Pratica_de_Hematologia

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Prática de Hematologia 
 
 
Contagem total de leucócitos: 
Quando realizada em câmara de Neubauer: 
1. Pipetar 400 microlitros de Türk ou ácido acético em tubo de ensaio; 2. Pipetar 20 
microlitros de sangue homogeneizado; 3. Limpar o excesso de sangue da parte externa da 
ponteira com gaze ou papel e adicionar o sangue no tubo de ensaio com o diluente; 4. 
Montar a câmara de Neubauer e preencher um dos lados com a diluição homogeneizada 
(Fig.1); 5. Contar os quatro quadrados laterais maiores (Fig. 2 e 3) e multiplicar por 50. 
 
CÁLCULO DA CONTAGEM TOTAL DE LEUCÓCITOS: 
Área de cada quadrado maior: 1mm2 Profundidade: 1/10mm Diluição: 1:20. 
Número total de leucócitos = 
Número de células contadas x 10 (altura) x 20 (diluição) / 4 (número de quadrados) 
no total de leucócitos x 50 = no total de leucócitos/mm3 (ou microlitro – L) de sangue. 
 
 
Contagem total de eritrócitos: 
Proceder da mesma maneira, porém utilizar 4 mL (4.000 microlitros) de diluente. Os 
diluentes que podem ser utilizados são a solução de Marcano (carnívoros e eqüinos), 
Gower (ruminantes), ou a Sol. Fisiológica (se realizada a contagem imediata). Contar as 
hemácias de 5 quadrados médios centrais. Somar o resultado de cada um dos 5 quadrados 
médios ((Fig. 2 e3) e multiplicar por 10.000. 
CÁLCULO DA CONTAGEM TOTAL DE ERITRÓCITOS: 
Área do quadrado central maior: 1mm2 Profundidade: 1/10mm Diluição: 1:200. 
Número total de hemácias = 
No de células contadas x 10 (altura) x 200 (diluição) x 5 (5 de 25 quadrados médios) 
 no de hemácias contadas x 10.000 = no total de hemácias/L) de sangue. 
 
 
Hematócrito ou Volume Globular 
Método do Micro-Hematócrito 
1. Encher dois terços de um capilar com sangue mais anticoagulante homogeneizado. 2. 
Limpar a extremidade com gaze ou papel higiênico. 3. Fechar a extremidade do tubo na 
chama, protegendo o sangue com o dedo e rotacionando lentamente o tubo para que ele 
feche por igual, sem formar deformações na ponta do capilar. 4. Centrifugar por 5 minutos a 
11.500rpm. 5. Fazer a leitura no cartão especial alinhando o início da coluna de hemácias 
em zero e o final do plasma em 100% e obtenha o resultado em porcentagem. OBS: Pode-
se usar um tubo heparinizado colhendo-se o sangue diretamente do animal, porém o 
resultado pode ser cerca de 3% maior que com EDTA. 
 
 
 
 
 
Determinação da hemoglobina 
Há vários métodos de determinação da hemoglobina: O método mais aceitável é o da 
cianometahemoglobina que é realizada em colorímetro, espectrofotômetro ou equipamentos 
automatizados. 
Podem-se utilizar kits comerciais, com reagentes semi-prontos e solução padrão comercial. 
Caso prefira é possível preparar as soluções no próprio laboratório: Técnica: Adicionar 20 l 
de sangue homogeneizado num tubo contendo 5 mL de solução de Drabkin (200mg de 
ferrocianeto de potássio, 50 mg de cianeto de potássio, 1g de bicarbonato de sódio e 
completar para 1000 mL de água destilada). Agitar, deixar por 5 minutos e fazer a leitura 
colorimétrica com comprimento de onda de 540 nm, usando a solução de Drabkin como 
branco. Anotar a leitura e compará-la com uma solução padrão. O procedimento de 
estabelecimento do fator de conversão é o mesmo descrito nas bulas dos kits comerciais; 
 
 
 
 
 
Figura 1. Câmara de Neubauer. Local de preenchimento com a diluição. 
 
 
Figura 2. Imagem do quadrante para contagem de hemácias ou leucócitos. Note que eles 
são delimitados por uma linha tripla. 
 
Figura 3. Câmara de Neubauer. Locais de contagem dos leucócitos e hemácias 
 
 
Preparo do esfregaço: 
1. Preparar duas lâminas novas e desengorduradas, sendo uma lapidada e com os 
cantos recortados. (Também pode ser utilizada uma lamínula). 2. Colocar uma gota 
de sangue pequena em uma das extremidades da lâmina. 3. Tomar a lâmina de 
canto recortado e colocá-la à frente da gota num ângulo de 45o, fazer um ligeiro 
movimento para trás até o sangue se espalhar totalmente na borda da lâmina. 4. 
Com um movimento uniforme, para frente, fazer esta lâmina deslizar sobre a outra. 
Ela arrastará atrás de si o sangue que se espalhará em fina camada. 5. 
Imediatamente após, agitar a lâmina ao ar até o esfregaço secar-se completamente e 
identificar com lápis. 
 
