Imuno - Aula 01

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Aula 01 – Diagnóstico da Interação Antígeno-Anticorpo (Imunodiagnóstico)
Obs: O Ac é produzido especificamente para cada Ag. Ou seja, são extremamente específicos 
Obs: Anticorpo sempre vai em busca do Antígeno
Interações Ag-Ac:
· Ligações não covalentes
· Reversíveis ou Irreversíveis ➔ pH, [sais], T o e atrações iônicas
Obs: IGM = esta com a doença no momento
 IGG= doença está em seu estado crônico 
Características das Interações Ag-Ac:
- Afinidade: Força de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac (em um único epítopo).
- O Ag tem varias partes, e cada parte dessa pode ser detectada (cada parte é chamada de epítopo). Então um único Ag pode ter varios epitopos. 
- Afinidade é a ligação do Ac com um único epítopo. 
 - Avidez: Força de interações total entre Ag-Ac. Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos 
- Especificidade: Capacidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ags. 
- Título: Maior diluição de anticorpos que leva a uma reação positiva
- Determina o máximo que você pode diluir que, se o paciente ainda estiver com a doença, ainda será detectada. 
- Reação Cruzada: Dois Ag diferentes apresentam epítopos estruturalmente semelhantes. Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não relacionado, mas com propriedades químicas similares
- Quando tem uma “confusão” na ligação.
- “Falso positivo”: As vezes tem um Ag diferente, mas o epítopo é o mesmo e, então, o Ac pode ligar no Ag errado, reagir e dar um falso positivo, ou então o epítopo de um outro Ag pode ser parecido com o do original e pode ligar (ligação mais fraca).
- Quando um anticorpo se liga em um antígeno que é muito parecido com aquele que ele é produzido contra.
Gráfico:
Dinâmica de produção de Anticorpos durante a infecção Durante a infecção realiza-se pesquisa de IgM e IgG para diferenciar a fase em que se encontra a doença
IgM é quem esta levado na resposta primária, mas depois, na resposta secundaria que já é crônica aparece no IgG.
Métodos:
Métodos utilizados para diagnóstico 
· Reagentes não marcados (A ligação do Ac altera o estado físico do Ag): 
- Reação de aglutinação, Reação de precipitação, Nefelometria, Turbidimetria, Floculação, ... 
- Métodos que quando dão positivo e não mostram nenhuma cor diferente, não emitem uma fluorescência, são métodos mais simples.
- As vezes esses reagentes são mais qualitativos 
Imunodifusão:
- Difusão de Ag e Ac solúveis em meio fluido ou semi sólido - complexo Ag-Ac 
Simples: fixa-se um dos reagentes no suporte e difunde-se o outro - complexo 
Dupla: ambos movem-se = encontro – complexo
Imunodifusão: Ou o anticorpo, ou antígeno, ou os dois, andam em gel, se difundem.
Ex: Posso ter um gel em que tenho uma região onde de fabrica vem os antígenos e tenho uma região onde coloco uma amostra que vou pesquisar o anticorpo (quando quero saber se no sangue, saliva, urina do meu paciente tem esse Ac). Tenho esse gel e uma região chamada teste, e então a tendência é eles irem de encontro um com o outro, então eles migram pra essa região teste e se difundem. – essa é a imunodifusão dupla
Reação de Precipitação:
- Quantidades de Ag solúvel são adicionadas a uma quantidade fixa de soro contendo o Ac. 
- A medida que a quantidade de Ag aumenta, a quantidade de precipitado também aumenta até um máximo, para depois diminuir.
Tem um Ag no teste e ele é colocado no sangue e, se tiver aquele Ac, irá precipitar.
1) Reação de Precipitação:
- Nessa reação tenho um tubo de ensaio em que vou acrescentar meu reagente, e nesse reagente tem determinado Ag preparado artificialmente, e alem disso, adiciono soro ou sangue ou urina do paciente. Se meu reagente tem Ag, vou procurar na amostra Ac. Com isso acrescento Ag de maneira controlada e adiciono a amostra. Se nessa amostra tiver Ac para esse Ag especificamente, eles irão se ligar formando vários complexos Ag- Ac e eles vão se precipitar.
