Relatório - ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE PESCADO

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ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE PESCADO 
1 INTRODUÇÃO 
		De acordo com Gonçalves (2011), o termo pescado designa todo organismo aquático de origem fluvial, marinha ou estuarina, que pode ser utilizado na alimentação humana, como peixes, moluscos, crustáceos, anfíbios, quelônios, dentre outros. O pescado representa uma das principais fontes de proteínas na alimentação humana, sendo utilizado também na indústria de óleos, rações, farinha de peixe e outros produtos de alto valor comercial (ORDÓÑEZ, 2005).
	O pescado é um alimento que se destaca nutricionalmente quanto à quantidade e qualidade de proteínas, à presença de vitaminas e minerais e, também, por ser fonte de ácidos graxos essenciais como por exemplo o ômega-3. O consumo desses lipídios é associado à redução do risco de doenças cardiovasculares e a funções importantes nas fases iniciais do desenvolvimento humano (SARTORI, AMANCIO, 2015).
O pescado, por apresentar pH próximo à neutralidade, elevada atividade de água e alto teor de nutrientes, é o alimento de origem animal com condições mais prováveis de deterioração.
De acordo com Soares e Gonçalves (2012), a carne de pescado possui uma constituição química peculiar que lhe confere riqueza nutricional, porém com alto potencial de deterioração. Neste contexto, os benefícios nutricionais deste grupo alimentar só podem ser aproveitados quando os fatores segurança e qualidade forem garantidos, tornando-se fundamental o emprego de ferramentas que possam agir na contenção dos mecanismos de deterioração, como o emprego da cadeia do frio em todas as etapas do seu processamento.
O grau de frescor geralmente determina a qualidade do pescado. O emprego de ferramentas de avaliação do frescor durante todo período de comercialização desses produtos é fundamental para que seja possível o aproveitamento dos benefícios nutricionais. Diante do exposto, o presente trabalho tem por objetivo determinar o Número Mais Provável (NMP) de coliformes termotolerantes a 45ºC e a contagem de estafilococos coagulase positiva em uma amostra de pescado. 
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Material
A prática foi realizada a partir da coleta de uma amostra de 25 g de pescado da espécie Carapeba (Diapterus rhombeus), pescado no dia 05 de outubro do ano vigente, por meio de pesca submarina com arpão, em Genipabu - RN. O peixe foi mantido sob temperatura de congelamento, com vísceras e escamas, até o dia 26 de novembro de 2018. A amostra foi transportada de casa até o Laboratório de Microbiologia de Alimentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) para realização das análises microbiológicas de coliformes termotolerantes, em um recipiente plástico tampado, com gelo, por um período de aproximadamente 1 hora.
Os materiais utilizados nas análises foram os seguintes:
· Amostra: 25 g do pescado da espécie Carapeba; 
· 1 placa de Petri estéril grande;
· Pinça estéril;
· Tesoura estéril;
· Bico de Bunsen;
· Fósforo; 
· Balança digital de precisão; 
· Erlenmeyer contendo 225 mL do diluente água peptonada tamponada (BPW); 
· Pincel marcador permanente; 
· Pipeta automática de 1 mL;
· Pipetas de vidro de 1, 2 e 5 mL; 
· Estante para tubos de ensaio;
· 2 tubos de ensaio contendo 9 mL do diluente água peptonada tamponada;
· 9 tubos de ensaio com contendo 10 mL de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST); 
· 3 placas de Petri com Ágar Baird-Parker (BP);
· Alça de Drigalski;
· 1 tubo de ensaio contendo Caldo de Infusão Cérebro e Coração (BHI);
· Alça de platina; 
· Estufa à 35°C;
· Contador de colônias.
2.2 Métodos
Todas análises microbiológicas do pescado foram conduzidas no Laboratório de Microbiologia de Alimentos, no Departamento de Nutrição, da UFRN, nos dias 28 e 29 de novembro e 03 de dezembro do corrente ano. Para a análise microbiológica foram utilizados os critérios estabelecidos no manual técnico para análises microbiológicas, de SILVA et al., 2010.
2.2.1 Preparo da amostra 
No 1° dia de análise (28/11/2018), ao chegar no Laboratório de Microbiologia de Alimentos realizou-se o procedimento de higienização das mãos e da bancada, em seguida deu-se início ao preparo da amostra. Ligou-se a chama do Bico de Bunsen com fósforo e colocou-se a amostra em uma placa de Petri estéril grande. Logo após, triturou-se a amostra na placa com o auxílio de pinça e tesoura estéreis. Posteriormente a trituração da amostra, transferiu-se para um erlenmeyer contendo 225 mL de água peptonada tamponada (BPW) 25 g da amostra e em seguida identificou-se com um pincel marcador permanente o erlenmeyer com o número do grupo (G4) responsável pelas análises microbiológicas e homogeneizou-se a solução por 2 minutos, obtendo-se assim a diluição inicial 10-1. Por fim, preparou-se as diluições seriadas, onde foi retirado 1 mL da diluição inicial e transferiu-se para um tubo com 9 mL do diluente água peptonada, formando a diluição 10-2, deste último tubo, transferiu-se mais 1 mL para outro tubo, também contendo 9 mL do mesmo diluente, dando origem a diluição 10-1.
2.2.2 Determinação do NMP de coliformes termotolerantes a 45°C/Teste presuntivo
Após o preparo da amostra, ainda no 1°dia de realização de análise, foi realizada a prova presuntiva. Transferiu-se 1 mL de cada diluição (10-1, 10-2 e 10-3) para 3 tubos de ensaio contendo em cada 10 mL de Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) e em seguido incubou-se os tubos inoculados em estufa a 35°C por 24 horas. Ao final desse tempo, observou-se se houve turvação ou formação de gás em alguns dos tubos para que fosse realizado o teste confirmativo. 
2.2.3 Contagem de Estafilococos coagulase positivo
Ainda no 1º dia de realização de análise, realizou-se o plaqueamento em superfície no Ágar Baird Parker (BP), identificou-se três placas de Petri com o grupo (G4) e as três diluições (10-1, 10-2 e 10-3), em seguida inoculou-se 0,1 mL com as diferentes diluições, logo depois espalhou-se o inóculo com uma alça de Drigalski, flambou-se a alça e espalhou-se as da maior para a menor diluição. Incubou-se as placas de maneira invertida em estufa a 35°C durante 44 horas.
2.2.4 Contagem de colônia típicas e atípica
No 2° dia de análise (29/11/2018), contou-se o número de colônias negras, lustrosas, com bordo opaco e halo transparente presentes nas placas de Petri incubadas.
2.2.5 Teste de coagulase
	O terceiro dia de análise (03/12/2018) foi destinado à pesquisa exclusiva de Estafilococos coagulase positivo. Em um novo tubo de ensaio foi adicionado, com auxílio de pipeta automática, 0,2 mL da cultura em BHI (caldo infusão de cérebro e coração), que permaneceu em estufa a 35ºC por 96h, e 0,5 mL de plasma de coelho com EDTA, que foi previamente reconstituído por se encontrar em estado liofilizado. O tubo de ensaio foi incubado em estufa a 35ºC por aproximadamente 6h, a fim de se observar a possível formação de coágulo no tubo.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Na determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes termotolerantes a 45°C obteve-se < 3,0 NMP/g, de acordo com a Resolução da ANVISA - RDC Nº 12, de 2 de janeiro de 2001, são permitidos 10³ de Estaf.coag.positiva/g. Todas as diluições dos tubos inoculados apresentaram características negativas para ainda no teste presuntivo, visto que não houve turvação nem produção de gás em nenhum desses. Sendo assim, foi descartada a necessidade da realização da etapa seguinte da análise que seria o teste confirmativo.
Em se tratando da contagem de Estafilococos coagulase positivo, após a retirada das placas de Petri da estufa, as placas não apresentaram colônias negras, lustrosas, com bordo opaco e halo transparente, não apresentando colônia típicas. Apenas a placa com o inóculo da diluição 10-1 apresentou uma colônia com características semelhantes às citadas anteriormente. A referida colônia foi transferida para o caldo BHI e incubada por cerca de 96h, e após o transcurso desse tempo, seguiu-se com o teste da coagulase. Após 6h de incubação a 35ºC o tubo de ensaio contendo a cultura em BHI e o plasma de coelho com EDTA não apresentou formação de coágulo, típico em casos positivosde Estafilococos.
4 CONCLUSÃO 
 
