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<p>Ampli�cação</p><p>in vitro de DNA</p><p>Prof.ª Camila Freze Baez</p><p>Descrição</p><p>Técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos in vitro e introdução de suas aplicações em rotina laboratorial.</p><p>Propósito</p><p>Compreender a teoria por trás da amplificação de ácidos nucleicos in vitro em suas diferentes formas e entender quais são suas vantagens,</p><p>desvantagens e aplicações em contextos diversos é importante para o profissional de laboratório, pois lhe fornecerá poderosa ferramenta de</p><p>trabalho.</p><p>Objetivos</p><p>Módulo 1</p><p>Elementos fundamentais à ampli�cação de ácidos nucleicos</p><p>Reconhecer elementos fundamentais à amplificação de ácidos nucleicos in vitro.</p><p>Módulo 2</p><p>Variações entre cada técnica de PCR</p><p>Diferenciar as variações entre cada técnica de PCR.</p><p>Módulo 3</p><p>Aplicações apropriadas ao uso de cada método</p><p>Identificar aplicações apropriadas ao uso de cada método.</p><p>Introdução</p><p>Os ácidos nucleicos são as estruturas fundamentais que carregam informações genéticas. Você já parou para pensar como certas características</p><p>físicas passam dos pais para os filhos? Traços físicos como formato do rosto, altura, cor da pele e dos olhos são traduções de informações</p><p>transmitidas às gerações futuras dos ácidos nucleicos. No corpo humano e na maioria dos seres vivos, encontramos dois tipos de ácidos nucleicos:</p><p>o ácido desoxirribonucleico (ADN – também conhecido pela sigla em inglês, DNA), e o ácido ribonucleico (ARN, ou RNA, em inglês).</p><p>Cada uma dessas moléculas – DNA e RNA – tem funções diferentes dentro da menor unidade viva conhecida — a célula. O DNA possui fita dupla,</p><p>sendo mais estável e resistente que o RNA. Por isso, a célula utiliza o DNA para armazenar as informações genéticas em longo prazo. Já o RNA,</p><p>normalmente, em fita simples e mais instável, tem como principal função intermediar a informação entre o DNA e as unidades efetoras da maioria</p><p>das funções celulares, as proteínas.</p><p>Formato do rosto e altura, por exemplo, são decorrentes da estrutura óssea que, em grande parte, é feita de proteínas. O papel das proteínas não se</p><p>limita apenas em traços físicos, mas também em funcionais.</p><p>Mas o que isso tem a ver com a amplificação de ácidos nucleicos?</p><p>Em uma célula viva e saudável, as enzimas fazem toda a amplificação do DNA por conta própria em um ambiente extremamente complexo e</p><p>controlado – do pH e nível de oxigênio disponível, ao momento que a célula está em seu ciclo de vida. São dezenas de enzimas envolvidas na</p><p>síntese de novas moléculas de DNA, tantas que os cientistas ainda não compreendem completamente todas as etapas envolvidas nesse processo.</p><p>Apesar de toda a complexidade da duplicação do DNA in vivo, já somos capazes de sintetizar pequenos trechos do DNA em um tubo de ensaio.</p><p>Incrível, não? Vamos ver com detalhes como isso é possível neste material.</p><p>Dogma central da Biologia Molecular: DNA replica-se em DNA e é transcrito em RNA, que é traduzido em proteína.</p><p></p><p>1 - Elementos fundamentais à ampli�cação de ácidos nucleicos</p><p>Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer elementos fundamentais à ampli�cação de ácidos nucleicos in vitro.</p><p>Princípios da PCR concencional</p><p>Para entendermos como funciona a amplificação de DNA in vitro, devemos primeiro relembrar algumas informações sobre o DNA e o RNA: suas</p><p>funções, composições, similaridades e diferenças. Tanto o DNA quanto o RNA são formados por nucleotídeos, que são como os tijolos dos ácidos</p><p>nucleicos e, consequentemente, do material genético. A partir da junção de tais tijolos, formamos as estruturas de DNA e RNA. Mas como são esses</p><p>tijolos?</p><p>Em primeiro lugar, os nucleotídeos contêm um açúcar chamado ribose. Essa ribose é uma das formas mais simples dos carboidratos – a forma</p><p>mais conhecida de um açúcar simples é a glicose. É na ribose que reside a principal diferença entre DNA e RNA: o RNA possui uma molécula de</p><p>oxigênio ligada ao segundo carbono da ribose que o DNA não possui – por isso, o DNA é chamado de desoxirribonucleico.</p><p>O segundo componente são as bases nitrogenadas. Para o DNA, existem quatro tipos diferentes de bases nitrogenadas:</p><p>esoxirribonucleico</p><p>Prefixo “des” significa a ausência (como em desinteresse), portanto, “desoxi” representa o oxigênio que está ausente.</p><p>Adenina (A)</p><p>Citosina (C)</p><p>Para o RNA há uma diferença:</p><p>No RNA as bases nitrogenadas A, C e G são as mesmas, mas, em vez de T, existe uma Uracila (U). Essas bases são</p><p>as responsáveis pela informação genética.</p><p>Imagine escrever um texto codificado, tão complexo quanto um ser humano, usando apenas uma das letras do teclado do computador. Como seria</p><p>possível entender a informação que você quis codificar? Agora, se você escrever um texto com pelo menos duas letras (ou números) do teclado,</p><p>usará um código binário. Isso também acontece com a informação genética: a célula utiliza essas cinco bases nitrogenadas para codificar, em</p><p>sequência, uma informação preciosa.</p><p>Finalmente, os nucleotídeos possuem grupamentos fosfatos no quinto carbono da (desoxir)ribose, que são capazes de interagir com a hidroxila</p><p>(álcool orgânico) presente no terceiro carbono da (desoxir)ribose, fazendo a ligação entre um nucleotídeo com o próximo. Essa ligação é conhecida</p><p>como fosfodiéster, sendo considerada o “cimento” dos nossos “tijolos”: a partir dela, longas sequências de DNA ou RNA são formadas. É importante</p><p>manter em mente que o grupamento fosfato confere carga negativa à molécula de DNA – vamos voltar a falar a respeito disso mais à frente.</p><p>ódigo binário</p><p>Formado por sequências de 0 e 1 que, em trechos longos, podem codificar informação, como computadores.</p><p>Esquema da estrutura básica dos desoxirribonucleotideos, compostos por fosfato, desoxirribose e base nitrogenada.</p><p>A interação entre a hidroxila no carbono 3 da (desoxir)ribose e o fosfato de outro nucleotídeo no carbono 5 deixam as bases nitrogenadas livres para</p><p>interação com outras bases nitrogenadas, normalmente, do tipo oposto. As principais bases nitrogenadas (A, T, C, G, U) são divididas em dois</p><p>grupos químicos, de acordo com o número de anéis aromáticos que possuem:</p><p>Pirimidinas</p><p>(C, T, U) - Possuem um anel.</p><p>Purinas</p><p>(A, G) - Possuem dois anéis.</p><p>As bases interagem entre si, mas entre grupos opostos: ou seja, pirimidinas pareiam com purinas, de acordo com as cargas livres de cada base.</p><p>Desse modo, A interage com T, pois ambas têm duas cargas livres para interação, e C interage com G através de três cargas. Essas interações são</p><p>Guanina (G)</p><p>Timina (T)</p><p>chamadas de pontes de hidrogênio e são consideradas fracas por serem facilmente quebradas por agentes físicos, como a temperatura, e</p><p>químicos, como o pH.</p><p>Veja o esquema mostrando a estrutura do DNA e o pareamento das bases por complementariedade. Note as pontes de hidrogênio duplas (seta</p><p>verde) entre adenina e timina, e as triplas (seta preta) entre citosina e guanina.</p><p>Pareamento de bases nitrogenadas.</p><p>No entanto, essas pontes de hidrogênio são importantes para manter a sequência de DNA livre de erros e garantem à molécula uma de suas</p><p>características fundamentais: a complementariedade. É a partir dessa complementariedade que as enzimas responsáveis pela síntese do DNA e do</p><p>RNA, as polimerases, sabem qual nucleotídeo adicionar para manter a mesma mensagem na hora de duplicar o DNA. Ao mesmo tempo, é a</p><p>característica que dá ao DNA seu formato em fita dupla. Chamamos essa característica de replicação semiconservada.</p><p>emiconservada</p><p>Uma fita original (fita parental) é mantida na duplicação, como molde para a síntese da fita nova (fita filha).</p><p>Atenção!</p><p>Se olharmos para essa fita dupla em um sentido único, da esquerda para a direita, por exemplo, veremos que uma das fitas se encontra com o</p><p>carbono 5 da desoxirribose livre na extremidade à esquerda, enquanto a outra fita tem o carbono 3 da desoxirribose livre à esquerda. Isso acontece</p><p>porque, para interagirem, as duas fitas precisam estar em sentidos opostos – por isso, nós as chamamos de fitas antiparalelas. Esse sentido de</p><p>interação por complementariedade traz à tona outra característica do DNA: sua replicação</p><p>para podermos escolher qual a melhor técnica para cada caso: para</p><p>aumentar a quantidade final de DNA-alvo amplificado; para síntese de cDNA a partir de RNA polaridade positiva; para quantificação de DNA ou</p><p>cDNA; e para diferenciação rápida entre diferentes produtos de amplificação.</p><p>Além disso, aprendemos algumas das diversas aplicações que a PCR e as suas variações têm em áreas da ciência, como na forense, na pesquisa e</p><p>na clínica, participando do diagnóstico, acompanhamento e prognóstico.</p><p>Agora você está pronto para continuar progredindo no conhecimento da Biologia Molecular, uma área empolgante e que se torna, a cada dia, mais</p><p>importante para diversas áreas das ciências biológicas.</p><p>Podcast</p><p>Para encerrar, ouça um resumo dos aspectos mais relevantes deste conteúdo.</p><p></p><p>Explore +</p><p>Confira as indicações que separamos especialmente para você!</p><p>Acesse o conteúdo de Biologia DNA como o material genético: Replicação do DNA no portal da Khan Academy, para mais detalhes e vídeos sobre</p><p>replicação do DNA.</p><p>Assista ao vídeo 4. Teste de Paternidade, de Carlos Simeão, no Youtube. Você aprenderá mais sobre a variabilidade genética estudada em</p><p>análises forenses e em testes de paternidade.