 
Coloração da lâmina (Leishman, Rosenfeld ou Wright) 
1. Colocar 15 gotas do corante sobre a lâmina durante 3-5 minutos. 
2. Em seguida adicionar 15 gotas de H2O destilada e/ou solução tamponada sobre o 
corante e a lâmina. 3. Deixar corando por 15 minutos. 4. Escorrer o corante e lavar em água 
corrente, secar e examinar ao microscópio com objetiva de imersão. 
Alternativa: podem-se utilizar os corantes rápidos, tipo panótico, com coloração sequencial 
rápida em três soluções. Ajustar o tempo de coloração em cada frasco, a depender da 
qualidade do corante. Pra uma maior durabilidade, fixe na primeira por mais tempo (5 
minutos) e/ou substitua-a por Metanol P.A. 
 
 
 
L L 
 
 
 
L L 
H  H
H
H  H
Exame diferencial de leucócitos 
Fazer a contagem diferencial dos leucócitos identificando cada célula. Para isso contar 100 
leucócitos (identificar 100 células para cada 10.00 leucócitos, em animais com leucocitose, 
pode ser necessário contar 200-300 células para fazer o diferencial) e calcular a 
porcentagem de cada uma delas. Realizar a leitura em linhas gregas (Fig. 4) ao longo dos 
bordos do esfregaço, ou atravessando-o de um lado ao outro em zigue-zague, sempre na 
região da monocamada. As células normais da série branca são: Bastonetes, Neutrófilos, 
Eosinófilos, Basófilos, Linfócitos, Monócitos. 
 
 
 
Figura 4. Esquema de varredura para o exame diferencial de leucócitos 
 
 
Soluções diluentes 
 
MARCANO, Solução para diluir hemácias de carnívoros e eqüinos 
- Sulfato de Na 50g 
- Água destilada 1000mL 
- Formol 40% 10mL 
 
GOWER, Solução para diluir hemácias de ruminantes 
- Sulfato de Sódio 62,5g 
- Ácido Acético Glacial 166,8mL 
- Água Destilada Q.S.P. 1000mL 
 
HAYEN, Solução para diluir hemácias 
- Sulfato de Sódio 12,5g 
- Cloreto de Sódio 2,5g 
- Cloreto de Mercúrio 1,25g 
- Água Destilada 500mL 
 
TÜRK, Solução para diluir leucócitos 
- Ácido Acético Glacial 15mL 
- Violeta Genciana 1% 10mL 
- Água Destilada 1000mL 
 
BRECHER, Solução para diluir plaquetas 
(Oxalato de Amônio 1%) 
Oxalato de Amônio 2g 
Água Destilada 200mL 
 
Teste de compatibilidade sangüínea em animais 
 
Colher sangue do receptor e doador em frascos diferentes contendo anticoagulante EDTA 
ou com citrato a partir da bolsa (doador) 
CUIDADO: evitar hemólise 
Determinar Ht e PPT do receptor e do doador 
 
1. Centrifugar o sangue do receptor e do doador 
2. Separar o plasma e as hemácias do receptor e do doador 
3. Lavar o concentrado de hemácias em salina por três vezes, desprezando o 
sobrenadante (250 L de sangue + 4 mL salina) 
4. Preparar as suspensões de hemácias adicionando 2 gotas do concentrado em 3 mL de 
salina (solução 3 a 5%) 
5. Misturar uma gota da suspensão de hemácias do receptor com três gotas do plasma do 
doador (Prova Menor) 
6. Misturar uma gota da suspensão de células (ou 1 gota do concentrado) do doador com 
três gotas do plasma do receptor (Prova Maior) 
7. Misturar por inclinação da lâmina, deixar na câmara úmida por 10 minutos e examinar 
em microscópio ou contra um fundo escuro. 
8. Verificar se há aglutinação. Diferenciar a formação de Rouleaux da aglutinação 
verdadeira. 
 
Verificação de hemólise. Preparar mais um tubo de cada uma das provas, conforme 
os itens 5 e 6. Homogeneizar e incubar os tubos a 37°C por 15’. C entrifugar e observar a 
ocorrência de hemólise. 
Realizar provas de autocontrole do receptor e do doador, misturando o plasma com a 
suspensão de cada animal. Animais doadores com aglutinação positiva no autocontrole 
devem ser retirados do programa de doação. 
Opcionalmente a formação de aglutinação macro pode ser realizada nos tubos ao 
invés das lâminas. Outros protocolos para provas de compatibilidadesanguínea podem ser 
obtidas em: Day, M. et al. Manual of canine and feline haematology and transfusion 
medicine. BSAVA, 2000. 320p. 
 