Em virtude dos resultados demonstrados é possível obter como conclusão que o pescado analisado encontra-se próprio para o consumo humano, estando dentro dos padrões estabelecidos pela RDC Nº 12 de 02/2001, da ANVISA. 
REFERÊNCIAS 
GONÇALVES, A. A. Tecnologia do pescado: ciência, tecnologia, inovação e legislação. São Paulo: Ateneu, p. 608, 2011.
 
ORDÓÑEZ, J. A. Tecnologia de alimentos de origem animal. São Paulo: Artmed, v. 2, p. 279, 2005.
SARTORI, A. G. O.; AMANCIO, R. D. Pescado: importância nutricional e consumo no Brasil. Segurança Alimentar e Nutricional, Campinas, SP, v. 19, n. 2, p. 83-93, Fev., 2015. Disponível em: <https://periodicos.sbu.unicamp.br/ojs/index.php/san/article/view/8634613>. Acesso em: 27 de nov. de 2018.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A.; TANIWAKI, M. H.; SANTOS, R. F. S.; GOMES, R. A. R. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e água. 4 ed. São Paulo: Livraria Varela, 2010.
SOARES, K. M. P.; GONÇALVEZ, A. A. Qualidade e segurança do pescado. Biblioteca virtual em saúde. Periódicos Brasileiros em Medicina Veterinária e Zootecnia. v. 71. p. 1-10, 2012.