RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA - MICROBIOLOGIA

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<p>Acadêmico(a): ANA CLARA KERKHOFF LISBOA</p><p>RA: 22013917-2</p><p>Série: 6ª SÉRIE</p><p>Turma: NOTURNO</p><p>Área: MICROBIOLOGIA APLICADA</p><p>Data:</p><p>Professor(a): JULIANA COGO</p><p>Atividade: RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA</p><p>Nota final:</p><p>TÍTULO DA AULA: PREPARO E ACONDICIONAMENTO DE VIDRARIAS</p><p>1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA SOBRE O TEMA</p><p>O preparo e acondicionamento de vidrarias em laboratório são essenciais para garantir precisão e segurança em análises. Isso envolve escolher vidro adequado, lavar com detergente neutro, enxaguar com água destilada, secar, armazenar longe de fontes de calor e produtos químicos, proteger contra poeira e contaminação, manusear com cuidado, inspecionar regularmente e descartar corretamente conforme as normas de segurança e regulamentos locais. Cumprir essas práticas ajuda a manter a qualidade e a integridade das vidrarias, contribuindo para resultados confiáveis em experimentos laboratoriais.</p><p>2. TÉCNICA UTILIZADA E FUNDAMENTOS DA TÉCNICA</p><p>Lavagem manual (lembre-se de usar luvas para realizar esse procedimento):</p><p>· Tubos de Ensaio: Após a descontaminação, descarte o conteúdo em lixo comum e lave os tubos com solução detergente a 0,5%, utilizando uma escova apropriada para remover todos os resíduos. Enxágue cada tubo 10 vezes em água corrente, enchendo e esvaziando completamente, e deixe-os de molho em água destilada por 1 hora.</p><p>· Placas de Petri: Após a descontaminação, descarte os conteúdos em lixo comum e lave separadamente as partes da placa (tampa e fundo) com uma bucha suave e detergente a 0,5%, removendo marcas de caneta com álcool 95°GL. Enxágue cada parte 10 vezes em água corrente, esfregando bem, e deixe as placas de molho em água destilada por 1 hora.</p><p>· Pipetas: Após a descontaminação, remova o tampão de algodão do bocal de cada pipeta e coloque-as em posição vertical, totalmente submersas em solução detergente a 0,5%, deixando de molho por 10 minutos. Lave as pipetas 10 vezes cada (por dentro e por fora) em um lavador de pipetas e deixe-as de molho em água destilada por 1 hora.</p><p>· Lavagem de Lâminas e Lamínulas: Para remover manchas, ferva as lâminas e lamínulas em solução de dicromato de potássio a 5% por 30 minutos, adicionando ácido sulfúrico concentrado a cada 5 a 10 minutos. Lave em água corrente por 12 horas, deixe em álcool 95°GL com algumas gotas de ácido clorídrico por uma semana, lave novamente em água corrente e deixe de molho em água destilada por 1 hora.</p><p>· Lavagem com Solução Sulfocrômica: Quando as vidrarias apresentarem manchas resistentes à lavagem com detergente, deixe-as de molho em solução sulfocrômica por 10 a 20 minutos, lave em água corrente 10 vezes e deixe de molho em água destilada por 1 hora.</p><p>3. RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO</p><p>O processo de preparo e acondicionamento de vidrarias é fundamental para garantir a qualidade e a confiabilidade dos experimentos laboratoriais. A adoção de práticas adequadas assegura que as vidrarias estejam em condições ideais para uso, contribuindo para a obtenção de resultados precisos e significativos em diversas áreas da ciência e da pesquisa.</p><p>TÍTULO DA AULA: TÉCNICAS DE COLORAÇÃO</p><p>1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA SOBRE O TEMA</p><p>As técnicas de coloração desempenham um papel fundamental na microbiologia, se destinam à observação de estruturas morfológicas como esporos, flagelos e morfologia celular, diferenciando microrganismos. Existem diversos métodos de coloração utilizados para a análise de bactérias. Entre estes, o mais utilizado é a coloração desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas sequências de coloração, com diferentes corantes, este método permite a divisão das bactérias em 2 grandes grupos: Gram-positivas e Gram-negativas devido às diferenças na parede celular.</p><p>2. TÉCNICA UTILIZADA E FUNDAMENTOS DA TÉCNICA</p><p>Coloração de GRAM</p><p>· Bactérias Gram-positivas, com suas múltiplas camadas de peptidoglicano e ausência de membrana lipoproteica externa, retêm o cristal violeta-lugol e adquirem uma coloração roxa.