipo de reação é irreversível; • A clivagem específica induz a alterações na conformação da enzima expondo seu sitio ativo; • Muitas enzimas proteolíticas tripsina e quimotripsina são um exemplo clássico de zimogênios e suas formas de ativação. • Exemplo de zimogênio: Quimotripsinogênio -> Quimotripsina As mudanças na estrutura primária que acompanham a conversão do quimotripsinogênio em quimotripsina provocam mudanças na estrutura terciária -> FUNÇÃO DIFERENTE! Zimogênio Enzima ativa • Outros exemplos de zimogênios Os mecanismos reguladores estudados até agora durante esta aula modificam a ATIVIDADEATIVIDADE das moléculas enzimáticas existentes. Entretanto, as células também podem regular a QUANTIDADEQUANTIDADE de enzima presente! Indução e repressão da síntese de enzimas • O aumento (indução) ou a diminuição (repressão) da síntese da enzima leva a uma alteração na população total de sítios ativos, mas a eficiência das moléculas preexistentes da enzima não é afetada! ***Exemplo: níveis elevados de insulina, resultantes de altos níveis de glicose no sangue, levam a um aumento na síntese de enzimas-aumento na síntese de enzimas- chave do metabolismo da glicose. O consumo regular de refeições ricas em carboidratos determinam um aumento nas quantidades de glicoquinase, fosfofrutoquinase e piruvato quinase no fígado! Resposta dos mecanismos reguladores -> diferentes escalas de tempo -> diferentes sensibilidades em relação às variações das condições externas! • Exemplo: Glicogênio fosforilase Enzima muito importante na regulação do metabolismo de carboidratos Algumas enzimas reguladoras usam vários mecanismos reguladores R eg ul aç ão C O VA LE N T E R eg ul aç ão A LO S T É R IC A R eg ul aç ão C O VA LE N T E R eg ul aç ão A LO S T É R IC A Qual é a vantagem de tal complexidade na regulação das atividades enzimáticas??? • A energia química é usada economicamente, parcelada em várias vias metabólicas ditadas pela necessidade celular; • A disponibilidade de catalisadores poderosos (enzimas), cada um específico para uma certa reação, torna a regulação dessas reações possíveis. Esta regulação por sua vez da origem a uma sinfonia complexa altamente regulada VIDA
Compartilhar