</p><p>Assista ao vídeo Técnicas de Biologia Molecular – PCR- Animação 3D, de Carlos Simeão, no Youtube. Você irá conhecer o passo a passo da</p><p>técnica de PCR.</p><p>Para conhecer mais sobre a história do PCR, leia o texto O desenvolvimento da reação em cadeia pela polimerase (PCR).</p><p>Para conhecer mais sobre as técnicas de PCR, leia Outras aplicações da PCR e as suas variações.</p><p>Referências</p><p>ASSOCIAÇÃO BRASIL HUNTINGTON. O que é a Doença de Huntington. ABH. Consultado na internet em: 18 out. 2020.</p><p>CABELLO, G. M. K. Genética Clínica: Métodos de diagnóstico. DBBM FIOCRUZ. Consultado na internet em: 18 out. 2020.</p><p>DOLINSKY, L. C.; PEREIRA, L. M. C. V. DNA forense: Artigo de revisão. Saúde & Ambiente em Revista, 2(2), p.11-22, 2007.</p><p>NELSON, D. L. Princípios de bioquímica de Lehninger. Porto Alegre: Artmed, 2014.</p><p>NEW ENGLAND BIOLABS’ FEATURE ARTICLES. Polymerase Fidelity: What is it, and what does it mean for your PCR? NEB. Consultado na internet em:</p><p>18 out. 2020.</p><p>REAL-TIME PCR BASICS. TaqMan vs. SYBR Chemistry for Real-Time PCR. ThermoFisher Scientific website. Consultado na internet em: 18 out.</p><p>2020.</p><p>VANDESOMPELE, J. Q. PCR Guide por Eurogentec – plataforma GenEx. Gene Quantification. Consultado na internet em: 18 out. 2020.</p><p>ZHAO, M.; et al. Improved high sensitivity screen for Huntington disease using a one-step tripletprimed PCR and melting curve assay. PLoS ONE.</p><p>Consultado na internet em: 18 out. 2020.</p><p>Material para download</p><p>Clique no botão abaixo para fazer o download do conteúdo completo em formato PDF.</p><p>Download material</p><p>O que você achou do conteúdo?</p><p>Relatar problema</p><p>javascript:CriaPDF()</p><p>deve ser feita de forma semidescontínua (In vivo, apenas</p><p>a fita no sentido antiparalelo (3’→5’) é lida de forma contínua, e a fita de DNA molde no sentido paralelo (5’→3’) é lida de forma descontínua. Isso</p><p>acontece por causa do sentido de abertura da forquilha de replicação).</p><p>Reação em cadeia pela polimerase: ampli�cando DNA in vitro</p><p>Em uma célula viva, as enzimas polimerases têm ao seu dispor todos os itens necessários para duplicar o DNA, de nucleotídeos a todas as enzimas.</p><p>Representação do complexo de replicação do DNA em uma célula.</p><p>Imagine quão complexo seria reproduzir o ambiente celular em um tubo de ensaio! Precisamos utilizar os conhecimentos da físico-química do DNA</p><p>e os princípios básicos de sua replicação para simplificação e adaptação da técnica in vitro. Veja:</p><p>Complementariedade entre �tas antiparalelas</p><p>Primeira característica do DNA importante na sua replicação in vitro: as bases nitrogenadas de uma fita interagem especificamente com as bases</p><p>correspondentes da outra fita (A-T, C-G) por meio de interações frágeis que podem ser desfeitas pelo calor. Ao aquecermos a solução acima de</p><p>90ºC, podemos desfazer essas interações e abrir a fita dupla em duas fitas simples. Isso deixa as bases nitrogenadas expostas para interagirem</p><p>e, ao abaixarmos a temperatura, conseguimos fazer com que a fita dupla se refaça e a informação seja mantida. Vamos ver como esse processo</p><p>funciona passo a passo mais à frente.</p><p>Síntese enzimática pela polimerase</p><p>Segunda característica importante para a replicação do DNA in vitro. Essa enzima lê cada base nitrogenada da fita simples como se fosse um</p><p>molde, e adiciona a base nitrogenada complementar na fita que está sendo sintetizada através da ligação fosfodiéster. In vivo, a polimerase não</p><p>inicia a duplicação do DNA sozinha, pois ela não consegue abrir a fita dupla em fitas simples, identificar o local certo de início de replicação ou</p><p>adicionar os primeiros nucleotídeos. A célula utiliza enzimas para abrir a fita dupla, as helicases, e adição dos primeiros nucleotídeos é feita por</p><p>outra enzima, chamada primase.</p><p>Na amplificação do DNA in vitro, denominada reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction – PCR), a abertura do DNA em fitas</p><p>simples é feita através de calor. Para isso, utilizamos uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase. Além disso, usamos pequenas</p><p>sequências de nucleotídeos em fitas simples e complementares à sequência-alvo do DNA a ser amplificado. Essas sequências sintéticas são</p><p>chamadas de iniciadores ou oligonucleotídeos (oligo = poucos), algo em torno de 20 nucleotídeos, conhecidos como primers, em inglês.</p><p>Normalmente, são usados dois oligonucleotídeos por reação: um chamado senso, que se liga ao DNA molde fita simples no sentido 3’→5’; e um</p><p>antissenso, que se liga à fita no sentido 5’→3’.</p><p>Lembre-se de que o sentido de duplicação contínua do DNA ocorre apenas no sentido 5’→3’, pois o trifosfato (na</p><p>posição 5) do nucleotídeo livre dará a energia necessária à ligação fosfodiéster com o carbono 3 da ribose do</p><p>nucleotídeo que já estará na fita. Isso acontece em ambas as fitas (paralela 5’→3’ e antiparalela 3’→5’), e ambos os</p><p>oligonucleotídeos são sintetizados em laboratório no sentido 5’→3’. Os oligonucleotídeos iniciadores irão</p><p>demarcar a região do genoma a ser amplificada. Essa informação é importante para dar especificidade à PCR!</p><p>Etapas da reação em cadeia da polimerase</p><p>Já compreendemos que a fita dupla de DNA se abre em duas fitas simples quando aquecida próximo a 100ºC, e sabemos que a reação de síntese</p><p>de novas fitas de DNA é feita por meio de uma enzima termorresistente chamada de Taq polimerase. Também descobrimos que a enzima precisa</p><p>de oligonucleotídeos iniciadores que se ligam por complementariedade ao DNA-alvo desnaturado em uma fita simples. Agora, podemos entender</p><p>como essa última se desenvolve. Assim como em qualquer receita de bolo, uma PCR precisa de seus ingredientes básicos – ou reagentes mínimos</p><p>– para a síntese de DNA acontecer. Desse modo, adicionamos esses ingredientes a um microtubo. Os reagentes mínimos necessários para a</p><p>amplificação são:</p><p>O DNA molde, dupla fita, extraído a partir de amostras biológicas.</p><p>Os oligonucleotídeos sintéticos que são complementares à região do DNA molde a ser amplificado.</p><p>A Taq polimerase, termorresistente.</p><p>Cátions de magnésio (Mg2+), cofator necessário ao funcionamento eficaz da polimerase.</p><p>Os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs – dATP, dGTP, dCTP, dTTP) – lembre-se de que os três fosfatos são usados como fonte de</p><p>energia para que a reação fosfodiéster catalisada pela Taq polimerase aconteça.</p><p>A água ultrapura, livre de contaminantes de DNA, RNA e de nucleases.</p><p>Esquema dos reagentes necessários a uma reação em cadeia da polimerase (PCR).</p><p>O microtubo com esses poucos reagentes é, então, submetido a diversos ciclos de elevação e redução da temperatura do qual a PCR consiste.</p><p>Vejamos:</p><p>1. A primeira etapa de qualquer PCR consiste na abertura da fita dupla de DNA em suas fitas simples pelo aquecimento da reação a, pelo menos,</p><p>95ºC, por um tempo prolongado – algo em torno de 5 a 10 minutos. Esse tempo é necessário para abrir por completo as fitas de DNA que podem</p><p>estar muito concentradas, superenoveladas e ser muito longas.</p><p>2. Em seguida, começam os ciclos. Cada ciclo contém, pelo menos, 3 etapas: desnaturação, anelamento e extensão.</p><p>Note na ilustração a desnaturação das fitas duplas de DNA em fitas simples, o anelamento dos iniciadores à sequência-alvo por</p><p>complementariedade e a extensão pela Taq polimerase.</p><p>Ilustração das etapas da PCR.</p><p>Entenda melhor como acontecem estas etapas:</p><p>É a primeira etapa de cada ciclo em que a temperatura é aquecida a 95ºC por cerca de 1 minuto. O tempo de desnaturação pode variar de</p><p>acordo com cada reação e genoma. Por exemplo, genomas ricos em CG precisam de tempo e temperatura maiores para desnaturar, pois C</p><p>Desnaturação </p><p>faz pontes triplas com G, enquanto genomas ricos em AT precisam de tempos menores por possuírem ligações duplas.</p><p>Segunda etapa de cada ciclo. A temperatura será reduzida para cerca de 50 a 65ºC por, aproximadamente, 30 segundos. Essa redução da</p><p>temperatura deve ser feita com exatidão para que os iniciadores se liguem especificamente à fita simples de DNA. Se a temperatura for baixa</p><p>demais, a fita se renatura e a PCR não acontece, ou ainda outros fragmentos do DNA extraído podem se ligar inespecificamente e sua reação</p><p>não funcionará apropriadamente. Se for alta demais, os oligonucleotídeos se ligarão apenas parcialmente, ou até mesmo não se ligarão, e a</p><p>eficiência da sua reação será gravemente comprometida. Você pode estar se perguntando como saber exatamente a temperatura a ser</p><p>usada. A resposta certa dependerá de vários fatores, como o tamanho do seu oligonucleotídeo, seu conteúdo de CG, e a concentração de</p><p>sais no tampão de PCR. De modo geral, quanto maior o tamanho e o conteúdo de CG, maior será a temperatura de anelamento.</p><p>Uma vez que os oligonucleotídeos tenham se anelado à fita de DNA molde, a Taq polimerase reconhecerá esse local e fará a extensão da fita dupla.</p><p>Como a Taq polimerase é termorresistente, a elevação da temperatura a 95ºC não a destrói – na realidade, ela funciona melhor em temperaturas</p><p>mais elevadas.</p><p>No caso da maioria das polimerases disponíveis comercialmente, a melhor temperatura de adição de nucleotídeos em uma PCR é, em torno de 70ºC</p><p>a 72ºC.</p><p>Atenção!</p><p>O tempo de extensão depende da velocidade da polimerase usada e do tamanho da sequência entre os oligonucleotídeos. Uma reação para</p><p>amplificar menos de 500 pares de bases que utilize uma polimerase com uma velocidade de incorporação de nucleotídeos mediana deve ter um</p><p>tempo de extensão de 30 a 40 segundos.