Análises Físico-Químicas e Microbiológicas

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ANALISES FÍSICO-QUÍMICA
ACIDEZ TITULÁVEL
- Preparar e padronizar a solução de hidróxido de sódio (NaOH) para análise de acidez titulável total (ácidos orgânicos totais).
I.	Padronizar NaOH 0,1N (pode-se usar NaOH 1N caso a amostra apresente alta quantidade de ácidos orgânicos)
a) Preparar 100 mL de NaOH 0,1N a partir de um reagente sólido com pureza de 99,99%;
b) Acondicionar a solução de NaOH 0,1N em frasco de plástico e rotular (data, concentração, analista e fator de correção);
A solução NaOH 0,1N deve ser padronizada para determinar a concentração real. O padrão primário bfitalato de potássio, KHC8H4O4 (MM = 204 g/mol) será empregado:
c) Pesar 0,400g a 0,500g de bfitalato de potássio previamente seco em estufa a 120°C durante 30 minutos e transferir para um Erlenmeyer de 250mL;
d) Dissolver em 25 mL de água destilada e adicionar 2 a 3 gotas do indicador fenolftaleína 1% (p/v); (a fenolftaleína 1% é preparada com etanol P.A.)
e) Lavar a bureta 3 vezes com 5mL da solução de NaOH 0,1N (rinsar a vidraria com NaOH 0,1N)
f) Adicionar NaOH 0,1N na bureta até 1 a 2 cm acima do zero e ajustar o volume a 0
mL;
g) Titular com a solução de NaOH 0,1N até viragem do indicador de incolor para rosa;
h) Anotar o volume de NaOH 0,1N usado e calcular o fator de correção de acordo com
a equação (I):
Onde:
Mbfitalato
𝐹𝑐 = 𝑚𝐸𝑞 𝑏𝑓𝑖𝑡𝑎𝑙𝑎𝑡𝑜 × 𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 × 𝑁𝑁𝑎𝑂𝐻
Mbfitalato= massa de bfitalato (g);
mEqbfitalato= miliequivalente do bfitalato de potássio (mEq = Mm/nº equivalentes);
VNaOH= volume de NaOH 0,1N gastos na titulação (mL);
NNaOH= normalidade da solução de NaOH;
I. Determinar a acidez das amostras
a) Pese uma quantidade de 2 a 5 g de amostra, adicione 50 mL de água destilada e homogeneizar. Anote a massa das amostras;
b) Adicionar 2 a 3 gotas de fenolftaleína 1% (p/v) nas amostras;
c) Titular com a solução de NaOH 0,1N até viragem do indicador de incolor para rosa (se a amostra apresentar cor escura, a titulação deve ser realizada com auxílio de um pHmetro até atingir o pH de 8,2);
d) Anotar o volume de NaOH 0,1N usado e calcular a acidez titulável das amostras de acordo com a equação (II):
Onde:
𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 𝑡𝑖𝑡𝑢𝑙á𝑣𝑒𝑙 (%) = 100 𝑥
𝑉 × 𝑁 × 𝑚𝐸𝑞.
𝑚𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎
V = volume de NaOH (mL);
N = normalidade de NaOH corrigida;
m = massa da amostra (g) ou volume da amostra (mL); mEq. = do ácido orgânico predominante.
SÓLIDOS SOLÚVEIS TOTAIS
a. Limpar o prisma do refratômetro com água destilada e secar com papel macio;
b. Calibrar o equipamento com água destilada (você deve visualizar na escala as seguintes informações: 1,3330 de índice de refração e 0°Brix);
c. Adicionar a amostra e anotar o valor de sólidos solúveis totais; (amostras líquidas podem ser analisadas diretamente, enquanto amostras sólidas ou com altas viscosidades podem ser diluídas com água destilada. Neste caso, pese uma quantidade, 2 a 10 g, de amostra e adicione 25 a 50 mL de água destilada, homogeneizar e medir o °Brix. Anote o fator de diluição para corrigir a resposta.);
pH
a. Ligar o pHmetro, lavar o eletrodo com água destilada e calibrar com as soluções tampões 4 e 7 (as soluções tampões devem estar na temperatura ambiente);
b. Transferir a amostra para um béquer e imergir o eletrodo na amostra (amostras líquidas podem ser analisadas diretamente, enquanto amostras sólidas ou com altas viscosidades podem
ser diluídas com água destilada. Neste caso, pese uma quantidade, 2 a 10 g, de amostra e adicione 50 mL de água destilada, homogeneizar e medir o pH);
c. Anotar o valor de pH.
