Mutações e Detecção da Variação Genética

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Mutações e Detecção da Variação Genética 
→ Nem toda mutação é ruim 
→ As mutações podem ser herdadas, como 
as que ocorrem nos gametas mas muitas 
delas são novas que podem ocorrer nas 
células germinativas dos pais ou diretamente 
no embrião 
→ Existem aproximadamente 80 mutações 
novas em cada indivíduo que são 
responsáveis pela variabilidade genética, 
mas algumas vezes estão associadas à 
doenças genéticas, podem alterar 
características físicas, desenvolvimento 
neurológico, intelectual, síndromes genéticas 
 
Variação genética humana 
→ Temos entre 4 a 5 milhões de mutações no 
nosso DNA, também chamadas de variantes 
→ A maioria das mutações não está 
associada à doenças: 
 Outras características (cor do olho, 
estatura, etc.) 
 Sem efeito 
→ Mutações de menor gravidade: risco para 
doenças multifatoriais – diferentes mutações 
+ efeitos ambientes para se manifestarem 
→ Doenças genéticas – mutações 
patogênicas → raras (1-2% da população) 
→ Mutações: nova sequência nucleotídica 
no DNA (alteração) 
 Fonte de toda a variabilidade genética 
→ alelos 
 Base para o diagnóstico genético 
 Medicina forense 
 Últimos 25 anos: detecção de milhares 
de novos polimorfismos ao nível do 
DNA 
 
→ Alelos: versões alternativas da sequência 
de DNA em um lócus – diferença comparada 
com a sequência original: 
 
 
→ Alelo predominante: tipo selvagem ou 
alelo comum – o mais presente na 
população, provavelmente o que não está 
mutado, que não tem variante 
→ Alelos variantes/mutantes: diferem do alelo 
selvagem, devido à presença de uma 
mutação: 
 Polimorfismo: presença de 2 ou mais 
alelos relativamente comuns 
(frequência > 1%); 
→ Alelos particulares: raros – restritos a 
algumas pessoas ou famílias 
 
 
Mutações gênicas 
→ São mutações menores que as 
cromossômicas – para enxergá-las é 
necessário utilizar uma técnica que tenha 
uma resolução maior 
 Nucleotídeo único até 
aproximadamente 100kb 
→ Alterações na estrutura do DNA que 
envolvem a substituição, deleção ou 
inserção de DNA 
→ A substituição pode ter consequências pois 
altera a sequência do DNA, e 
consequentemente, a sequência do RNAm 
→ Deleção e inserção são as mutações que 
causam mudança de matriz de leitura, o 
RNAm é lido de 3 em 3 bases, e ao deletar ou 
inserir bases, muda toda a trinca, e assim, 
consequentemente, muda todo o resto da 
matriz de leitura 
 
 
 
 
→ As mutações gênicas podem ser 
chamadas de mutações de ponto 
 
• Silenciosa: substitui a base mas não muda o 
aminoácido, ou seja, a proteína continua 
exatamente igual 
• Sentido trocado: troca o aminoácido e 
provavelmente terá consequências 
• Sem sentido: criam códons de fim antes de 
fazer a proteína por completo 
• Regulatória: aumenta, diminui, ou a impede 
a transcrição 
• Processamento de RNAm: transcrito 
primário que precisa ser processado – 
qualquer mutação que afete parte de 
splicing, colocar CAP, cauda poliA, gera 
consequências para estabilidade do RNAm 
• Mutações dinâmicas: envolvem expansão 
de trinucleotídeos. 
 
SNPs 
→ Alelos que vão ser formados quando 
tivermos substituições 
→ Os SNPs são polimorfismos de nucleotídeo 
único, ou seja, uma única substituição de 
base 
→ Maioria acontece em regiões não 
codificantes, íntrons e sequências distantes 
de genes conhecidos; 
→ Entretanto já existem mais de 100.000 SNPs 
identificados em éxons 
 Metade não altera a sequência de 
aminoácidos prevista para a proteína 
(sinônimos) e metade altera (não-
sinônimo) 
→ Geralmente um gene apresenta apenas 
dois alelos 
 
Polimorfismos indel 
→ Alelos formados quando tivermos inserções 
ou deleções 
→ Mais de um milhão de indels descritos: 
 Metade = indels simples → apenas 2 
alelos – 1 selvagem e 1 que apresentou 
uma inserção ou uma deleção 
 
