CLONAGEM E PCR

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<p>CLONAGEM GÊNICA</p><p>Clonagem em vetor de expressão</p><p> Características gerais:</p><p>1) Origem de replicação.</p><p>2) Sítios múltiplos de clonagem.</p><p>3) Gene de resistência ao antibiótico.</p><p> Vetores de expressão: promotores fortes; no final,</p><p>precisam ser capazes de gerar o fragmento</p><p>desejado.</p><p> Promotor = onde a transcrição será realizada,</p><p>possibilita localizar onde o fragmento de DNA será</p><p>inserido.</p><p> Processo de duplicação celular ocorre a partir da</p><p>ativação do promotor e a direção correta é</p><p>orientada pelo promotor.</p><p>Etapas:</p><p>1. Escolha do vetor apropriado.</p><p>2. Isolamento e digestão do DNA.</p><p>3. Ligação do fragmento no vetor.</p><p>4. Transformação bacteriana.</p><p>5. Seleção dos clones recombinantes.</p><p>Transformação:</p><p> A célula hospedeira é tornada quimicamente</p><p>competente para a entrada do vetor recombinante.</p><p>Seleção dos clones recombinantes:</p><p>CLONAGEM E PCR</p><p>Os plasmídeos já são comercializados com as</p><p>características gerais necessárias.</p><p>REAÇÃO EM CADEIA DA</p><p>POLIMERASE (PCR)</p><p>PCR = técnica que permite o isolamento de um</p><p>gene ou fragmento de DNA pela amplificação do</p><p>mesmo, utilizando a DNA polimerase.</p><p>Reação = ocorre em vários ciclos, replicando a</p><p>região de interesse a cada ciclo, dobrando a</p><p>quantidade de DNA.</p><p>Ciclo de PCR:</p><p>1º: Desnaturação -> o DNA contendo a sequência a</p><p>ser amplificada é desnaturado por aquecimento a</p><p>cerca de 95°C por 30 segundos.</p><p>2º: Anelamento ou hibridização -> um par de</p><p>primers (foward e reverse) complementam a fita da</p><p>sequência de DNA a ser amplificada. Essa etapa</p><p>ocorre a uma temperatura de aproximadamente</p><p>60°C.</p><p>3º: Extensão ou polimerização -> com o molde já</p><p>identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as</p><p>bases complementares, formando uma nova fita e</p><p>então tem-se novamente a duplicação da fita de</p><p>DNA. Esse processo acontece a uma temperatura</p><p>de 72°C.</p><p>Componentes de uma reação de PCR:</p><p> Mg2+: influencia a ação da Taq polimerase, influencia</p><p>na cinética de anelamento dos iniciadores.</p><p>Baixa [ ] Mg2+ = pouco ou nenhum produto.</p><p>Alta [ ] Mg2+ = reação com baixa especificidade.</p><p> Taq DNA polimerase: age na temperatura ideal de</p><p>72°C.</p><p> Tampão: mantém o pH ideal para a reação.</p><p> dNTPs: desoxirribonucleosídeos trifosfatos (dATP,</p><p>dGTP, dCTP, dTTP), utilizados pela DNA polimerase</p><p>para sintetizar uma nova fita do DNA.</p><p> Primers (oligonucleotídeos iniciadores);</p><p> Amostra.</p><p>Primers: (oligonucleotídeos iniciadores):</p><p> Possuem de 10 a 30 nucleotídeos.</p><p> Formam as extremidades das novas cadeias e</p><p>devem ser complementares à fita molde.</p><p> 1 par de primers vai hibridar com a cadeia de DNA</p><p>molde.</p><p> Temperatura de anelamento: temperatura na qual os</p><p>primers se pareiam ao DNA molde. (45 segundos à</p><p>54ºC).</p><p> Cada etapa da reação ocorre em uma temperatura</p><p>específica que pode ser controlada no</p><p>termociclador, que controla também o número de</p><p>ciclos de replicação.</p><p>PCR convencional: amplifica o DNA (qualitativo).</p><p>PCR em tempo real (qPCR): detecta o produto da</p><p>amplificação (quantitativo).</p>