Resumindo: Se estava tudo límpido, ao colocar um reagente e uma amostra, e esperar passar um tempo, se forma um grumo e vai pro fundo e, isso significa que precipitou = Reação de Precipitação Positiva.
Se naquela amostra não tivesse Ac anti esse Ag, não iriam se ligar, não iria ocorrer precipitação e então seria Não Reagente.
· Precipitação em Solução: Gráfico mostrando que existe uma concentração ideal para fazer esse tipo de reação.
Se aumentar muito a quantidade de antígeno, ao invés de promover a ligação Ag- Ac, acabará promovendo uma separação dos dois.
· Precipitação em Gel: 
- Imunodifusão Radial Simples: 
O antígeno sai da zona de teste e vai se ligar nos anticorpos. 
Se o antígeno não estiver presente ele não migra para outra região, e nada muda, então não seria possível detectar um reagente, sendo um não reagente 
- Imunodifusão dupla:
Tanto o Ac quanto o Ag migram para a região de teste.
Ex: Tenho vários Ag para vários vírus diferentes e, no meio existe a amostra (onde pode ter Ac para varias coisas). Só tem-se a resposta se a via dessa amostra Ac para esse tipo de Ag se ligar e conseguir migrar – teste mais qualitativo.
Turbidimetria:
- Ag+Ac em suspensão – luz transmitida 
- Detector - espectrofotômetro 
Vantagens: não necessita separação de fases, rápida, precisa, econômica e automatizada 
Desvantagens: não pode ser usada em amostras turvas 
Uso: Ag, Ac, lipoproteínas, proteína C-reativa, albumina
- Tem-se então um aparelho que emite luz na amostra e, essa luz vai ser dispersada, vai ser possível medir a absorbância, o comprimento de onda dessa luz. 
- A única diferença é o jeito que se vê o resultado (aglutina, flocula, difunde). Nesse caso é feito uma leitura em um aparelho, mas só vai reagir se tiver o encontro Ag- Ac.
- Varias luzes são emitidas, se unem e saem por um único tubo, um orifício e, depois é medido o comprimento de onda dessa luz.
Aglutinação:
- Complexo Ag-Ac - agregados visíveis 
- Sensibilização de suporte – látex, hemácias
 Vantagens: < custo, facilidade e rapidez 
Desvantagens: reprodutibilidade, estabilidade do complexo formado 
Uso: Tipagem sanguinea direta (Ag) e indireta(Ac), Proteína C reativa, ASO, FR, Toxoplasmose, Samonelose, Brucelose
1) Reação de Aglutinação:
Será feito uma tipagem sanguínea para saber se o paciente é tipo A, então, é adicionado um reagente que tem um Ac (que sempre vai se ligar ao seu Ag, vai neutralizar o Ag, então ele é contra, por isso é chamado de anti) anti A, e venho com a amostra do paciente (Sangue). Se nas células do paciente houver na superfície, proteína A, os Ac do reagente vão ligar, isso pois eles possuem afinidade, e ai todos se juntam formando uma aglutinação.
Uma gota de Ac anti B e coloco a amostra do mesmo paciente. Só tem proteína A, então, ela não vai reagir com Ac anti B, eles ficarão então separados e essa região de teste permanecerá límpida, não ocorrerá aglutinação nem floculação
OBS: Todos esses exemplos (precipitação, aglutinação, floculação) são ligações Ag- Ac. Se no teste estou procurando anticorpos, no reagente coloco Ag. Se no teste estou procurando Ag, coloco então Ac. 
Fatores Interferentes:
- Classe de Ac - IgM 750 vezes mais eficiente que IgG 
- eletrólitos 
- pH ( ideal entre 6,0 e 8,0)
 - tempo 
- temperatura 
- estabilidade da ligação ao suporte (adsorção)
 - concentração de Ag ou Ac (falso -)
· Reagentes marcados:
- Esse teste permite presença de um marcador (esse marcador pode ser uma enzima, por exemplo). Na maioria desses reagentes marcados é possível de quantificar 
- Emite uma cor, uma fluorescência 
- RIA (radioimunoensaio) 
- ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay ) No exame de Elisa, consigo detectar quanto de IgM existe no soro naquele momento. É quantitativo.