</p><p>Após o término da extensão, a reação é aquecida novamente a > 95ºC, para que as fitas duplas recém-sintetizadas sejam separadas, e o ciclo</p><p>desnaturação-anelamento-extensão se repita de 30 a 40 vezes. No final, é recomendável ter um ciclo final de extensão maior para garantir</p><p>que a</p><p>síntese de todas as fitas seja concluída. Após o término, a reação deve ser mantida refrigerada para preservar o material amplificado.</p><p>A PCR acontece em equipamentos que, como um ferro de passar, aquecem e resfriam rapidamente: os termocicladores. Esses aparelhos foram um</p><p>grande avanço para as ciências biológicas e permitiram a grande difusão da PCR em diversas áreas. Graças a eles, uma PCR convencional média</p><p>dura de 1 hora e meia a 2h.</p><p>A cada ciclo, a quantidade de sequência-alvo – aquela contida entre os iniciadores senso e antissenso, conhecida como amplicon (produto</p><p>amplificado) – dobra. Dessa forma, se, no primeiro ciclo, tínhamos apenas uma cópia de tal sequência (limite teórico da PCR), ao final do primeiro</p><p>ciclo, teremos 2 cópias; no final do terceiro ciclo, 4; depois, 8, e então 16, e assim sucessivamente.</p><p>A cada ciclo, vemos um aumento exponencial do número de cópias da sequência-alvo. Assim, no final de 30 ciclos, teremos algo na ordem de 1</p><p>bilhão de cópias da mesma sequência! Um número tão grande de uma mesma sequência vai ser muito mais facilmente identificado posteriormente.</p><p>Esquema da amplificação exponencial do DNA-alvo por ciclo a partir de uma cópia, em aparelho termociclador.</p><p>Via de regra, podemos subdividir a PCR em duas categorias:</p><p>PCR qualitativa</p><p>Anelamento </p><p>Todos os ciclos ocorrem em um termociclador comum, precisa de etapas posteriores para revelar o resultado. Nesse tipo, o resultado se dá pela</p><p>constatação da presença ou ausência do produto alvo da amplificação. Abordaremos alguns outros tipos de PCR que se encaixam nessa categoria.</p><p>PCR quantitativa</p><p>Também conhecida como em tempo real. Os ciclos se dão em um aparelho capaz de ler automaticamente a amplificação e, assim, é capaz de</p><p>quantificar em tempo real. Existem dois métodos que são mais comuns para a quantificação. Nesse caso, não há necessidade de revelação</p><p>posterior à reação, o que a torna mais rápida.</p><p>Eletroforese em gel de agarose: separando e revelando o resultado</p><p>Após a amplificação da sequência-alvo pela polimerase, temos um microtubo com nosso DNA amplificado em um tampão de reação que é</p><p>transparente como a água. Naturalmente, não podemos observar a olho nu o resultado da reação: é necessário revelá-la. Para isso, precisamos</p><p>manter em mente que, após uma PCR bem-sucedida, temos uma sequência de DNA em um tamanho exato graças ao anelamento específico dos</p><p>oligonucleotídeos à sequência-alvo. Portanto, precisamos separar as sequências por tamanho para verificarmos se o tamanho corresponde ao do</p><p>nosso produto. Também vamos precisar de algo que revele a localização do DNA, ou um agente revelador especial.</p><p>Dica</p><p>Para separar o DNA de acordo com seu tamanho, usamos uma espécie de malha gelatinosa chamada de matriz ou gel de agarose.</p><p>Você deve estar familiarizado com a gelatina que fazemos na cozinha, certo? A agarose funciona de maneira semelhante: é um polissacarídeo que</p><p>se dissolve em líquido aquoso quando aquecido e, quando resfriado, se solidifica, ou polimeriza. Ao polimerizar, a agarose forma uma malha com</p><p>pequenos orifícios que permitirão a passagem do DNA, de modo que moléculas menores de DNA passarão com maior facilidade e mais</p><p>rapidamente, enquanto moléculas maiores de DNA terão maior dificuldade de passar e, por isso, demorarão mais tempo para viajarem pela malha.</p><p>Assim, podemos separar as moléculas de DNA de acordo com tamanho. Dependendo do tamanho do nosso DNA amplificado, poderemos usar uma</p><p>malha mais fechada ou mais aberta simplesmente variando a concentração da agarose que usamos para fazer o gel.</p><p>O DNA será inserido no gel de agarose através de pequenos orifícios chamados de poços, feitos com um pente com pequenos dentes largos. Para</p><p>podermos visualizar a passagem do tampão da PCR pelo gel de agarose, usamos corantes como o azul de bromofenol, o qual é mais denso do que</p><p>o tampão de corrida e faz com que o DNA se assente no fundo do poço, o que é necessário para que a separação funcione adequadamente.</p><p>Montagem de gel de agarose com uso de pentes para formação de poços e aplicação do produto de PCR.</p><p>Uma vez que o gel de agarose esteja pronto e que o DNA tenha sido pipetado nos poços do gel com o corante azul, podemos começar a</p><p>eletroforese. Para a eletroforese, precisaremos ainda de uma cuba, ou recipiente que contenha entradas para corrente elétrica, uma fonte elétrica e</p><p>um tampão ionizável. A eletroforese parte do princípio de que um tampão, quando submetido a uma corrente elétrica, tem suas moléculas ionizadas</p><p>migrando em direção a um dos polos: as moléculas negativas migram para o polo oposto, o cátodo, e as moléculas positivas migram para o polo</p><p>negativo, o ânodo.</p><p>No caso do DNA, seu grupamento fosfato lhe dá carga negativa, fazendo que o DNA migre para o polo positivo (cátodo) quando em solução</p><p>submetida à corrente elétrica. Como o DNA está no fundo do gel de agarose graças ao corante mais pesado que o tampão eletroforético, ele passa</p><p>por dentro da agarose e, assim, será separado de acordo com seu tamanho pela trama do gel. Por sua vez, o corante azul, também de carga</p><p>negativa e de tamanho muito inferior à complexa molécula de DNA, migrará pelo gel mais rapidamente, servindo apenas como marcador da</p><p>velocidade de migração, e não da posição do DNA.</p><p>Representação esquemática de uma eletroforese em gel de agarose.</p><p>Para sabermos o tamanho e a posição do DNA, precisaremos de um marcador de tamanho molecular do DNA que consiste em sequências de DNA</p><p>de tamanhos conhecidos, como se fosse uma escada cujos degraus representam os tamanhos. Ele é um parâmetro para estimarmos o tamanho</p><p>das sequências de DNA que amplificamos – coloquialmente, chamamos essas sequências em gel de agarose de bandas.</p><p>Também precisamos de um revelador da localização do nosso produto amplificado (ou amplicon) no gel de agarose. Esse reagente, chamado de</p><p>fluoróforo, é uma molécula capaz de fluorescer quando excitada no comprimento de onda correto. Em gel de agarose, usamos fluoróforo que</p><p>intercale especificamente com o DNA. A molécula mais comumente utilizada é o brometo de etídio, capaz de se intercalar com qualquer fita dupla</p><p>de DNA. Sua capacidade de se ligar ao DNA o torna potencialmente tóxico, carcinogênico e teratogênico, e precisamos manter nossa segurança e</p><p>as boas práticas laboratoriais para evitar de nos contaminarmos com ele.</p><p>Existem diversas formas de se utilizar brometo na revelação do gel, podendo ser adicionado antes da solidificação</p><p>do gel (antes da eletroforese) ou depois da eletroforese, com uma incubação extra. Finalmente, o brometo de etídio</p><p>é excitado no comprimento de onda ultravioleta em um equipamento chamado transiluminador.</p><p>Ao ser excitado, o fluoróforo emite fluorescência e dá a localização das bandas de DNA amplificado de acordo com o marcador de tamanho</p><p>molecular.</p><p>Imagem de um gel de agarose e sua revelação por fluorescência do brometo de etídio em luz ultravioleta.</p><p>Dependendo da técnica de PCR utilizada, assim como do objetivo da PCR, seu resultado pode ser uma única banda de DNA no gel de agarose ou</p><p>múltiplas bandas. Algumas vezes, resultados inesperados também podem aparecer, como múltiplas bandas de DNA, onde apenas uma banda única</p><p>era esperada.</p><p>Cada situação demandará a experiência e o conhecimento do profissional para interpretação e resolução de possíveis problemas.</p><p>Existem alternativas ao uso do gel de agarose para separação de ácidos nucleicos. Um exemplo é o gel de acrilamida/bisacrilamida, usado para</p><p>separar sequências de DNA com alta resolução, de forma que bandas com até um nucleotídeo de diferença em tamanho possam ser diferenciadas.</p><p>O gel de acrilamida/bisacrilamida também permite a separação de RNA e proteínas. No entanto, exige revelação por sistemas diferentes, mais</p><p>complexos, que nem todos os laboratórios possuem estrutura para execução.</p><p>Além de mais tóxica que a agarose, a montagem do gel e sua corrida eletroforética também são mais trabalhosas. Desse modo, o gel de agarose</p><p>corado por brometo de etídio é a</p><p>técnica de revelação de PCR mais utilizada.</p><p></p><p>PCR e eletroforese</p><p>Veja na prática a reação em cadeia pela polimerase.</p><p>Falta pouco para atingir seus objetivos.</p><p>Vamos praticar alguns conceitos?</p><p>Questão 1</p><p>Vimos que a PCR é uma ferramenta molecular para amplificação do DNA in vitro. Sobre a PCR, é correto afirmar que</p><p>Parabéns! A alternativa B está correta.</p><p>As DNA-polimerases são incapazes de reconhecer o local de início de replicação, sendo função das primases a colocação dos primeiros</p><p>nucleotídeos. Assim, precisamos usar iniciadores que se anelarão por complementariedade específica à sequência-alvo desejada. O</p><p>anelamento dos oligonucleotídeos permite o reconhecimento pela polimerase, que sintetizará a fita dupla a partir do molde.</p><p>Questão 2</p><p>A PCR convencional contém diversas etapas, desde pipetagem da reação até sua leitura. Considerando as etapas, leia as afirmativas a seguir e</p><p>assinale a alternativa correta:</p><p>I - A temperatura de desnaturação deve ser alta o suficiente para separar as fitas duplas de DNA em fitas simples.</p><p>II - A Taq polimerase é termorresistente e sua temperatura ótima de síntese de DNA é próxima a 70ºC.