</p><p>· Bactérias Gram-negativas, possuindo paredes celulares com camadas finas de peptidoglicano e uma camada lipoproteica externa, não retêm o cristal violeta-lugol. Quando expostas a álcool, descoram e são coradas com fucsina, tornando-se rosa.</p><p>O método de coloração de Gram emprega quatro soluções, chamadas de Cristal violeta (corante principal) que é o primeiro corante aplicado sobre o esfregaço; Lugol (mordente), assim chamado pois fixa a cor do corante principal, formando o complexo ρ-rosanilina que é insolúvel; Álcool-cetona (agente diferenciador ou descorante), por se tratar de um solvente, dissolve a membrana citoplasmática das bactérias Gram negativas, devido à fina espessura do peptidoglicano que compõe suas paredes celulares; Fucsina (corante de fundo ou corante de contraste), que é utilizado para corar as bactérias Gram negativas que se tornaram incolores após o descoramento com álcool-cetona, diferenciando-as das bactérias Gram positivas que tomaram a coloração roxa ou azulada.</p><p>Essa diferenciação é crucial, já que esses grupos reagem de maneira diferente a diversos agentes físicos e químicos.</p><p>PROCEDIMENTO</p><p>· Realizar um esfregaço do material sobre a lâmina, secar à temperatura ambiente e fixá-lo pelo calor (em estufa ou Bico de Bunsen).</p><p>· Cobrir a lâmina com violeta de Genciana por 1 minuto.</p><p>· Lavar com água corrente e adicionar o lugol, deixando-o agir por 1 minuto.</p><p>· Com a torneira ligeiramente aberta, retirar todo o lugol e proceder a descoloração com o álcool - acetona (tempo crítico - aprox. 5 segundos), até que a coloração violeta não se desprenda mais da lâmina. Enxaguar imediatamente.</p><p>· Adicione a Fucsina de Ziehl para Gram por 20 segundos. Enxaguar e secar a lâmina. Proceder a microscopia em objetiva de 100 x (imersão).</p><p>Coloração de Ziehl-Neelsen: A coloração de Ziehl-Neelsen é uma técnica utilizada na microbiologia para a identificação de micro-organismos álcool-ácido resistentes, especialmente Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose. O método é baseado na habilidade desses micro-organismos em resistir à descoloração pelo ácido e pelo álcool.</p><p>Durante a coloração de Ziehl-Neelsen, os micro-organismos são inicialmente corados com fucsina básica e, em seguida, tratados com álcool-ácido para descoloração. No entanto, os micro-organismos álcool-ácido resistentes retêm a cor vermelha da fucsina, enquanto outros são descorados.</p><p>Essa técnica é fundamental para o diagnóstico da tuberculose, pois permite a visualização direta dos bacilos álcool-ácidos resistentes em amostras clínicas, como esfregaços de escarro, culturas e biópsias. É uma ferramenta essencial para o controle e monitoramento da doença, possibilitando o início precoce do tratamento e a prevenção da disseminação da infecção.</p><p>PROCEDIMENTO</p><p>· Cobrir a lâmina com fucsina de Ziehl por 05 minutos, aquecendo-a por duas vezes, durante este período, até a emissão de vapores;</p><p>· Descorar com álcool-ácido;</p><p>· Cobrir com azul de metileno por 02 minutos;</p><p>· Ler em objetiva de 100x (imersão), pelo menos 100 campos.</p><p>3. RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO</p><p>As colorações de Gram e Ziehl-Neelsen são técnicas fundamentais na microbiologia, fornecendo informações valiosas sobre a estrutura celular e a presença de micro-organismos específicos. A capacidade de diferenciar entre diferentes tipos de bactérias e identificar agentes patogênicos, como Mycobacterium tuberculosis, tem um papel crucial no diagnóstico e tratamento de doenças infecciosas. Essas técnicas são essenciais para a prática clínica e laboratorial, ajudando a orientar condutas terapêuticas e melhorar os resultados para os pacientes.</p><p>TÍTULO DA AULA: UROCULTURA</p><p>1. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA SOBRE O TEMA</p><p>A urocultura é um exame microbiológico utilizado para identificar e quantificar microrganismos presentes na urina, que podem ser responsáveis por infecções do trato urinário (ITU). As ITUs são condições comuns, que podem ocorrer em qualquer parte do sistema urinário, sendo mais frequentes em mulheres. A urocultura é essencial para o diagnóstico correto e para a orientação do tratamento antimicrobiano.