- IF (imunofluorescência) Quando é falado de imunofluorescência, é uma técnica onde vai se marcar um Ac industrializado com um fluorófolo, ou fluorocromo (substancia que emite fluorescência)
- Citometria de fluxo 
- Blot – Transferência/Impressão em papel de nitrocelulose 
- Western blotting – protein; Southern blotting – DNA ; Far-western blotting– proteína-proteína
Técnicas de Tipagem ABO:
· Reação deFloculação:
- VDRL (Veneral Disease Research Laboratory)
 - RPR (Rapid Plasm Reagin) 
- suporte: cristais de colesterol 
- Ag: cardiolipina 
- placas escavadas 
- Uso: pesquisa de reaginas
· Resultado VDRL:
Ex: para diagnóstico da sífilis
- Reação Negativa: tem amostra e reagente, mas eles não conseguem se unir, ou seja, não formarão um complexo
- Reação Positiva: se aglutinar
· Radioimunoensaio:
- Utilizam Ac conjugados com radioisótopos para quantificar os ensaios. 
 Vantagens: • Alta sensibilidade e especificidade • Permite medidas rápidas e precisas 
Desvantagens: • Custo • Vida média dos reagente • Risco operacional (radiação) 
 Uso: Testes de triagem, Dosagem de drogas...
· Elisa:
- Baseia-se na quantificação de uma reação enzimática associada com complexos imunes.
- É marcado por conta da presença de uma enzima 
Elisa Direto: 
· Faz-se pesquisa de Ag
· Em um recipiente, é posto a amostra do paciente, e esse recipiente é preparado para aderir a determinado Ag. Então nessa amostra esta sendo pesquisado Ag, que se estiver presente na amostra, ira grudar no fundo do recipiente. Depois é lavado e acrescentado um Ac industrializado marcado com uma enzima (Ac primário). Esse Ac vai grudar com o Ag. Se na amostra não haver Ag, o Ac não vai conseguir grudar.
· Existe um Ag na amostra, é lavado (e o Ag permanece) e colocado um Ac primário especifico para esse Ag, faz ligação Ag- Ac e lava-se novamente. Isso não ira sair na lavagem porque esta fixo, e por ultimo coloca-se uma solução com algum substrato. Esse substrato vai reagir com essa enzima e então ocasiona a mudança de cor.
· Se não tivesse o Ag, lavasse, colocasse o Ac e lavasse, o Ac com a enzima não permaneceria grudado, ele iria sair. Então quando se colocasse o substrato, ele não conseguiria reagir com a enzima e daria não reagente.
Elisa indireto:
· Faz-se a pesquisa de Ac.
· Compra industrializado uma placa de Elisa que já vem com o Ag. 
· Quando quer saber se tem determinado tipo de citocina naquela amostra sangue, compra-se uma placa que tem citocina IL-1. E compra-se uma placa pra citocina IL-6. Coloca-se então a amostra do paciente. Se o paciente possui Ac anti IL-1, sinal que ele produziu, então ele se liga a amostra do paciente. Depois se lava e se coloca um outro Ac, que será um Ac anti Ac, e por isso que ele se liga no Ac. Com isso, ainda é possível ter um terceiro que terá a enzima.
· Se eu tivesse colocado o da amostra e não tivesse, eu lavaria e então ele iria sair. Então adiciono o primário, como não tinha o da amostra, vou lavar e vai sair. Adiciono o secundário, como não tem nem o da amostra e nem o primário, quando eu lavar ele vai sair. Quando adiciono o substrato que vai reagir com a enzima, não vai ter enzima porque não tinha Ac na amostra do paciente, então ele dará negativo.
Obs: O Elisa direto é para saber mais se a pessoa esta com a doença e, o indireto é para saber se a pessoa está com a doença ou se já teve a doença.
Ex: Paciente com toxoplasmose, posso pedir IgM e IgG. Os dois são Ac, então nos dois vou utilizar o método indireto, porem, com um vou fazer um teste especifico para IgG, e outro para IgM. Se der positivo somente IgG, significa que o paciente já teve toxoplasmose, ou ele já entrou em contato com aquela doença em algum momento (não necessariamente teve), ou seja, está na memória. Mas se deu positivo IgM, significa que a pessoa está com a doença.