</p><p>III - Logo após a amplificação, podemos facilmente visualizar o resultado, pois se trata de reação colorimétrica.</p><p>IV - Para identificarmos se nossa sequência-alvo foi amplificada, devemos separar as moléculas de acordo com o tamanho, através de</p><p>eletroforese em gel de agarose, e depois revelar, usando intercalantes de DNA fluorescentes em ultravioleta.</p><p>V - A eletroforese usa a carga negativa do DNA para fazê-lo migrar através do gel em direção ao cátodo, quando submetido à corrente elétrica.</p><p>A a polimerase utilizada é capaz de adicionar todos os nucleotídeos necessários, de maneira inespecífica.</p><p>B</p><p>a especificidade da reação é por oligonucleotídeos iniciadores para demarcar a sequência e permitir que a polimerase inicie a</p><p>síntese.</p><p>C a PCR ocorre de forma linear, ou seja, nenhuma etapa de variação de temperatura se repete.</p><p>D a Taq polimerase é uma enzima sensível ao calor e deve ser adicionada a cada novo ciclo.</p><p>E apenas nucleotídeos com hidroxilas no terceiro carbono da ribose são adicionados pela Taq polimerase.</p><p>A Somente a afirmativa II está correta.</p><p>B Somente as afirmativas I, II e III estão corretas.</p><p>C Somente as afirmativas II, III, IV e V estão corretas.</p><p>D Somente as afirmativas I, IV e V estão corretas.</p><p>Parabéns! A alternativa E está correta.</p><p>Na PCR, ocorre o aumento exponencial do número de fitas duplas de DNA correspondentes à sequência-alvo. No entanto, esse aumento é</p><p>invisível a olho nu e precisa ser revelado.</p><p>2 - Variações entre cada técnica de PCR</p><p>Ao �nal deste módulo, você será capaz de diferenciar as variações entre cada técnica de PCR.</p><p>Variações da técnica de PCR</p><p>Existem situações em que a PCR qualitativa e convencional pode não ser a técnica ideal para o nosso objetivo. Podemos nos deparar com casos em</p><p>que a concentração do DNA total da amostra é muito baixa, o que pode limitar o uso do produto amplificado em outras aplicações, como o</p><p>sequenciamento. Em determinadas ocasiões, queremos saber o quanto de determinada sequência temos em nossas amostras. Em outras</p><p>situações, podemos estar interessados no produto da expressão de um determinado gene, e precisamos olhar para o RNA mensageiro ao invés do</p><p>DNA, já que os níveis de DNA de uma célula são mantidos constantes, salvo raras exceções.</p><p>Dica</p><p>Como você pode ver, existem diversos outros interesses, e uma PCR convencional dará apenas a base para que variações mais complexas,</p><p>específicas e úteis sejam desenvolvidas, validadas e usadas.</p><p>Reação de transcrição reversa</p><p>Como já sabemos, a DNA polimerase é capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a partir de uma fita de DNA molde. Afinal, ela é uma DNA</p><p>polimerase DNA-dependente. Mas, em muitas ocasiões, é necessário investigar a expressão de um gene, ou até mesmo diagnosticar doenças</p><p>causadas por vírus que não têm material genético feito por DNA. Nesses casos, a molécula a ser detectada e quantificada indiretamente é o RNA. A</p><p>Taq polimerase, no entanto, não é capaz de reconhecer ou de adicionar nucleotídeos a riboses; ela só trabalha com desoxirriboses.</p><p>E Somente as afirmativas I, II, IV e V estão corretas.</p><p>Como conseguimos resolver esse problema?</p><p>Pelos organismos que conseguem sintetizar DNA a partir de RNA!</p><p>Assim como o SARS-CoV2, coronavírus causador da covid-19, existem outros vírus de genoma RNA. Os primeiros vírus a serem estudados pela</p><p>humanidade foram os de genoma RNA chamados de retrovírus. Esses vírus têm algo de especial: a capacidade de inverter a ordem DNA → RNA →</p><p>proteína do dogma central da Biologia Molecular, usando uma enzima para sintetizar um DNA complementar (cDNA) ao seu genoma RNA. Isso</p><p>mesmo, os retrovírus usam o RNA de seu genoma como molde para síntese de DNA.</p><p>Os retrovírus possuem uma enzima capaz de sintetizar DNA a partir de RNA, cujo nome oficial é DNA polimerase RNA-dependente.</p><p>Corriqueiramente, ela é chamada de transcriptase reversa, ou TR, pois faz o reverso da transcrição: sintetiza DNA a partir do RNA. Uma vez que os</p><p>pesquisadores conseguiram isolar a TR, ela passou a ser usada para reações in vitro. Na maioria dos casos, é usada uma TR purificada a partir de</p><p>vírus aviários, de forma que as TR não representam nenhum risco de infecção ao manipulador e são seguras para diagnóstico e pesquisa.</p><p>Assim como uma reação pela polimerase, a reação de transcrição reversa (RT - usada daqui em diante para designar a reação em si) precisa de</p><p>alguns fatores elementares. O primeiro fator necessário é o RNA de polaridade positiva (RNA+) de qualidade, o que requer muito cuidado na</p><p>manipulação e extração do material. Esse RNA é assim chamado por possuir o mesmo sentido de transcrição e tradução que um RNA mensageiro</p><p>(mRNA), mas expande o entendimento para vírus que nem sempre tem seu RNA+ diretamente traduzido na célula, como os próprios retrovírus. Além</p><p>do RNA+, a RT também precisará da enzima transcriptase reversa para fazer a síntese de cDNA a partir do RNA+.</p><p>Assim como as primeiras DNA-polimerases usadas na PCR mais rudimentar, a TR não é resistente à temperatura. Dessa forma, a reação de</p><p>transcrição reversa deve preceder a PCR, pois a TR é inativada pelas temperaturas de desnaturação. Da junção de reação de transcrição reversa (RT)</p><p>seguida por PCR, vem o termo RT-PCR. A TR precisará de pequenos oligonucleotídeos, menores ainda que os usados em uma PCR convencional,</p><p>para iniciar a transcrição.</p><p>Esses oligonucleotídeos têm, em média, apenas 6 bases e, por isso, são chamados de hexâmeros. Eles podem ser específicos para determinada</p><p>sequência de RNA, ou podem ser uma sequência curta rica em timinas (poli-T), que se anelará à cauda poli-A do mRNA, ou podem ser</p><p>aleatorizados, sendo este último o mais usado por permitir a síntese e o armazenamento do cDNA derivado de diversas sequências diferentes.</p><p>Primeiro caso</p><p>Sintetizamos apenas cDNAs correspondentes ao RNA (mensageiros ou não) ao qual os hexâmeros se anelam.</p><p>Segundo caso</p><p>P d i DNA l t t d RNA d él l tit i bibli t d ã ê i</p><p>Ao contrário da PCR, que contém ciclos que se repetem várias vezes para a amplificação de determinada sequência, a RT é linear: cada etapa</p><p>acontece apenas uma vez, o que não permite amplificação de sinal. Primeiro, a reação começa com o anelamento dos hexâmeros ao RNA+ por</p><p>poucos minutos. Na maioria dos casos, não há necessidade de temperaturas altas de desnaturação, pois o RNA+ já é uma fita simples. Contudo,</p><p>podem ocorrer estruturas secundárias no RNA que precisam de temperaturas moderadas para desnaturação.</p><p>Veja na imagem a desnaturação de eventuais estruturas secundárias do RNA, seguido por anelamento dos hexâmeros iniciadores à sequência-alvo</p><p>por complementariedade, e síntese de cDNA pela transcriptase reversa.</p><p>Ilustração das etapas da reação de transcrição reversa (RT).</p><p>Em seguida, o tubo será aquecido ou resfriado até a temperatura de extensão pela TR. Diferentemente da PCR convencional, a RT possui</p><p>diversas TR</p><p>de origens diferentes que podem ser usadas. Assim, os protocolos variam entre diferentes marcas de enzimas. Em alguns casos, a RT pode ter</p><p>apenas essas duas temperaturas, de anelamento e extensão, de 25 e 37ºC, respectivamente. O cDNA produzido pode ser armazenado por meses a</p><p>anos em geladeira (4ºC) ou freezer (-20ºC), ou usado imediatamente como molde em uma PCR – a chamada RT-PCR.</p><p>Resumo esquemático dos reagentes necessários, das etapas e da amplificação do cDNA em uma RT-PCR.</p><p>Nested-PCR</p><p>A PCR convencional é muito útil, mas, às vezes, não consegue amplificar determinada sequência que esteja presente em pouquíssima quantidade.</p><p>Quando há dificuldade em se amplificar o DNA alvo na PCR convencional, o gel de agarose pode não ter capacidade suficiente para evidenciar o</p><p>amplicon. Nós chamamos essa capacidade de o resultado representar a realidade de sensibilidade.</p><p>A sensibilidade da PCR reflete a capacidade de detecção do sinal do DNA-alvo, em amostras que possuem o DNA-alvo na realidade. Normalmente, a</p><p>PCR tem ótima sensibilidade por aumentar exponencialmente a sequência-alvo. No entanto, em alguns casos, a sensibilidade da PCR convencional</p><p>pode não ser suficiente, pois existe uma saturação da reação por volta do 35º ciclo: atingimos um platô em que não há aumento do número de fitas</p><p>devido ao esgotamento dos reagentes. Então, ter mais de 40 ciclos em uma PCR não oferecerá nenhum benefício, porém, pode aumentar as</p><p>Podemos criar cDNA complementares a todos os mRNA da célula, o que constitui uma biblioteca de expressão gênica.</p><p>Terceiro caso</p><p>Com uso de iniciadores aleatorizados, criamos uma biblioteca de cDNA correspondente a todos os RNAs da célula, mensageiros ou</p><p>não. Similar à PCR, uma vez que os oligonucleotídeos se ligam à fita de RNA+, a TR começa a sintetizar uma fita de cDNA</p><p>complementar usando o quarto reagente, os desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs).</p><p>chances de produtos inespecíficos que atrapalharão a interpretação.</p><p>Observe no gráfico que a quantidade de DNA, detectada por fluorescência, aumenta exponencialmente até chegar a um platô, em que não há mais</p><p>aumento significativo de DNA a cada ciclo.</p><p>Gráfico representativo das qPCR.</p><p>A solução para PCR com baixa sensibilidade é relativamente simples: usar uma fração da primeira reação como molde para uma segunda PCR, em</p><p>uma técnica conhecida como nested-PCR (ou PCR aninhada). Para isso, utilizamos dois pares de iniciadores, sendo o par de primers para a primeira</p><p>reação, chamado de iniciadores externos, e os primers usados na segunda PCR, conhecidos como internos.