 
Polimorfismos STR 
→ Polimorfismos de repetições curtas em 
tandem (STR): indels multialélicas devido a 
números variáveis de um segmento de DNA 
inserido em tandem em determinado local 
(microssatélites) – repetições curtas uma em 
seguida da outra 
 Fora dos genes – normalmente se 
associam a regiões repetitivas 
 Não “aumentam” 
 Variabilidade normal 
→ Então, locus STR: lócus de microssatélite 
que nos ajuda para casos de paternidade, 
para casos de genética forense, pois é uma 
maneira de variabilidade humana fácil de ser 
analisado 
 
 
→ É analisado diferentes locus em diferentes 
cromossomos pois a ideia é que não 
aumente 
 
Mutações dinâmicas 
→ Repetições expandidas de trinucleotídeos 
instáveis – sequência repetitiva será sempre 3 
→ Instável pois pode aumentar 
→ Não se sabe o que justifica esse aumento, 
mas pode ser devido ao deslizamento da 
DNApolimerase, erros de pareamento na 
replicação e falha no reparo de mal 
pareamento 
→ Maior expansão durante a gametogênese 
do que a observada em microssatélites; 
→ Tamanho crítico - podem alterar a função 
ou regulação gênica 
→ Existem aproximadamente 30 doenças 
genéticas descritas que apresentam 
mutações dinâmicas: 
• Antecipação: maiores/mais precoces em 
gerações sucessivas 
• Efeitos notáveis da origem parental: 
diferenças biológicas e seleção contra 
gametas – linhagem materna ou paterna 
 
 
Variação genética humana 
→ Doença genética: mutação em um gene 
essencial modifica a quantidade ou função 
de seus produtos gênicos, ou ambos (mRNA, 
proteína e ncRNAs) 
→ A genética médica lida com as 
consequências funcionais de mutações 
humanas 
 
Efeito das mutações 
→ Perda de função: mutação que resulta em 
atividade reduzida ou menor quantidade do 
produto normal 
 Herança recessiva (maioria) ou 
dominante (haploinsuficiência) 
 Severidade clínica geralmente 
relacionada à quantidade de função 
perdida 
→ Ganho de função: aumento da atividade 
ou quantidade do produto gênico 
 Herança dominante; 
 Novas propriedades; 
→ Efeito dominante negativo: o produto do 
alelo mutante interfere no produto de outro 
alelo normal, levando a um resultado geral 
adverso 
Impacto da mutação e do 
polimorfismo 
→ Estima-se que o polimorfismo ocorra em ~ 
20% dos genes codificantes de proteínas de 
um indivíduo, determinando polipeptídeos 
estruturalmente diferentes; 
→ Entre indivíduos diferentes, mesmo quando 
o produto gênico é idêntico, os níveis de 
expressão desse produto podem ser muito 
distintos → variação genética e epigenética 
→ Grau considerável de individualidade 
bioquímica (composição de enzimas e outros 
produtos gênicos) = cada indivíduo, 
independente do seu estado de saúde, 
possui uma composição única e 
geneticamente determinada, respondendo 
de maneira única às influências ambientais, 
alimentares e farmacológicas 
 
Doenças de Expansão 
de Trinucleotídeos 
→ Distúrbio neurodegenerativo progressivo, 
autossômico dominante – ocorre mesmo que 
apenas um alelo seja mutado 
→ Mutações no gene HD (4p16.3), mutação 
de expansão de trinucleotídeos, é uma 
expansão CAG, no primeiro exón: 
• 10-26 repetições: alelos normais; 
• 27-35 repetições: potencial de expansão – 
• 36-39 repetições: penetrância reduzida – 
penetrância incompleta. 
• + 40 repetições: afetados 
 
→ A expansão está dentro do éxon (região 
codificante), o trinucleotídeo CAG codifica 
para glutamina – maior a expansão, mais 
glutamina vai ser adicionada na proteína 
→ Quando temos mais de 40 (excesso de 
glutamina), se torna neurotóxica e é a 
proteína mutada. 
→ Então, a proteína é chamada de 
huntingtina, e é expressa de forma ambígua, 
ou seja, nos mais diferentes tipos celulares. 
 
→ Início da doença: 40 – 50 anos 
 Idade inversamente proporcional ao 
número de repetições CAG - quanto 
mais repetições, manifesta Huntington 
mais cedo 
 Número de repetições não se 
correlaciona com outras características 
 Expectativa de vida: 15 anos. 
 