 
 
Teste de aglutinação em salina 
 
Diluir uma parte de sangue com 3 a 5 partes de solução salina em um tubo de ensaio 
(exemplo:20 microlitros de sangue em 100 microlitros de salina). Homegeneizar e pipetar 
uma gota para visualização entre lâmina e lamínula (preferencialmente 24x60mm). 
Aguardar 5 minutos em câmara úmida para visualizar a formação ou não de aglutinação. 
Não confundir coma formação de rouleaux. O teste positivo é indicativo de AHIM, porém o 
negativo não descarta a possibilidade da doença. 
 
Pesquisa de células LE 
 
 Colher 20 mL de sangue 
 Deixar coagular a temperatura ambiente por 15 min 
 Incubar em banho-maria a 37oC por 1h30min ou em temperatura ambiente por 2 a 3 
horas 
 Esmagar o coágulo em peneira e depositar em um grau 
 Agitar em banho-maria a 37oC por 15 minutos ou deixar a temperatura ambiente por 1 
hora 
 Com uma pipeta flexível, preencher tubos de Wintrobe 
 Centrifugar a 2.000rpm por 10 minutos 
 Desprezar o soro e fazer várias lâminas da capa leucocitária 
 Corar e observar ao microscópio 
 Encontrar pelo menos três células LE típicas para dar o resultado como positivo. A 
presença de várias rosetas é apenas sugestiva de um processo imunomediado. 
 
Fibrinogênio pelo método do refratômetro (precipitação pelo calor) 
 
 Preencher dois capilares de microhematócrito 
 Calibrar o refratômetro com água destilada (em 1.000) 
 1ª leitura do microhematócrito = PPT 
 Banho-maria a 56-58°C por 3’ (desnaturação do FBG) 
 Centrifugação a 12.000rpm por 3’ 
 2ª leitura = PPT - FBG 
 FBG (g/dL) = PPT – 2ª leitura 
Contagem de reticulócitos: 
 
 
 Misturar partes iguais de sangue e um corante supra-vital (Azul de cresil brilhante ou 
Novo azul de metileno) 
 Incubar em banho-maria a 37oC por 10-15 minutos 
 Confeccionar um esfregaço espesso 
 Contracorar com corante de rotina hematológico 
 Contar 500 hemácias e estabelecer a % de reticulócitos 
 
 
Contagem corrigida de reticulócitos: 
 
 Contagem obtida x VG do animal 
 VG médio normal para a espécie 
 
 VG normal: cão - 45%; gato – 37% 
 
 
Contagem absoluta de reticulócitos: 
 
 Contagem obtida (%) x número de hemácias por microlitro 
 100 
 
 
Azul de cresil brilhante: 
 Azul de cresil brilhante 1g 
 Citrato de sódio P.A. 0,4g 
 Solução fisiológica q.s.p. 1000mL 
 
Novo azul de metileno: 
 Novo azul de metileno 0,5g 
 Oxalato de potássio 1,6g 
 Água destilada q.s.p. 100mL 
 OU 
 Novo azul de metileno 0,5g 
 Solução salina 0,85% q.s.p. 100mL 
 Formalina – 1 mL:100mL 
 
 
 
 
 
 
 
Hematologia comparada 
 
 
As contagens de hemácias, leucócitos e trombócitos de aves, répteis, peixes e 
anfíbios são realizadas em uma única solução, sendo necessário e sempre que possível, 
que a diferenciação entre os tipos celulares seja feita pela morfologia na câmara de 
Neubauer. 
 
Solução de Azul de Toluidina:  Sol. Estoque: 0,1 g de azul de toluidina em 100 mL de solução fisiológica (salina 0,9%) 
 Diluir 1 parte da sol. estoque para 9 de salina e filtrar imediatamente antes do uso. 
 
Solução de Natt & Herrick:  NaCl 38,8g 
 Na2SO4 2,5g 
 Na2HPO4.12H2O 2,91g 
 KH2PO4 0,25g 
 Formalina 37% 7,5mL 
 Metil violeta 2B 0,10g 
 H2O destilada 1000 mL q.s.p. 
 pH da solução= 7,3 
 
Qualquer que seja a solução diluidora, a diluição costuma ser feita na proporção de 
1:100, a depender da espécie. As hemácias podem ser contadas em cinco quadrados 
centrais menores e os leucócitos e trombócitos nos quatro laterais maiores. Opcionalmente 
podem-se preencher os dois lados da câmara para a realização de duas contagens e 
obtenção de uma média. 
Fator para a multiplicação de hemácias = 5.000 (100 da diluição; 10 da altura da 
câmara e 5 para a correção da área de 1 mm2) 
Fator para a multiplicação de leucócitos e trombócitos = 250 (100 da diluição; 10 da 
altura da câmara e 1/4 para a correção da área de 1 mm2)