</p><p>2. TÉCNICA UTILIZADA E FUNDAMENTOS DA TÉCNICA</p><p>Para a realização da urocultura, utilizamos os seguintes materiais e técnicas:</p><p>· Placas Utilizadas:</p><p>· Biplaca de Cled/MacConkey (15 x 100 mm): A placa de Cled (Cystine-Lactose-Electrolyte-Deficient) é usada para o isolamento de microrganismos comuns em ITUs e para diferenciar bactérias fermentadoras e não fermentadoras de lactose. O ágar MacConkey é seletivo para bacilos Gram-negativos e também diferencia fermentadores de lactose.</p><p>· Placa de Chromagar: Esta placa contém substratos cromogênicos que reagem com enzimas bacterianas específicas, produzindo colônias de cores distintas, facilitando a identificação de diferentes patógenos.</p><p>· Alça Calibrada 10 µL Descartável: Utilizada para a inoculação precisa de uma quantidade padronizada de urina (10 µL) na superfície das placas de cultura, garantindo resultados quantitativos.</p><p>· Estufa Microbiológica: As placas foram incubadas a 35-37°C por 24 horas, que é a temperatura ideal para o crescimento de microrganismos patogênicos urinários.</p><p>· Microscópio Ótico: Utilizado para a observação de colônias e avaliação morfológica inicial, se necessário.</p><p>· Bico de Bunsen: Empregado para a esterilização da alça e do ambiente próximo à bancada de trabalho, garantindo condições assépticas durante a inoculação.</p><p>Tipo de Amostra: Urina colhida por micção (jato intermediário), punção supra-púbica, cateterização ou de sonda uretral.</p><p>1. Homogeneizar cuidadosamente a amostras com movimentos circulares.</p><p>2. Após a homogeneização da amostra, utilizando a alça de 10 ul realizar o semeio em cada uma das placas utilizando a técnica de estria por esgotamento cruzado.</p><p>3. Após o semeio, incubar as placas semeadas por 18-24 horas a 35°C.</p><p>4. Decorrido este tempo analisar as características das colônias no meio de cultura e proceder a identificação.</p><p>3. RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO</p><p>Após 24 horas de incubação, as placas não apresentaram crescimento de unidades formadoras de colônia (UFC). A ausência de UFC indica que não houve crescimento bacteriano significativo na amostra de urina analisada, sugerindo que a amostra estava estéril ou que o número de microrganismos presentes era inferior ao limite de detecção da técnica utilizada, como também sugere que o paciente provavelmente não possui uma infecção urinária ativa. Entretanto, é importante considerar fatores como a qualidade da coleta da amostra, o transporte adequado, e o possível uso prévio de antibióticos, que poderiam influenciar nos resultados.</p><p>TÍTULO DA AULA: IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA DE ENTEROBACTÉRIAS</p><p>1. OBJETIVO:</p><p>Realizar identificação bioquímica de enterobactérias utilizando o kit para enterobactérias.</p><p>4. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA SOBRE O TEMA</p><p>A identificação de bacilos Gram-negativos (BGN) fermentadores de glicose, como as enterobactérias, baseia-se em características fenotípicas, principalmente na presença de enzimas específicas codificadas no cromossomo bacteriano. Essas enzimas regulam o metabolismo bacteriano e podem ser bloqueadas em meios de cultura com substratos específicos e sistemas indicadores que revelam a atividade enzimática. Após o isolamento preliminar em meios seletivos, as provas bioquímicas verificam as reações metabólicas e permitem identificar os BGN oxidase-negativos da família Enterobacteriaceae a nível de gênero e espécie.</p><p>5. TÉCNICA UTILIZADA E FUNDAMENTOS DA TÉCNICA</p><p>O kit fornece leituras das seguintes provas bioquímicas:</p><p>- desaminação do L-Triptofano (LTD) ou Triptofano-Desaminase (TRI)</p><p>- produção de gás sulfídrico (H2S)</p><p>- fermentação da glicose (GLI)</p><p>- produção de gás a partir da glicose (GAS)</p><p>- descarboxilação da L-Lisina (LIS)</p><p>- produção de Indol (IND)</p><p>- descarboxilação da Ornitina (ORN)</p><p>- Motilidade (MOT)</p><p>- utilização do citrato como única fonte de Carbono (CIT)</p><p>- fermentação da Rhamnose (RHA)</p><p>OBS.: A prova da Lactose (LAC) é verificada nos meios de isolamento primário(p.ex. CLED ou MacConkey).