Antecipação paterna 
→ Toda vez que a mutação Huntington 
passar por linhagem do paiela tende a 
expandir, então podemos falar que 
geralmente se espera que toda a prole do 
homem vai ter mais repetições do que ele e 
tende a ter essa doença mais cedo 
→ Transmissão materna não aumenta o 
número de repetições 
 
 
→ Como a manifestação de Huntington é em 
idade avançada, normalmente quando uma 
pessoa descobre que ela tem Huntington ela 
já se reproduziu, então ela tem 50% de 
chances de ter passado essa doença que 
não tem cura para sua prole. 
→ Em caso de história familiar, pode fazer 
teste: pré-sintomático, pré-natal ou pré-
implantação, para ver se essa mutação está 
passando ou não 
→ Proteína mutada → propriedade nova – 
ganho de função (neurotóxica): 
 Atrofia grave e difusa do neoestriado; 
 Disfunção neuronal; 
 Atrofia cerebral generalizada; 
 Mudanças nos níveis de 
neurotransmissores 
 Acúmulo de agregados nucleares e 
citoplasmáticos neuronais 
 Levando morte neuronal 
 
→ Progressivamente os pacientes começam 
a apresentar os sintomas e são divididos em 
três classes: 
 Anomalias motoras: coreia e distonia 
 Anomalias cognitivas: perda de 
cognição acentuada 
 Distúrbios comportamentais e 
psiquiátricos: mudança de 
personalidade 
 
 
→ Risco de herança: 
 Depende do número de repetições 
 Genitor com DH: risco de 50% de herdar 
um alelo mutante 
 Indivíduos que herdam a mutação do 
pai possuem maior risco de desenvolver 
a doença com início precoce - 
tendência é expandir 
 Crianças de pais portadores de pré-
mutação possuem risco empírico de 3% 
 
 
→ Forma herdável mais comum de 
deficiência intelectual (moderada a grave). 
→ Subdiagnosticada e é diagnosticada 
errado muitas vezes 
→ Requer consideração no diagnóstico 
diferencial de deficiência intelectual; 
→ 3-6% dos casos de deficiência intelectual 
entre meninos com uma história familiar 
positiva de deficiência intelectual e nenhum 
defeito de nascimento; 
→ Indicações frequentes para análise 
genética – achados clínicos não são 
conclusivos. 
→ Mutações no gene FMR1, localizado em 
Xq27.3; 
→ Herança ligada ao X 
→ Sítio frágil: local muito fácil de se quebrar 
 
→ Expansão CGG em região 5’ não-traduzida 
do gene FMR1 
→ Quando tem a expansão desse 
trinucleotídeo, aumenta a metilação, que na 
região do promotor do gene não deixa com 
que a transcrição ocorra, se o gene não é 
transcrito o problema é de falta de proteína 
 
 
→ Nessa síndrome, o tamanho crítico é 200 
repetições 
→ Normais tem menos de 45 repetições 
→ Zona de pré-mutação: entre 55 e 200 
 
→ Indivíduos que tem pré-mutação não tem 
X-frágil, mas podem apresentar 
manifestações clínicas, as mulheres podem 
apresentar menopausa precoce ou 
insuficiência ovariana e os homens podem 
apresentar ataxia e tremores 
 
 
Antecipação materna 
→ Tende a expandir quando passar pela mãe 
→ Aqui não se relaciona com idade, e sim 
com agravamento de sintomas, mas não é 
muito certeira essa informação 
 
→ Porcentagem de chance de expansão e o 
número de repetições de cada mulher: 
 
→ A proteína FMRP é expressa em muitos 
tipos celulares, sendo mais abundantemente 
nos neurônios; 
→ Parece atuar como chaperona de mRNAs 
do núcleo, interferindo com a tradução; 
→ Metilação excessiva no promotor: impede 
a expressão do gene e interfere na 
replicação e condensação da cromatina, 
produzindo o sítio frágil (região que não 
conseguiu ser compactada como deveria) 
 
→ Doença mais comumente em meninos 
→ Deficiência intelectual; 
→ Anomalias do comportamento; 
→ Rosto longo com mandíbula e testa 
proeminentes, orelhas grandes e 
macrorquidismo pós-puberal. 
→ Expectativa de vida normal 
→ Risco de herança: mulher com pré-
mutação ou mutação completa → risco 
empírico de 50% para filhos homens. 
Técnicas de diagnóstico 
molecular 
→ Conhecimento funcional das técnicas e de 
como elas podem ser usadas para o 
diagnóstico dos distúrbios genéticos 
→ Análise de DNA: crianças e adultos, 5-10ml 
de sangue periférico, o DNA extraído pode 
ser armazenado por muitos anos; 
→ Amostras menores (gota de sangue, fios de 
cabelo, mucosas) e pré-natal. 
 