ANÁLISE MICROBIOLOGICA
COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES
Para a análise de coliformes totais e termotolerantes utilizou-se técnica de tubos múltiplos com três séries de tubos contendo caldo Lauril Sulfato Triptose (LST), obtendo os resultados em NMP/100mL. A incubação foi em temperatura entre 35-37°C por 24-48 horas. Após este período foi verificado se houve presença de turvação e gás que caracterizam um crescimento, ou seja, resultado positivo para o teste presuntivo.
CONTAGEM DE Escherichia coli
A contagem de bactérias heterotróficas, após o procedimento de coleta descrito no item 2.1, as amostras foram diluídas em 9 mL de salina 0,9 % até 10-3. A técnica foi realizada pelo método Pour plate, semeadura em profundidade. Para tanto foram retiradas alíquotas de 1 mL de amostra não diluída e também de cada uma das diluições e colocados em placas de petri estéreis nas quais foram vertidos 20mL de ágar PCA. O cálculo foi expresso em unidades formadoras de colônias por 100cm².
Salmonella spp
Inicialmente fez-se a diluição das amostras, no qual 25 ml de cada amostra foram transferidos para um recipiente para homogeneização contendo 225 mL de água peptonada tamponada 1% e posterior incubação a 37ºC por 18-20 horas, compondo a fase de pré- enriquecimento. A fase de enriquecimento seletivo consistiu-se na transferência de uma alíquota da amostra pré-enriquecida para caldo Tetrationato, que deve ser incubado a 37º±1ºC por 24h. Em seguida, realizou-se o estriamento das amostras, o meio de cultura utilizado foi o Salmonella Shigella Ágar (KASVI), que foi incubado a 37±1ºC por 24 horas. Após o período de incubação, fez- se a leitura das placas por meio da observação de colônias, mediante as características morfológicas da Salmonella. No meio SS o crescimento de espécies de Salmonella aparece em colônias incolores com centros pretos e Shigella também aparece na forma de colônias transparentes, porém sem centros pretos.
Para a confirmação da presença de colônias de Salmonella spp. foram feitos os testes bioquímicos Ágar Tríplice açúcar ferro, que através da viragem de cor do meio de rosa para o amarelo, demonstra o crescimento de micro-organismos que utilizam os açúcares presentes no meio como fontes de energia e o Citrato de Simmons, utilizado para a diferenciação de microrganismos que usam o citrato como fonte de carbono para seu metabolismo em um ambiente laboratorial.
Staphylococcus aureus
Foram separadas 25 gramas de diferentes partes de cada amostra, que foram homogeneizadas em 225 mL de água peptonada para obtenção de diluição 10-1, a partir dessa, foram preparadas as demais diluições no mesmo diluente, obtendo-se 10-2 e 10-3. Alíquotas de 0,1 mL, de cada diluição e de todas as amostras, foram utilizadas para a cultura em duplicata em placas de Petri contendo ágar Baird-Parker, além dos controles positivo e negativo, que foram incubadas em estufa a 36°C no período de 48 horas.
Como o ágar é apenas moderadamente seletivo para estafilococos, faz-se necessária a realização de provas bioquímicas confirmatórias, como a prova da catalase e o teste de Gram para confirmação de estafilococos, e a prova da coagulase para comparação dos resultados com as normas sanitárias vigentes. Foram selecionadas cinco colônias para cada amostra, três típicas e duas atípicas; e cinco atípicas na ausência de crescimento de típicas, conforme Ferreira, e elas foram transferidas para tubos contendo caldo de Infusão de Cérebro Coração (BHI), incubadas por 24 horas à temperatura de 37ºC, para obtenção de colônias puras. A partir daí, realizaram- se novas subculturas em placas de petri contendo ágar Nutriente, para gerar células suficientes para os testes bioquímicos.
A partir do subcultivo em caldo BHI, o teste da coagulase foi realizado, para classificar as bactérias do gênero estafilococos em coagulase positiva ou negativa, em um tubo estéril, contendo 0,3 mL de plasma de coelho, acrescentou-se 0,3 mL do subcultivo, incubou-se por 24 horas para observar a formação ou não de coágulo. Foram coletadas amostras de colônias obtidas por meio do subcultivo do ágar Nutriente para a realização da coloração de Gram, fez- se o esfregaço com uma gota de solução salina, e após secagem foi realizada a coloração e observação das mesmas. A prova da catalase é usada para observar se há produção dessa enzima; foi realizada utilizando-se as colônias obtidas do mesmo subcultivo do ágar Nutriente, sobre a colônia foi colocada uma gota deperóxido de hidrogênio a 3% para observar a formação de borbulhas, provenientes da sua decomposição, pela enzima, em água e oxigênio.