</p><p>Dessa maneira, a segunda PCR sempre gera um produto menor que a primeira reação, e conseguimos aumentar o número de ciclos de amplificação</p><p>de, no máximo, 40 (na PCR convencional) para entre 60 e 80 ciclos no total de ciclos combinados nas duas reações subsequentes.</p><p>Consequentemente, aumentamos a quantidade de DNA amplificado obtido ao final da segunda PCR. Caso seja utilizada corretamente, a adição de</p><p>etapa nested pode melhorar muito a sensibilidade e a especificidade da PCR.</p><p>Para isso, são necessários alguns cuidados especiais. O primeiro deles está no desenho da reação, que deve ser pensada como um conjunto. A</p><p>primeira PCR deve possuir oligonucleotídeos que, ao se anelarem a determinada região, permitam que a polimerase produza um amplicon longo e</p><p>específico o suficiente para ser usado como DNA-molde na segunda reação.</p><p>Saiba mais</p><p>Caso desejemos amplificar sequências altamente repetitivas, precisaremos levar em consideração uma primeira PCR cujo amplicon contenha</p><p>regiões específicas ao redor das repetições, para que haja uma boa reação secundária. Isso porque, essa última precisa de iniciadores que se</p><p>anelem especificamente à região que foi amplificada anteriormente.</p><p>Contudo, devemos evitar o uso dos mesmos oligonucleotídeos da primeira reação, já que podem reduzir a eficácia da segunda reação, além de gerar</p><p>produtos inespecíficos. Outro cuidado recomendável para a segunda reação é a purificação do produto da primeira reação antes de utilizá-lo na</p><p>segunda, o que evita contaminações entre amostras, reduz o risco de inespecificidade e aumenta a eficácia da segunda PCR. Note o uso de</p><p>iniciadores externos na primeira reação, amplificando um produto que será usado como molde de amplificação na segunda reação, que usa</p><p>iniciadores internos.</p><p>Representação esquemática de uma nested-PCR.</p><p>PCR quantitativo em tempo real – qPCR</p><p>Até agora, todas as técnicas que discutimos precisam da eletroforese em gel de agarose para separação dos produtos da PCR e posterior revelação</p><p>das bandas através de agentes intercalantes do DNA que emitem fluorescência; por exemplo, o brometo de etídio, quando submetido à luz</p><p>ultravioleta. Esses tipos de PCR são categorizados como qualitativos e podem ser muito úteis, especialmente, quando o DNA amplificado for</p><p>utilizado em outra técnica subsequente. Entretanto, existem situações em que a PCR qualitativa se torna pouco informativa.</p><p>Exemplo</p><p>Quando queremos determinar se um tratamento está surtindo efeito na redução de um marcador genético específico. Nesse caso, a PCR</p><p>convencional e suas variações vistas até agora não informam o suficiente para tomada de decisões. Precisamos, assim, de técnicas que revelem a</p><p>quantidade de certa sequência específica de DNA com o máximo de precisão possível. Entra em cena a PCR quantitativa - também conhecida como</p><p>PCR em tempo real - (qPCR).</p><p>A qPCR tem a capacidade de quantificação da sequência-alvo e de leitura em tempo real dos resultados, sem necessidade de revelação posterior.</p><p>Isso porque, ela possui dois fatores adicionais a uma PCR qualitativa: a adição de fluoróforos à própria reação e o uso de um termociclador capaz</p><p>de detectar o sinal fluorescente. Dessa forma, a cada novo ciclo de desnaturação-anelamento-amplificação, ocorre aumento da quantidade de DNA-</p><p>alvo e da emissão de fluorescência proporcional à quantidade de DNA sendo sintetizada naquele ciclo.</p><p>Para que a fluorescência seja detectada, a qPCR exige a utilização de termocicladores que contenham lasers para excitação do fluoróforo e</p><p>detectores da fluorescência. Esse aparelho é mais sofisticado, mais caro e mais complexo do que um termociclador convencional, porém seus</p><p>resultados podem ser igualmente mais informativos e precisos. Outra diferença da qPCR é que, em alguns casos, podemos ter uma temperatura</p><p>única para anelamento e extensão: todas as duas acontecem a 60 oC.</p><p>Exemplo dos ciclos de temperatura usados em SYBR qPCR contendo a fase de amplificação e a fase de curva de dissociação.</p><p>Existem duas técnicas de qPCR largamente usadas: SYBR Green e TaqMan. Elas diferem especialmente na forma como a fluorescência é emitida e</p><p>na especificidade do sinal fluorescente. As formas de quantificação são, por outro lado, semelhantes. Vamos explorar as duas em mais detalhes?</p><p>Vejamos!</p><p>SYBR Green</p><p>O SYBR é fluoróforo que, como o brometo de etídio, é capaz de intercalar em fitas duplas de DNA. Quando está associado ao DNA, o SYBR pode ser</p><p>excitado em comprimento de onda azul, e então emite fluorescência verde. Quando não está ligado ao DNA fita dupla, o SYBR tem sua fluorescência</p><p>drasticamente reduzida. Por sua capacidade de fluorescer quando ligado ao DNA fita dupla, ele também é usado como um sistema alternativo na</p><p>revelação da PCR convencional em gel de agarose, já que é menos tóxico que o brometo de etídio.</p><p>Quando adicionado à qPCR, o SYBR emitirá o máximo de fluorescência na fase de extensão, pois esse é o momento em que há maior número de</p><p>bases pareadas em fitas duplas. O aparelho termociclador irá incidir um laser, excitando o SYBR a emitir fluorescência verde. Essa fluorescência</p><p>será detectada pelo aparelho, que mostrará a quantidade de fluorescência por ciclo. A cada novo ciclo, maior será a fluorescência emitida, pois</p><p>maior será a quantidade de DNA fita dupla sendo sintetizada.</p><p>Desse modo, a progressão de fluorescência será proporcional à quantidade de DNA amplificado a cada ciclo, até que</p><p>a reação atinja sua saturação,</p><p>e um platô após a curva de crescimento exponencial será observado. Repare que, quando não está ligado ao DNA dupla fita, devido à sua</p><p>desnaturação, o SYBR não emite fluorescência. Ao ligar-se à fita dupla de DNA, durante a sua extensão, a fluorescência é emitida.</p><p>Esquema ilustrando a teoria por trás da fluorescência do SYBR.</p><p>É importante considerarmos que essa interação entre o SYBR e a fita dupla de DNA não é controlada:</p><p>O SYBR irá se intercalar com qualquer fita dupla de DNA. Isso faz com que a emissão de fluorescência seja menos</p><p>específica: como em uma reação convencional, apenas os oligonucleotídeos iniciadores são responsáveis pela</p><p>especificidade. Assim, outras formas de controle da reação foram criadas para garantirmos que o sinal</p><p>fluorescente usado na quantificação corresponda apenas ao produto desejado.</p><p>Portanto, adicionamos um passo a mais a qPCR: a curva de dissociação (melting curve). Nessa etapa, o termociclador aquecerá a PCR lentamente,</p><p>para medir em qual temperatura 50% das fitas duplas de DNA sintetizadas se dissociam. Essa dissociação será medida, mais uma vez, através da</p><p>fluorescência pelo SYBR. Essa temperatura dependerá de dois fatores principais: o conteúdo CG e o tamanho da sequência.</p><p>Por isso, reações de SYBR tem amplicons com tamanho limitado em cerca de 100 nucleotídeos em média. Em uma curva de dissociação boa e</p><p>específica, todas as moléculas amplificadas irão se dissociar na mesma temperatura e, assim, só um pico é observado no gráfico. Em uma qPCR</p><p>por SYBR sem especificidade, mais de um pico será visto na curva de dissociação, e a reação precisará ser ajustada. Esse é um importante nível de</p><p>controle de qualidade da reação que não deverá ser ignorado.</p><p>A existência de um único pico (a 76,49 °C) indica que há apenas um produto amplificado, o que confirma a especificidade da qPCR. Observe:</p><p>Exemplo de resultado de uma curva de dissociação dos produtos de uma qPCR por SYBR Green.</p><p>Quanti�cação absoluta por SYBR</p><p>Confira mais detalhes sobre PCR em tempo real pela metodologia SYBR para fazer uma curva de quantificação absoluta.</p><p>TaqMan</p><p>Outra forma bastante comum de qPCR, cujo nome vem da referência ao jogo de videogame dos anos 1980, PacMan. Assim como na técnica SYBR,</p><p>a quantificação em tempo real na TaqMan ocorre através da emissão e detecção de fluorescência a cada ciclo de amplificação. Entretanto, a</p><p>TaqMan difere do SYBR na forma como a emissão da fluorescência acontece: Além de todos os reagentes que uma PCR convencional possui,</p><p>temos a presença de uma sequência extra, complementar à região interna dos iniciadores. Essa sequência extra é conhecida como sonda e é curta,</p><p>com tamanho aproximadamente igual ao dos oligonucleotídeos iniciadores, e possui temperatura de anelamento pouco superior à deles. A sonda</p><p>contém uma molécula fluorescente na extremidade 5’, e outra molécula na extremidade 3’, que bloqueia a emissão de fluorescência.</p><p>A existência de uma sonda que se anela à região alvo a ser amplificada não representa muito, se a molécula fluorescente não for liberada de seu</p><p>bloqueador. Para isso, a enzima Taq polimerase usada na TaqMan é diferente das outras Taq polimerases. Ela adiciona nucleotídeos</p><p>(polimerização), como as demais polimerases, e remove nucleotídeos (função exonuclease).</p><p></p><p>A remoção de nucleotídeos é fundamental para a detecção da fluorescência, pois, quando a enzima chega ao nucleotídeo da sonda que contém o</p><p>fluoróforo e o remove da sequência, o fluoróforo estará livre de seu bloqueador e poderá emitir fluorescência detectável. A cada novo ciclo da PCR,</p><p>as fitas duplas serão desnaturadas, os iniciadores e a sonda se anelarão, e a TaqMan polimerase fará síntese do DNA. Com remoção dos</p><p>nucleotídeos da sonda, o fluoróforo nela contida é liberado para emitir fluorescência proporcional a cada nova sequência-alvo sintetizada.