</p><p>Para a realização das provas bioquímicas, há a necessidade de se usar meios de cultivos especiais contendo substrato a ser ensaiado e fornecer ao microorganismo as condições ambientais para o seu desenvolvimento.</p><p>Materiais:</p><p>· Conjunto de tubos para enterobactérias (meio EPM, caldo lisina, meio de MIO, ágar citrato de Simmons e caldo Rhamnose)</p><p>· Agulha bacteriológica</p><p>· Fita teste para oxidase</p><p>· Salina estéril</p><p>· Pipeta pasteur estéril ou equivalente</p><p>· Lâmina</p><p>· Reativo de Kovacs</p><p>Equipamentos:</p><p>· Microscópio ótico;</p><p>· Bico de Bunsen;</p><p>Estabilidade e Armazenamento dos meios de cultura:</p><p>Estável entre 2 a 8°C por até 06 meses.</p><p>Tipo de Amostra: Colônias de BGN oxidase negativas isoladas de amostras biológicas, de preferência em meios seletivos para bactérias Gram-negativas (p. ex.: MacConkey).</p><p>Usar colônias recém-isoladas (menos de 24h).</p><p>PROCEDIMENTO</p><p>Procedimento para Testes Bioquímicos</p><p>Para realizar as provas bioquímicas em colônias de bactérias Gram-negativas (BGN) oxidase negativas, eu comecei pela verificação da prova da oxidase. Usei uma alça de platina para transferir uma porção da bactéria para a tira reativa e observei a coloração púrpura intensa em até 20 segundos. Se a prova foi positiva, inoculei os meios para não fermentadores de glicose.</p><p>Inoculação:</p><p>1. Com uma agulha bacteriológica, toquei uma colônia bem isolada e inoculei o tubo 1 (Meio EPM) com uma picada central única, estriando a superfície do meio. Deixei a tampa frouxa.</p><p>2. Sem flambar a agulha, inoculei o tubo 2 (lisina) por dissolução e adicionei 1 mL de vaselina estéril, fechando bem a tampa.</p><p>3. Inoculei o tubo 3 (meio de MIO) com uma picada central única, deixando a tampa frouxa.</p><p>4. Recolhi a outra metade da colônia e inoculei o tubo 5 (citrato) por dissolução, adicionando 1 mL de vaselina estéril e fechando bem.</p><p>5. Para o tubo 4 (Rhamnose), fiz uma estriação leve da superfície. Adição de vaselina no final. Deixei a tampa frouxa.</p><p>Depois, incubei todos os tubos e a placa a 37 °C por 18 a 24 horas. Após a incubação, coloquei 1 gota do reativo de Kovacs no tubo 3 (Meio de MIO) e observei a coloração. Por fim, analisei os resultados e consultei o programa da NewProv para identificar o gênero e a espécie da bactéria.</p><p>6. RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO</p><p>Leitura das provas bioquímicas:</p><p>TUBO 1</p><p>MEIO DE EPM (ÁGAR INCLINADO VERDE</p><p>Desaminação do L-triptofano (LTD)</p><p>Negativo: O meio permaneceu na cor original no ápice tubo (verde-azulado)</p><p>Fermentação da glicose (GLI)</p><p>Positivo: O fundo do tubo teve alteração de cor para amarelo.</p><p>Produção de gás a partir da glicose (GAS)</p><p>Positivo: Houve ruptura do meio de cultura.</p><p>Produção de gás sulfídrico (H2S)</p><p>Negativo: Ausência de coloração negra no meio.</p><p>TUBO 2</p><p>CALDO LISINA (caldo púrpura)</p><p>Descarboxilação da L-Lisina (LIS)</p><p>Positivo: Observação de coloração púrpura.</p><p>TUBO 3</p><p>MEIO DE MIO (meio semi-sólido púrpura)</p><p>Motilidade (MOT)</p><p>Positivo: Motilidade observada pela turvação ao redor da picada central.</p><p>Produção de Indol (IND)</p><p>Positivo: Formação de um anel na coloração vermelho/rosa.</p><p>Descarboxilação da Ornitina (ORN)</p><p>Positivo: A coloração permaneceu púrpura</p><p>TUBO 4</p><p>ÁGAR CITRATO DE SIMMONS (ágar inclinado verde)</p><p>Utilização do citrato como única fonte de carbono (CIT)</p><p>Negativo: Ausência de crescimento e permanência da cor original do meio.</p><p>TUBO 5</p><p>CALDO RHAMNOSE (caldo verde-claro)</p><p>Fermentação da Rhamnose (RHA)</p><p>Positivo: Observação de coloração amarela com turvação do meio</p><p>FOTOS</p><p>MEIO EPM</p><p>CALDO LISINA</p><p>MEIO MIO</p><p>MEIO DE CITRATO</p><p>CALDO RHAMNOSE</p><p>PLACA MACCONKEY</p><p>image1.jpg</p><p>image4.jpg</p><p>image6.jpg</p><p>image3.png</p><p>image2.jpg</p><p>image7.jpg</p><p>image5.jpg</p>