· Imunohistoquímica:
Por exemplo, é feito a biopsia de uma lamina procurando se aquele tecido coletado é um tumor. Isso então são as reações que são feitas na lamina
Uma célula tumoral apresenta Ag de superfície diferente de uma célula saudável.
Ex: para pesquisar Ag tumorais em uma célula, acrescento então reagentes com Ac anti marcador tumoral.
Procuro o antígeno tumoral e adiciono um Ac primário anti Ag tumoral, se isso for um Ag tumoral, vai se ligar. Depois acrescento um segundo Ac anti Ac que tem um cromóforo ou fluoróforo para emitir uma fluorescência.
· Imunofluorescência:
- Utilizam-se Ac ou Ag conjugados a moléculas reveladoras chamadas fluorocromos. 
- Visualização em microscópio de fluorescência
· Imunofluorescência Direta:
Aplicações:
 - Detecção direta de microrganismos (secreções, urina, cortes de tecidos); 
- Identificação de subpopulações de linfócitos; 
- Fenotipagem de células tumorais
 Ex.: Detecção de Chlamydia trachomatis em secreção uretral
- Procuro um Ag no tecido
- Adiciono um Ac com marcação fluorescente. Se se ligarem, emite fluorescência, se não se ligar é porque não tinha aquele Ag, então não emite nada, é não reagente.
· Imunofluorescência Indireta:
Aplicações:
 - Detecção de anticorpos específicos contra diversos microrganismos;
 - Diagnóstico de doenças auto-imunes
- Pesquiso Ac
- Se tiver a presença do Ac naquele tecido, na amostra, emite fluorescência.
- Para pesquisar o Ac, uso o Ag para fazer essa pesquisa. Uso então um Ag para fazer pesquisa de Ac, e depois utilizo os outros Ac anti Ac para marcar. Se for Elisa, enzima; imunofluorescencia, fluorófilo; Radioensaio, radioisótopo
· Citometria de Fluxo:
- Detecta, separa e quantifica células contendo um antígeno particular, marcadas com um fluorocromo; 
- Cada anticorpo é marcado com um fluorocromo diferente; 
- As células são então analizadas no citômetro de fluxo.
- As células saem de uma célula de fluxo e são iluminadas por um raio laser; 
- A quantidade de raios laser que é dispersa para fora das células durante a passagem das mesmas pelo laser pode ser medida, o que proporciona informação a respeito do tamanho das células
Aplicações: 
-Caracterização de populações celulares; 
- Contagem de microrganismos;
 - Separação de populações celulares de acordo com a densidade dos antígenos, tamanho e granulosidade das células; 
- Análise de proliferação celular.
· Ensaios Imunocromatográficos:
- Teste Rápido de HIV (Ac anti-HIV)
- Diagnósticos de Gravidez (detecção de beta HCG)
Teste de gravidez:
 Os testes de farmácia apresentam uma região onde coloco a amostra (urina), devido a forma que é preparada o teste, essa amostra ira deslizar em cima desse teste. Então a amostra de urina vai ser absorvida e vai deslizar para cima para uma região de detecção. 
Nessa região de detecção tenho duas áreas principais, uma que chamo de teste, e outra chamada de controle.
Se a urina foi absorvida de forma correta e chegou no controle, vai acender uma faixa, isso é para mostrar que o teste esta funcionando, que a urina chegou até aquela região. 
Existe também uma região com Ac anti HCG, se nessa amostra tiver HCG (hormônio produzido somente na gestação) ele ira se ligar no Ac presente, e isso ira reagir e então acenderá outra faixa dando positivo para o teste (pessoa está grávida)
Teste rápido de HIV:
Tem a placa e um recipiente onde em cima tem a área de detecção de teste e controle.
É posto o sangue do paciente, então o controle é feito para reagir com a amostra. Reagindo com a amostra isso significa que o teste esta funcionando. Acendeu mais um, significa positivo para o teste.
Obs: Se não acender nem o controle e nem o teste, ou então acender somente o teste, significa que esse teste não esta funcionando. O controle precisa necessariamente acender em todos os testes para mostram que eles estão funcionando.