</p><p>Repare na ilustração que a sonda anelada entre os dois iniciadores é clivada pela TaqMan polimerase durante a extensão do DNA, permitindo a</p><p>emissão de fluorescência.</p><p>Representação esquemática da qPCR pelo método de TaqMan.</p><p>A TaqMan apresenta uma vantagem extra para especificidade da reação: o anelamento da sonda é específico para a região alvo a ser amplificada. A</p><p>especificidade dada pela sonda é tamanha que diferenças de apenas um nucleotídeo podem ser detectadas – essas mutações são conhecidas</p><p>como single nucleotide polymorphism (SNP).</p><p>Assim sendo, a TaqMan dispensa técnica complementar para avaliação da especificidade, como a curva de dissociação, o que a faz mais rápida do</p><p>que a técnica de SYBR. Entretanto, as sondas tornam a reação mais cara. Outra vantagem que a TaqMan traz em relação ao SYBR é a capacidade de</p><p>múltiplas detecções na mesma reação com maior precisão e confiabilidade. Veremos mais detalhes à frente.</p><p>Tanto a técnica de SYBR quanto a TaqMan são capazes de quantificar o DNA ou cDNA. A técnica como a quantificação é obtida varia, mas a maioria</p><p>das análises posteriores podem ser usadas igualmente – uma vez que resultados confiáveis tenham sido obtidos através de rigoroso controle de</p><p>qualidade.</p><p>Quanti�cação</p><p>Na qPCR, cada ciclo desnaturação-anelamento-extensão produzirá fluorescência, que será detectada pelo aparelho.</p><p>Deve-se ajustar o programa do aparelho para que ele saiba qual laser e quais filtros usar para a excitação de cada fluoróforo e em qual</p><p>espectro da emissão ele deverá buscar o sinal para detecção. Isto é, você é o responsável em dizer ao aparelho o que ele deve fazer.</p><p>Deve-se ajustar o aparelho para que ele determine, nos ciclos iniciais de amplificação, qual é o nível em que o sinal obtido é superior</p><p>ao sinal de ruído. Como a qPCR utiliza fluoróforos para a quantificação, por vezes existe um “vazamento” de fluorescência no início da</p><p>reação que não está relacionada com a amplificação da sequência-alvo em si.</p><p>Esse sinal inespecífico, geralmente, obtido nos primeiros ciclos, chamamos de sinal de ruído (background). O ruído vai ser utilizado</p><p>para determinar o limiar de detecção (threshold).</p><p>O primeiro ciclo em que a fluorescência de determinada amostra ultrapassa o limiar de detecção acima do ruído (ou da fluorescência de base) é</p><p>chamado de valor de Ct. Esse valor é importante por estar diretamente relacionado à quantidade inicial de DNA-alvo da amostra amplificada. A</p><p>relação entre concentração inicial de DNA-alvo na amostra e Ct é inversamente proporcional, o que significa que, quanto menor for o Ct de uma</p><p>amostra, maior a quantidade de DNA que ela originalmente continha.</p><p>Outros dois parâmetros usados pelo aparelho para ajustar (ou normalizar) a reação internamente são a ROX, um</p><p>fluoróforo passivo (cuja fluorescência não aumenta de acordo com a amplificação do DNA) usado como referência,</p><p>e o Rn, que representa um ajuste (ou normalização) entre o sinal do fluoróforo de escolha (SYBR ou da sonda</p><p>TaqMan) e a referência ROX. A maioria dos reagentes para qPCR já possuem ROX adicionados ao tampão, cabendo</p><p>a nós apenas a observação para eventual detecção de anomalias que podem invalidar a reação. Mais uma vez, a</p><p>qPCR tem que manter padrões rígidos de controle de qualidade para que diferenças mínimas na quantidade sejam</p><p>confiáveis.</p><p>Com todos esses fatores ajustados corretamente, os aparelhos mais modernos detectarão o sinal emitido a cada ciclo e darão, em tempo real, o</p><p>resultado na tela do computador ao qual ele precisa estar ligado para funcionar, em um gráfico chamado de curva de amplificação.</p><p>Veja o exemplo de gráfico de amplificação para o gene Suc2 da Saccharomyces cerevisae. Note a reta paralela ao eixo x (horizontal), que representa</p><p>o valor de limiar de detecção / quantificação. Abaixo dela, temos o ruído da reação. As curvas amarelas e vermelhas representam a quantificação</p><p>das amostras e, como você pode observar, existem 4 amostras em duplicata; a com maior quantidade de DNA é a mais à esquerda no gráfico, com</p><p>menor Ct.</p><p>Você consegue dizer qual é o Ct da amostra mais concentrada?</p><p>Gráfico de amplificação.</p><p>Existem</p><p>duas formas de se quantificar o produto amplificado: pela curva padrão e por quantificação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt).</p><p>Pela curva padrão</p><p>Em muitos casos, a quantificação absoluta do DNA alvo na amostra é necessária. Para isso, devemos ter em mãos uma curva padrão, com</p><p>concentrações conhecidas do DNA alvo. Essa curva pode ser comprada de laboratórios especializados em sua fabricação ou produzida por nós</p><p>mesmos, através de clonagens e purificação. A partir da concentração mais alta, faremos uma diluição seriada. Para isso, colocamos uma fração da</p><p>solução de maior concentração em um tubo contendo apenas água, e depois deste tubo para outro com apenas água, e assim sucessivamente até</p><p>termos pelo menos 5 pontos de curva.</p><p>Diluição seriada usando a escala em mililitro (mL) como exemplo, porém para a nossa metodologia é utilizada a escala em microlitro (µL).</p><p>Em seguida, informamos ao aparelho em quais posições cada concentração da curva está, de forma que o próprio computador calcule os</p><p>parâmetros de qualidade da curva. Com esses valores, o computador calcula a quantidade de DNA existente nas nossas amostras de concentração</p><p>desconhecida. Alguns dos principais valores dados pela curva padrão que usamos para determinar a concentração da amostra-teste são a</p><p>linearidade da curva e a eficiência de amplificação.</p><p>Repare na imagem a seguir que existem 5 quantidades diferentes da curva padrão (em vermelho), obtidas pela diluição seriada, e três amostras</p><p>desconhecidas (em azul) cuja quantidade de DNA foi calculada a partir de seus Cts e com base na linearidade da curva padrão.</p><p>Exemplo de curva padrão para quantificação absoluta do DNA.</p><p>Linearidade da curva</p><p>Matematicamente conhecida como R2,, deve ser superior a 0.985 para que a reação seja aceitável, e a quantificação de sua amostra-teste seja</p><p>calculada com máximo de precisão. Usando fórmulas de linearidade, calculamos o valor preciso de DNA-alvo na amostra antes da amplificação</p><p>começar, baseado no Ct de cada uma.</p><p>E�ciência de ampli�cação</p><p>Com ela, a cada ciclo, espera-se que a quantidade de DNA-alvo amplificado dobre, o que significaria uma eficiência de 100% da reação. Porém,</p><p>devido a pequenos erros, podemos considerar aceitáveis eficiências que variem entre 90 e 110%. Esses parâmetros serão mais robustos com uso</p><p>de replicatas (repetições da mesma reação em poços diferentes.).</p><p>Por quanti�cação relativa, ou método de delta-delta-CT (ou ΔΔCt)</p><p>Nesse método, você precisará quantificar dois DNA-alvos diferentes: o DNA de interesse, cuja quantidade é desconhecida na amostra, e o DNA de</p><p>referência. A determinação da quantidade de um DNA-alvo de interesse é feita a partir da subtração (ou seja, o delta) do Ct (ciclo em que a amostra</p><p>ultrapassou o limiar) pelo Ct do outro DNA quantificado na amostra, o de referência. Isso porque, a quantidade do gene de interesse pode variar de</p><p>acordo com diversos fatores biológicos, mas também pode ser devido à quantidade de material usado na extração.</p><p>Nesse caso, o ideal é fazer uma normalização pela quantidade de cDNA total e, para isso, usamos um cDNA de referência, que, geralmente, é um</p><p>gene constitutivo expresso em níveis estáveis nas células. O segundo delta, ou a segunda subtração, é feita entre a diferença da primeira subtração</p><p>na amostra-teste e uma amostra controle, usada como calibradora. A amostra calibradora também precisará ter passado pela primeira subtração;</p><p>ou seja, também terá sido normalizada. Dessa forma, temos:</p><p>Rotacione a tela. </p><p>Essas subtrações são possíveis apenas quando as curvas de quantificação dos dois DNAs-alvo têm eficiência entre 90-110%, e não devem diferir</p><p>em mais de 10% entre si. Por isso, curvas-padrão iniciais para cada gene devem ser construídas para se verificar as eficiências da reação, antes de</p><p>procedermos para a técnica de quantificação relativa.</p><p>Se quisermos comparar a expressão de dois genes entre uma amostra e um calibrador, usamos um método especial. Você consegue identificar</p><p>qual? A pista mais importante é: você está investigando a expressão gênica, e não a existência do gene em si. Portanto, você não está olhando</p><p>diretamente o genoma, mas um produto dele. Qual produto do DNA podemos detectar via PCR?</p><p>Δ Ct = Ctgene alvo − Ctgene de referéncia SeguidoporΔ Δ Ct = (Ctgene alvo − Ctgene de referencia )calibrador − (Ctgene alvo − Ctgene de referencia )am</p><p>Resposta</p><p>Se você respondeu RNA, acertou! Nesse caso, o nome correto e completo da técnica utilizada é RT-qPCR: uma reação de transcrição reversa</p><p>acoplada a uma reação em cadeia da polimerase quantitativa.</p><p>PCR em multiplex</p><p>Até agora, falamos sobre detectar apenas um DNA-alvo por reação, seja de PCR convencional, nested-PCR, RT-PCR ou qPCR. Contudo, podemos</p><p>detectar mais de um alvo por reação. Precisaremos ajustar as reações separadamente, utilizando pares de oligonucleotídeos iniciadores específicos</p><p>para cada produto desejado, e depois fundir as duas PCRs em uma. Esse tipo de PCR em que mais de um produto alvo é identificado chamamos de</p><p>multiplex – múltiplos produtos são detectados, e até quantificados.