aula de dosagem de proteinas

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DETERMINAÇÃO DA
CONCENTRAÇÃO DE
PROTEÍNAS 
PRÁTICAS LABORATÓRIAS 
Profa.Dra. Raysa Farias
https://biologiavegetal.com/
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A dosagem de proteínas permite a quantificação
exata da concentração de proteínas numa
determinada amostra
Baseia-se na reação entre proteínas e o sulfato de
cobre em tartarato, em meio alcalino resultando num complexo
entre o Cu (II) e os átomos de N das ligações peptídicas. Este
complexo apresenta cor violeta e dá-se a comprimento de onda
máximo de cerca de 540 nm.
A dosagem de proteínas permite a quantificação
exata da concentração de proteínas numa
determinada amostra
Reação de Biureto 
Baseia-se em uma reação entre CuSO4 e os grupos amino da proteina em
meio alcalino. É um método específico para proteínas. O produto desta
reação (um cátion Cu+2 coordenado com 4 grupos amino) absorve em λ
540nm. 
Desvantagens: a) baixa sensibilidade (>1mgprot.) b) somente para proteínas
simples
O ensaio de Bradford, que tem por base o azul brilhante de Coomassie, é o
método mais usado para dosagem de proteínas totais, com faixa de detecção
entre 20 e 2000 μg mL-1, e utiliza a albumina do soro bovino (BSA) como
padrão, que é um reagente de baixo custo. O reagente azul brilhante de
Coomassie altera a absorbância de 465 nm para 595 nm causando uma visível
mudança de coloração, inicialmente castanha, para tons de azul, conforme a
concentração de proteínas.
A dosagem de proteínas permite a quantificação
exata da concentração de proteínas numa
determinada amostra
O método de lowry é similar ao método do biureto, mas mais
sensível, este resulta da combinação entre o método do Biureto
com a redução com reagente de Folin (pH 10). Há formação de
uma cor azul a cdo máximo= 750 nm em que o reagente de
Folin é reduzido por uma reação de oxidação entre os
aminoácidos aromáticos catalisada pelo cobre. Contudo, este
método apenas resulta na presença de aminoácidos não polares
R-aromáticos como o triptofano, tirosina e a fenilalanina
Metódo de LOWRY
Procedimentos
Preparo da curva padrão
Distribua seis tubos de ensaio em uma estante, numerando-os de 1 a 6.
Utilizando as micropipetas de acordo com o volume pretendido, adicione água destilada, BSA (dissolvido em
água para concentração final de 1 µg µL-1) e o reagente de Bradford nas proporções sugeridas na Tabela 1.
 
O ensaio em branco é uma amostra padrão que serve para calibrar o 
espectrofotômetro, diminuindo assim, erros nos valores medidos da absorvância
e, com isto, obter uma maior sensibilidade na determinação da concentração da 
proteína. Este ensaio possui todos os compostos que estão contidos nas soluções,
exceto a amostra que se quer quantificar. Deste modo, é necessário subtrair a 
absorvância medida no ensaio embranco às restantes amostras com a 
proteína, para obtermos apenas o valor de absorvância da proteína a
analisar
TUBO 1
agite os tubos em agitador de tubos do tipo vortex, deixando, em seguida, os tubos de repouso por
cerca de 5 minutos. A calibração do espectrofotômetro para o valor da absorbância zero deve ser
realizada utilizando-se água destilada na cubeta e 595 nm. Em seguida, coloque o conteúdo do
tubo nº 1 na cubeta, e registre a leitura da absorbância. Da mesma forma, deve ser feita a leitura da
absorbância dos tubos 2 a 6. 
Esquema do funcionamento interno de um espectrofotômetro
Quando o corante se liga às proteínas, este forma um complexo
corante-proteína, provocando uma mudança de cor do corante
Coomassie G-250 de vermelho para azul. Esta mudança de cores
proporcional à concentração da proteína. O complexo forma do
revela uma elevada absortividade molar em comprimento de
onda igual a 595 nm. Como a absortividade é muito grande,
apresenta também uma alta sensibilidade ao medira
concentração da proteína na solução