AULA PRÁTICA 2 - ROTEIRO DE APRENDIZAGEM

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Roteiro de Aula prática 2
	Microbiologia clínica 
	CURSO
Biomedicina
	PERÍODO
7°
	
	DOCENTE
Drielly Lima Santana
	 Data
12/05/2023
	
	TEMA DO ROTEIRO DE APRENDIZAGEM 
AULA PRÁTICA 2 – COLORAÇÃO DE GRAM E ANTIBIOGRAMA
	
	COLORAÇÃO DE GRAM
	· Preparo do esfregaço
1. microrganismos cultivados em meio líquido: retirar do tubo de cultura, com o auxílio de uma alça de platina, 1 a 3 gotas de meio e colocar sobre uma lâmina previamente limpa (obs.: Se a cultura não tiver uma grande quantidade de células, pode-se separar, em um tubo de ensaio, alguns mililitros da cultura, centrifugar e ressuspender em menor quantidade de meio.)
2. microrganismos cultivados em meio sólido: colocar 1 a 2 gotas de solução salina estéril sobre a lâmina de vidro previamente limpa; após, recolher com a alça de platina uma pequena porção do crescimento de microrganismos e homogeneizar na gota de salina. 
3. Fazer um esfregaço espalhando as células com movimentos circulares sobre a lâmina. 
4. Deixar o esfregaço secar. (Atenção: não se deve assoprar sobre o esfregaço ou balançar a lâmina ao ar, pois outros microrganismos podem contaminar a amostra.)
5. fixar pelo calor passando-se a lâmina de vidro contendo o esfregaço 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen não deixando tocar no fogo. (ou até secar). (obs.: A lâmina também pode ser fixada com metanol). 
· Método de coloração 
1. Cubra o esfregaço com cristal violeta e deixe agir por 1 minuto. 
2. Remova o corante com um filete de água corrente.
3. Coloque a solução de lugol sobre o esfregaço e deixe agir durante 1 minuto. 
4. Remova a solução de lugol com um filete de água corrente. 
5. Lave o esfregaço com etanol 95% até que o etanol que escorre da lâmina fique transparente. 
6. Remova o etanol com um filete de água corrente.
7. Adicione o corante fucsina durante 30 segundos. 
8. Remova o corante fucsina com um filete de água corrente ou destilada
9. Deixe secar a temperatura ambiente ou seque cuidadosamente com papel-filtro (cuidado para não estragar o esfregaço corado!)
· Leitura e interpretação
1. Observar ao microscópio com foco na objetiva com aumento de 100x utilizando óleo de imersão. 
2. 
· As bactérias coradas de rosa avermelhadas são gram-negativas. 
· As bactérias coradas de roxo (púrpura) são gram-positivas.
	
TSA – TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS 
(ANTIBIOGRAMA)
Antibiograma pelo método de Kirby-Bauer (disco difusão)
· Preparo da amostra
1. Colocar em um tubo de ensaio 500 ul de solução fisiológica;
2. Retirar 2 colônias das bactérias a serem testadas e colocar no tubo contendo a solução. Mexer para que a bactéria se misture no líquido e comparar com a turbidez (turvação) da escala 0,5 de MacFarland. 
(Obs.: caso sua amostra fique mais turva, adicionar mais solução fisiológica até igualar com a turvação da escala 0,5 de MacFarland. Caso fique mais clara, adicionar mais amostra da bactéria até igualar com a turvação da escala 0,5 de MacFarland.)
· Semeadura 
3. Técnica com Swab: Umedecer, em condições assépticas, um swab no tubo com a amostra preparada e comprimir o swab na parede interna do tubo para retirar o excesso do inoculo e semear na superfície do ágar Mueller Hinton em três direções. Semear toda a superfície da placa de Petri contendo o meio ágar Mueller Hinton, pelo método de distensão, ou seja, semear de forma homogênea, como se fosse um “tapete” sobre a superfície do meio visando obter um crescimento confluente.
Técnica com alça de Drigalski: Transferir 100 uL da amostra para o meio sólido na placa e espalhar uniformemente por toda a placa utilizando a alça de Drigalski.
4. Deixar a placa semeada tampada por no mínimo 5 minutos e máximo 15 minutos à temperatura ambiente, para que o inóculo seja completamente absorvido pelo ágar antes de aplicar os discos.
· Aplicação dos discos 
5. Flambar uma pinça, esperar esfriar e pegar o disco de antibiótico, colocar no meio inoculado com a bactéria a ser testada e pressionar levemente a superfície de cada disco com a pinça para fixar. (obs.: Uma vez o disco colocado, não remover do lugar, pois a difusão da droga é imediata.)
Nota; A distância entre um disco e outro dever ser no mínimo de 24 mm. Colocar no máximo 12 discos em placas de 150 mm (grande) e não mais que 5 em placas de 90 mm (médias).
6. Aguardar cerca de 5 min e incubar as placas invertidas em estufa com temperatura de 35 ± 2°C (37°C) pelo período de 16 a 18 horas. 
· Interpretação dos resultados
7. Com uma régua ou paquímetro, medir quantos milímetros possui os halos de inibição do crescimento bacteriano ao redor dos discos. O resultado é anotado em milímetro (mm).
8. Os halos de inibição para cada antimicrobiano testado devem ser interpretados nas categorias sensível, intermediário ou resistente, com seu resultado comparado com os critérios estabelecidos nas tabelas do BrCAST. 
 
Referências bibliográficas:
· VERMELHO, Alane B. Práticas de Microbiologia. Rio de Janeiro – RJ: Grupo GEN, 2019. E-book. Disponível em: https://integrada.minhabiblioteca.com.br. Acesso em: 11 mai. 2023.
· Jorge, A.O.C. Microbiologia: atividades práticas, 2a edição. Ed. Santos. São Paulo, SP, 2008.
· Oplustil, C.P.; Zoccoli, C.M.; Tobouti, N.R.; Sinto, S.I. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica, 3a edição.Ed. Sarvier, São Paulo- SP, 2010. 
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