</p><p>Em uma PCR convencional, vamos utilizar todos os reagentes que já conversamos e, é claro, os quatro (ou mais) oligonucleotídeos necessários,</p><p>sendo cada par correspondente à sua sequência-alvo. O mais importante para fazermos um multiplex em uma PCR convencional é que os</p><p>amplicons tenham tamanhos distintos o suficiente para serem separados pelo gel de agarose, a fim de que os sinais de ultravioleta não sejam</p><p>confundidos. Normalmente, os produtos menores de 1000 pares de base (pb) devem ter mais de 200 pb de diferença. Para produtos maiores de</p><p>1000 pb, a diferença entre os produtos também deve ser maior.</p><p>Lembre-se de que você deverá levar em consideração o tamanho do maior produto para o tempo de extensão.</p><p>Outro fator ao qual você deverá estar atento é a temperatura de anelamento dos múltiplos pares de iniciadores, que</p><p>devem ter temperaturas o mais próximas possível.</p><p>Em uma qPCR-TaqMan, a amplificação e quantificação de diferentes sequências na mesma reação é possível ao utilizarmos duas (ou mais) sondas</p><p>distintas, cada uma capaz de hibridizar especificamente a sua sequência-alvo, e ambas marcadas com fluoróforos que se excitem e emitam</p><p>fluorescência em comprimentos de onda diferentes.</p><p>Você poderá usar um fluoróforo que seja excitado no comprimento de onda azul e emita fluorescência no espectro verde, e outro fluoróforo que seja</p><p>excitado e floresça no comprimento vermelho, e assim por diante.</p><p>Por outro lado, reações multiplex quantitativas usando o sistema SYBR são mais difíceis. Isso porque a emissão de fluorescência pelo SYBR é</p><p>inespecífica e ocorre sempre que o fluoróforo intercala com fitas duplas do DNA. Assim, a reação multiplex fica limitada e, muitas vezes, não é</p><p>possível distinguirmos entre os sinais dos diferentes produtos.</p><p>Em alguns casos, entretanto, a distinção é possível graças à curva de dissociação. Isso ocorre quando os produtos distintos têm sequências</p><p>diferentes o suficiente para terem temperaturas de dissociação de 50%. Então, observamos dois picos na curva de dissociação, em temperaturas</p><p>diferentes. No entanto, sequências distintas sem diferença suficiente em seus conteúdos CG não poderão ser multiplexadas, pois não veremos</p><p>diferenças em suas curvas de dissociação.</p><p>Falta pouco para atingir seus objetivos.</p><p>Vamos praticar alguns conceitos?</p><p>Questão 1</p><p>A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na pesquisa. A respeito da aplicação da PCR e de suas variações, é correto afirmar</p><p>que</p><p>Parabéns! A alternativa C está correta.</p><p>A</p><p>na nested-PCR, fazemos duas reações em um único tubo, amplificando regiões diferentes que geram produtos de tamanhos</p><p>distintos.</p><p>B o SYBR é um fluoróforo presente em PCR multiplex que dá maior estabilidade à reação.</p><p>C</p><p>na RT-PCR, ocorrem duas reações subsequentes: uma de síntese de cDNA a partir de RNA, e outra de amplificação da</p><p>sequência-alvo presente no cDNA.</p><p>D</p><p>uma PCR multiplex consiste em utilizar</p><p>duas reações subsequentes, sendo que o produto amplificado da primeira serve como</p><p>molde para amplificação na segunda.</p><p>E a reação de transcrição reversa utiliza uma polimerase especial, capaz de sintetizar RNA a partir de DNA.</p><p>A Taq polimerase usada para amplificação de DNA não é capaz de reconhecer e polimerizar RNA. Quando queremos analisar RNAm,</p><p>precisamos que o cDNA seja sintetizado pela DNA-polimerase RT dependente, ou transcriptase reversa. Então, usamos o cDNA sintetizado</p><p>como molde em uma PCR.</p><p>Questão 2</p><p>Existem diferentes técnicas de PCR com aplicações variadas. Considerando isso, leia as afirmativas abaixo e, em seguida, assinale a alternativa</p><p>correta.</p><p>I – Podemos usar PCR convencional para amplificar um gene e cloná-lo em um vetor, e modificarmos geneticamente um organismo simples.</p><p>II – Pelo uso de diferentes sondas marcadas com sinais diferentes, a qPCR TaqMan pode ser usada na identificação e quantificação de</p><p>mutações em diferentes alelos.</p><p>III – As técnicas moleculares são de pouca importância na rotina clínica, pois são demoradas e de aplicações muito restritas.</p><p>IV – O tamanho de STRs é relevante no diagnóstico de doenças genéticas.</p><p>Parabéns! A alternativa A está correta.</p><p>A PCR convencional pode ser utilizada para clonar um gene através de um vetor, como plasmídeo. Na qPCR-TaqMan, as sondas auxiliam na</p><p>quantificação de mutações de alelos diferentes. O tamanho e conteúdo das STRs oferecem grande precisão na identificação de indivíduos. As</p><p>técnicas moleculares, como a PCR e as suas variações, têm ganhado muito espaço na rotina clínica. Há situações em que o diagnóstico por</p><p>amplificação de ácidos nucleicos é o padrão-ouro e, às vezes, é a única opção. Suas aplicações vão de diagnóstico de doenças genéticas e</p><p>infecciosas ao acompanhamento da evolução e tratamento de cânceres e infecções crônicas, assim como determinação de riscos genéticos e</p><p>aconselhamentos.</p><p>A Somente as afirmativas I, II e IV estão corretas.</p><p>B Somente as afirmativas I e IV estão corretas.</p><p>C Somente as afirmativas III e IV estão corretas.</p><p>D Somente as afirmativas I e II estão corretas.</p><p>E Somente as afirmativas I, III e IV estão corretas.</p><p>3 - Aplicações apropriadas ao uso de cada método</p><p>Ao �nal deste módulo, você será capaz de identi�car aplicações apropriadas ao uso de cada método.</p><p>Aplicações da PCR</p><p>Até agora, vimos os reagentes necessários à amplificação exponencial de uma sequência específica de DNA até termos milhões e bilhões de cópias</p><p>da mesma exata sequência, ou amplicon, que pode ser visualizada a partir de técnicas especiais. Também vimos algumas variações da PCR que a</p><p>tornam ainda mais relevante e útil em diversos contextos.</p><p>Mas, afinal, para que precisamos de tantas sequências idênticas? Quais são as aplicações disso? Para ilustrar melhor o quão útil a PCR é, veremos</p><p>alguns exemplos a seguir.</p><p>A PCR e as suas variantes em ciências forenses</p><p>A primeira, e talvez uma das mais famosas para o grande público, é a aplicação forense. Você já deve ter entrado em contato com a identificação de</p><p>um criminoso a partir do seu DNA deixado na cena do crime, seja por ter assistido a alguma série policial, seja por ter lido alguma reportagem da</p><p>vida real. Isso só é possível porque cada ser humano possui um genoma completamente único, exceto de gêmeos idênticos.</p><p>Em nosso genoma, temos regiões especiais nas quais um cientista forense pode olhar para confirmar a origem do DNA. Denominadas marcadores</p><p>moleculares, elas são conhecidas pela alta frequência de polimorfismos genéticos – regiões com grande variação na sequência de DNA entre</p><p>indivíduos sem causar nenhum tipo de interferência funcional, pois são mais frequentes em regiões não codificantes.</p><p>Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições curtas em tandem (ou STRs – short tandem repeats).</p><p>As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e oferecem grande precisão na identificação de</p><p>indivíduos se a detecção de várias STRs for usada em conjunto.</p><p>As regiões de interesse são amplificadas por PCR e, em seguida, o perfil genético pode ser visualizado por separação das bandas em gel de agarose</p><p>e coloração por brometo de etídio.</p><p>Existem casos em que é necessário aumentar o material genético a ser usado para, assim, aumentarmos o sinal durante a revelação. Nesse caso, o</p><p>perito pode optar pelo uso de uma nested-PCR, lembrando que os primers externos e interno precisam de regiões não repetidas para se anelarem.</p><p>Um cientista forense, além de fazer a extração do DNA e sua amplificação por PCR, fará a identificação de indivíduos através do seu perfil genético.</p><p>Ilustração de um gel de agarose mostrando múltiplas bandas e representando os marcadores moleculares.</p><p>A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças genéticas</p><p>Existe uma gama de aplicações de PCR e suas variações na Medicina, de prevenção ao diagnóstico, acompanhamento e prognóstico, ou evolução,</p><p>de doenças. Ao amplificarmos certas regiões do DNA, podemos identificar a presença ou ausência de sequências que deveriam ou não existir em</p><p>determinado contexto. Seu uso pode auxiliar, ou até mesmo determinar, o diagnóstico de diversas doenças que variam desde genéticas a</p><p>infecciosas. As doenças genéticas podem ser muito complexas em sua apresentação e possuir diferentes perfis – autossômico dominante ou</p><p>recessivo, ligado ao cromossomo X, multifatoriais e multigênicas. O uso da PCR no diagnóstico dessas doenças pode ser feito de diversas</p><p>maneiras, dependendo de qual é a doença e de seu perfil genético.</p><p>O PCR multiplex pode ser utilizado para verificar qual alelo está sendo expresso, dentre dois alelos distintos, em uma mesma reação e assim ajudar</p><p>no reconhecimento de pequenas mutações que levariam ao desenvolvimento de uma doença genética. Mas temos outras aplicações, usando PCR</p><p>convencional.</p><p>Vamos usar a doença de Huntington como exemplo. Nessa doença genética autossômica dominante, ocorre um excesso de repetição de três</p><p>nucleotídeos (CAG) do DNA que codifica uma proteína chamada Huntingtina. Esse excesso leva a uma doença neurodegenerativa sem cura que</p><p>causa perdas motoras, cognitivas e psiquiátricas ainda na idade adulta, apesar de poder aparecer em forma juvenil também. A PCR torna-se uma</p><p>importante ferramenta diagnóstica, pois, ao amplificar sequências próximas da região de repetição, pode nos dizer seu tamanho e, assim, informar o</p><p>risco e até o prognóstico da doença em si.</p><p>Em um gene saudável, é normal ter cerca de 20 repetições (CAG); em pessoas portadoras de Huntington, o número de repetições aumenta para 35</p><p>ou mais. De modo geral, quanto maior o número de repetições, maior o risco de aparecimento e de progressão da doença. Essa gradação de</p><p>fenótipo – no caso da doença de Huntington, de sintomas – é algo conhecido em genética como penetrância.