→ Utilizados para analisar doenças causadas 
por expansão de trinucleotídeos, testes de 
paternidade, criminalística, variabilidade 
normal entre pessoas, etc. 
 Microssatélites; 
 Minissatélites. 
→ Revela diferentes alelos devido a diferentes 
números de repetições 
→ Não analisa a sequência do DNA e sim o 
seu tamanho 
→ Polymerase Chain Reaction – Reação em 
cadeia da polimerase 
→ Técnica de amplificação de sequências 
específicas de DNA – aumenta a quantidade 
de DNA: 
 Pode ser um gene, uma parte de um 
gene ou uma sequência não 
codificante; 
→ Uma pequena quantidade de uma 
sequência curta de DNA é amplificada 
milhões de vezes, de modo que possa ser 
submetida a análise de tamanho, mutação 
ou sequenciamento 
→ Visualização - Eletroforese: técnica que 
utiliza a característica química das moléculas 
biológicas carregadas para separá-las em 
uma matriz em gel (substância densa) 
 
 
→ Paternidade: alvo na PCR – Locus de STR 
 
→ Lócus analisados na mãe e do pai, os filhos 
que tem que vir ou do pai ou da mãe 
 
→ Diagnóstico de doenças com expansão 
de trinucleotídeos: 
 Primers flanqueando a região de 
expansão 
 PCR e análise do gel. 
→ Acima ou abaixo do número de repetições 
 
 
→ Microarranjo: chip com sequências 
diferentes de DNA sob a forma de uma 
grade 
→ Investigação de milhares de genes de 
maneira simultânea → revolução na 
medicina preditiva, diagnóstica e 
farmacológica 
→ Identificação de microdeleções ou 
microduplicações (CNVs – variação no 
número de cópias) → CGH-array; 
→ Identificação de CNVs, SNPs, perdas de 
heterozigose (LOH), dissomia uniparental, 
consanguinidade e mosaicismo → SNP-array. 
 
→ Recomendações (American College of 
Medical Genetics): 
→ “Primeira linha de investigação para 
pacientes com deficiência intelectual, 
autismo, atraso no DNPM e malformações 
congênitas de causa desconhecida”. 
 Indivíduos com anomalias múltiplas que 
não caracterizam síndromes genéticas 
conhecidas 
 Deficiência intelectual ou atraso DNPM 
 Diagnóstico ou suspeita clínica de 
autismo 
 Malformações congênitas ou genitália 
ambígua 
 Suspeita de síndromes de microdeleção/ 
duplicação reconhecíveis clinicamente 
 Presença de material cromossômico 
adicional indeterminado no cariótipo. 
 
 
 
→ Processo de determinação da ordem 
precisa de nucleotídeos na molécula de DNA 
→ Sanger, 1974; 
→ Atualmente: diferentes técnicas de 
sequenciamento automatizado → mais 
rápido e “barato” (sequenciamento de nova 
geração – NGS) 
→ Reação de Sequenciamento (replicação): 
 1 Primer 
 Nucleotídeos normais e modificados 
(dideoxi) 
 Polimerase. 
 
→ Genoma x gene 
→ Exoma 
→ Sequenciamento gênico 
 
 
 
 
 
 
→ Sequenciamento dos éxons; 
 Suspeita clínica de doença genética 
conhecida, que permanece sem 
diagnóstico após investigação por 
outras metodologias 
 Suspeita clínica de doença com grande 
heterogeneidade de locus 
 Paciente com quadro clínico atípico, 
atraso inexplicável do DNPM, deficiência 
intelectual, malformações e/ou 
distúrbios da diferenciação sexual, que 
podem ser causados por mutações 
ainda não descritas; 
→ Não é recomendado para investigar 
doenças associadas à expansão de 
sequências repetitivas 
→ Resultados: 
 Variantes de significado incerto (VUS); 
 
 Achados incidentais (secundários). 
 
→ Sequenciamento do genoma completo; 
 Alto custo 
 Maior número de VUS e achados 
incidentais