</p><p>Atenção!</p><p>Lembre-se de que, para regiões repetitivas, é necessário usar iniciadores que se anelem próximo a STRs, mas não nas STRs em si, pois isso geraria</p><p>inespecificidade e muitas bandas em um gel de agarose.</p><p>A PCR e as variações usadas no diagnóstico de doenças infecciosas</p><p>Outro exemplo diagnóstico que você já pode ter ouvido falar é o uso da PCR para diagnóstico de doenças infecciosas. Ao utilizar a técnica para</p><p>amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma infecção, já que o material genético de tal agente não deveria</p><p>estar presente naquela amostra biológica. Sua simples presença pode indicar o agente etiológico e, assim, descobrir a causa da doença.</p><p>A PCR é especialmente útil no diagnóstico de organismos fastidiosos, que não crescem bem em cultivo, como o Mycobacterium tuberculosis, por</p><p>possuir alta sensibilidade e especificidade. Em outros casos, a presença do material genético de determinado microrganismo não é suficiente para</p><p>seu diagnóstico como agente causador da doença, e testes complementares a PCR podem ser necessários, assim como técnicas de PCR mais</p><p>elaboradas que darão maiores informações.</p><p>Temos, como exemplo,</p><p>o diagnóstico molecular da covid-19. O SARS-CoV2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), assim como os</p><p>demais coronavírus, tem RNA fita simples como material genético. Dessa forma, usamos a transcrição reversa para sintetizarmos um cDNA viral, e</p><p>o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR.</p><p>Esse é considerado o melhor teste, ou padrão-ouro, para a identificação de casos ativos de infecção pelo SARS-CoV2. Isso porque, o material</p><p>genético viral é identificado de forma relativamente rápida – entre coleta, extração, RT e qPCR, o resultado pode sair em algumas horas. Além disso,</p><p>esse método é muito sensível e específico, conseguindo detectar nas amostras pequenas concentrações do vírus (carga viral).</p><p>A RT-qPCR também é utilizada no diagnóstico e acompanhamento de outras infecções virais. A efetividade do tratamento para HIV pode ser</p><p>monitorada através de RT-qPCR, sendo esperadas reduções drásticas na carga viral após introdução da terapia. O mesmo princípio de quantificação</p><p>de cDNA obtido por transcrição reversa também é aplicado em tratamentos oncológicos, especialmente, em leucemias e linfomas: o oncologista</p><p>pode requerer uma RT-qPCR para acompanhamento de determinado marcador gênico do câncer em questão.</p><p>Nos dois casos, a redução (ou não) das sequências alvo na RT-qPCR ao longo do tempo podem ser cruciais no tratamento e evolução do paciente. A</p><p>PCR convencional multiplex também pode ser utilizada no diagnóstico diferencial entre dois patógenos que possam causar os mesmos sintomas,</p><p>mas que exigem abordagens clínicas diferentes.</p><p>Exemplo</p><p>Um paciente transplantado renal pode apresentar alteração em exames bioquímicos que levem o nefrologista a pensar em duas possibilidades: na</p><p>primeira, uma infecção por um vírus sem gravidade pode estar acontecendo no órgão, e nenhum tratamento seria necessário; na segunda, pode</p><p>estar acontecendo uma infecção viral grave no rim transplantado que poderia rapidamente levar à perda do órgão e até mesmo ao óbito do paciente.</p><p>A PCR e as suas variantes em pesquisa cientí�ca</p><p>Outro campo que utiliza a PCR é a pesquisa científica. Em diversas ocasiões, a PCR pode ser utilizada para manipulação genética de organismos</p><p>simples, como bactérias, leveduras e células em cultivo. Nesse contexto, podemos usar a PCR para, por exemplo, clonarmos um gene. Fazemos isso</p><p>ao amplificarmos a sequência gênica que desejamos clonar usando oligonucleotídeos longos que têm duas regiões distintas. A primeira região liga-</p><p>se ao gene que queremos manipular – deletar, adicionar ou mutar – no organismo alvo; a segunda é a região que se liga ao DNA molde do vetor</p><p>dentro do qual queremos colocar nosso gene clonado.</p><p>O vetor é, em muitos casos, uma sequência independente do genoma do organismo alvo, mas que é capaz de se replicar autonomamente quando</p><p>inserido na célula. Um exemplo de vetores muito usados são os plasmídeos, pequenos DNA circulares autorreplicantes e transferíveis de uma célula</p><p>a outra, comuns em bactérias.</p><p>Representação esquemática de uma técnica de clonagem por restrição, com a inserção (ou clonagem) de um gene de origem diferente, que foi amplificado por PCR, ao vetor original.</p><p>Normalmente, usamos a clonagem por PCR em duas etapas: uma para amplificarmos o gene alvo que queremos clonar; na segunda etapa, usamos</p><p>o produto amplificado, juntamente com o vetor, para inserirmos o gene clonado no vetor. Outra forma de clonagem inclui o uso de enzimas de</p><p>restrição para cortar o DNA em pontos específicos, após amplificação por PCR.</p><p>A pesquisa científica é uma área de atuação muito grande e, por vezes, ela está interessada em entender</p><p>mecanismos complexos de regulação genética sob diversas condições. A RT-qPCR é uma ferramenta muito útil</p><p>nesse caso, para a avaliação dos níveis de expressão de genes em células submetidas a diversas condições</p><p>diferentes.</p><p>É comum utilizarmos a quantificação relativa (em que comparamos a quantidade de um gene de interesse com um gene constitutivo de expressão</p><p>estável) para avaliarmos como o metabolismo celular pode mudar mediante o meio que se encontra. Em geral, você pode considerar que qualquer</p><p>aplicação que determinado método ou técnica tenha em rotinas laboratoriais das mais diversas áreas não apenas é usada em pesquisa científica,</p><p>como, provavelmente, foi originada de uma.</p><p>Quanti�cação relativa de genes por RT-qPCR e seu uso em pesquisa</p><p>Veja mais sobre quantificação relativa usando RT-qPCR pelo método de SYBR.</p><p></p><p>Falta pouco para atingir seus objetivos.</p><p>Vamos praticar alguns conceitos?</p><p>Questão 1</p><p>A PCR possui diversas aplicações, sejam elas práticas ou na pesquisa. A respeito da aplicação da PCR e de suas variações em ciências</p><p>forenses, é correto afirmar que:</p><p>A a nested-PCR não é útil, uma vez que o material genético é encontrado em abundância em situações forenses.</p><p>B a PCR pode nos dar informações importantes, mas não pode determinar a identidade de indivíduos.</p><p>Parabéns! A alternativa C está correta.</p><p>Short tandem repeats (STRs) apresentam grande variação de sequência e de tamanho entre indivíduos. Pela identificação de diferentes padrões</p><p>de um conjunto de STRs, podemos correlacionar amostras com grande precisão, além ser possível também estabelecer grau de parentesco.</p><p>Questão 2</p><p>A técnica de PCR e suas variações são metodologias importantes para amplificações na pesquisa e diagnósticos. Sobre a PCR, escolha a</p><p>alternativa correta:</p><p>Parabéns! A alternativa C está correta.</p><p>Um dos principais marcadores moleculares utilizados em análises forenses são as repetições curtas em tandem e não sequências</p><p>conservadas. As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre as pessoas e oferecem grande precisão na identificação de indivíduos se a</p><p>detecção de várias STRs for usada em conjunto. Este processo não compara genes entre cromossomos de um único indivíduo, mas vários.</p><p>Normalmente, usamos a clonagem por PCR para amplificar o gene alvo e depois inserir o gene clonado no vetor. O diagnóstico molecular da</p><p>covid-19, o SARS-CoV2, assim como os demais coronavírus, tem RNA fita simples como material genético. Dessa forma, usamos a transcrição</p><p>reversa para sintetizarmos um DNA viral, e o utilizamos em qPCR – ou seja, fazemos uma RT-qPCR.</p><p>C as STRs são regiões cuja variabilidade as tornam úteis para distinguir indivíduos geneticamente.</p><p>D a qPCR é uma ferramenta necessária para amplificação do material genético de uma amostra antes de seu sequenciamento.</p><p>E o sequenciamento do genoma não é uma ferramenta viável para a identificação de indivíduos, além de ser trabalhoso e caro.</p><p>A Um dos principais métodos utilizados em análises forenses é o sequenciamento de genes conservados dentro de um DNA.</p><p>B</p><p>As STRs variam em tamanho e em conteúdo entre genes diferentes dentro de um mesmo organismo e oferecem grande</p><p>precisão na identificação de cromossomos se a detecção de várias STRs for usada em conjunto.</p><p>C</p><p>Ao utilizar a técnica para amplificar o DNA (ou RNA) de algum agente infeccioso, podemos diagnosticar uma infecção, já que o</p><p>material genético de tal agente não deveria estar presente naquela amostra biológica.</p><p>D Normalmente, para usarmos a clonagem por PCR basta a amplificação do gene alvo que queremos clonar.</p><p>E</p><p>O diagnóstico molecular da covid-19, o SARS-CoV2, assim como os demais coronavírus, tem o DNA como material genético.</p><p>Isso facilita o processo de laboratório porque o material já está disponível para qPCR.</p><p>Considerações �nais</p><p>Vimos que a amplificação de DNA in vitro é feita pela reação em cadeia da polimerase, em que a variação cíclica de temperatura permite a</p><p>desnaturação, o anelamento e a extensão de sequências-alvo específicas, de acordo com aquelas que desejamos detectar. Como estudado, os</p><p>oligonucleotídeos iniciadores se ligam à fita simples de DNA que foi aberta por desnaturação por complementariedade entre as bases nitrogenadas.</p><p>Essas últimas são elementos fundamentais dos nucleotídeos por conterem a informação genética.</p><p>As variações da PCR são úteis de diferentes formas, e devemos conhecê-las</p>