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PCR - Reação em Cadeia da Polimerase

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7. PCR - Uma técnica de mil e uma utilidades
Esta aula é bastante longa. Por isso optamos por construir internamente links para
seus diversos temas, tabelados abaixo. Basta clicar sobre o tema de interesse.
Sinopse da aula
Primeiros passos - Introdução ao PCR
RAPD - uma PCR com um primer só...e amplificando
qualquer DNA!
PCR na investigação de Paternidade
PCR na investigação de crimes
PCR no diagnóstico de enfermidades genéticas
PCR em tempo real - o sistema Taqman
Um pouco de história
Artigos importantes sobre PCR
Link para a aula de PCR da disciplina Técnicas Moleculares na
Biologia
 
7.1 Primeiros passos
Ainda na década de 60 muitos pesquisadores procuraram obter a síntese de DNA
in vitro. É evidente que obter DNA em tubo de ensaio é o primeiro passo para um
universo de experimentos em genética molecular. O primeiro a conseguir caminhar
neste sentido foi Arthur Kornberg, de quem já falamos na aula sobre replicação do
DNA. Era natural, já que Kornberg era um profundo conhecedor das DNA
polimerases. A síntese de um DNA viral in vitro foi recebida com entusiasmo por
todos, inclusive a imprensa leiga, que qualificou o feito como a criação da vida em
laboratório. Esta metáfora tem sido usada pela imprensa com insistência em
várias ocasiões, sempre que se trata de manipular o DNA de um ser vivo, e em
geral provoca mal estar entre os pesquisadores, o que foi o caso de Arthur
Kornberg.
Em 1983, Kary Mullis, então pesquisador empregado na Cetus Corporation, EUA,
imaginou uma forma de fazer com que a DNA polimerase iniciasse e terminasse
seu trabalho em trechos pré-determinados do DNA. Com o sistema seria possível
amplificar milhões de vezes um pequeno trecho de um longo segmento de DNA. A
idéia foi aprimorada na Cetus e apresentada pela primeira vez em 1985, numa
conferência. Depois disso a técnica, conhecida como PCR, ganhou quase
instantaneamente uma aceitação mundial e em menos de uma década tornou-se o
procedimento básico de todo laboratório de genética molecular no mundo.
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Mas, afinal, o que é a PCR?
A sigla significa "polymerase chain reaction", que em português seria reação em
cadeia da polimerase. Então, a base da técnica é a ação in vitro da DNA
´polimerase. Para compreendermos como funciona a técnica, que é na verdade
bem simples, precisamos recordar que, para iniciar a síntese de uma fita nova, a
DNA polimerase precisa de um primer (de RNA ou de DNA), de um DNA molde e
de precursores de síntese de DNA, coletivamente chamados dNTPs
(desoxinucleotídeos tri-fostato, i.e., dATP, dTTP, dCTP e TGTP).
A idéia de Mullis era simples. Adicionava-se ao tubo de ensaio um pouco de DNA
contendo o trecho que queria amplificar, os dNTPs, a DNA pol e dois primers de
DNA feitos em laboratório, um hibridizando numa fita e "apontando" para o outro,
que hibridizava com a outra fita e "apontava" para o primeiro. A distância entre os
sítios de pareamento dos dois primers não podia ser muito grande, e foram
escolhidos para testes trechos com menos de 1000 pb. Com todos os reagentes
no tubo, a reação era inicialmente aquecida a 94 oC, para que todas as fitas de
DNA se desnaturassem. Em seguida a temperatura era reduzida para permitir o
pareamento dos primers, em geral para 50 oC. Por fim, a temperatura era reduzida
ainda mais, até 37 oC, para que a DNA polimerase de E. coli pudesse trabalhar e
estender duas fitas simples de DNA, uma a partir de cada primer, duplicando,
assim, a sequência alvo escolhida. Ao se repetir o ciclo os primers encontrariam
agora dois alvos cada um, a partir do primeiro alvo replicado: um no DNA original
e outro na cópia recém sintetizada, gerando, por sua vez, ao fim do novo ciclo, 4
cópias do alvo. É claro que a repetição do processo geraria um número de cópias
do alvo que se elevaria exponencialmente, com base 2.
Na verdade, a coisa não foi tão fácil assim: a DNA pol era termoinstável (como a
maioria das proteínas dos seres vivos) e se inativava irreversivelmente a 94 oC.
Era preciso adicionar mais DNApol no tubo a cada ciclo de extensão. Além disso,
a baixa temperatura de funcionamento da DNApol de E. coli propiciava o
aparecimento de pareamentos espúrios (sem sentido, errôneos) no sistema,
gerando ao final produtos de PCR inesperados.
A solução foi encontrada logo: a DNA pol de E. coli foi substituída por uma DNA
polimerase de um microrganismo termo-tolerante, o Thermus aquaticus. A enzima
foi batizada de Taq polimerase e permitiu, finalmente, que o PCR se tornasse uma
ferramenta extraordinariamente útil na genética molecular. Que propriedades têm
a Taq polimerase que a fazem tão útil? Ela é termoestável e sua temperatura
ótima de funcionamento é 72 oC. Com isto três problemas ficaram
automaticamente resolvidos:
a) não havia mais necessidade de adicionar enzima no tubo a cada ciclo.
b) a menor temperatura do ciclo era a de hibridização, que podia ser mantida
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acima de 50 oC, evitando hibridizações espúrias.
c) o DNA molde não se renaturava por completo, permitindo uma rápida
desnaturação ao se iniciar um novo ciclo.
Adicionalmente, a manutenção do tubo fechado evitava contaminação do material
do laboratório e dos estoques de reagentes com os amplicons, nome genérico
dado aos produtos de amplificação da PCR. É claro que um amplicon gerado com
um par de primers qualquer serve perfeitamente de molde para uma nova reação
de PCR com os mesmos primers. A contaminação de reagentes e pipetas com
amplicons continua sendo um problema para todos que trabalham com PCR. 
Os eventos ligados às três temperaturas que mencionamos, 94 oC, 50 oC e 72 oC,
estão esquematizados na figura abaixo. Observe que, a 94 oC, os primers e as
fitas simples de DNA alvo estão misturados, mas não podem parear. Quando a
temperatura é reduzida os primers rapidamente alcançam seus sítios de
complementariedade, pois são moléculas pequenas e, portanto, muito móveis, e
porque estão em concentração muito mais elevada que o DNA alvo. O DNA molde
tende a renaturar, mas logo a temperatura é novamente elevada para 72 oC, que
permite a extensão das novas fitas a partir dos primers, sem desparear os primers
outra vez. Por fim, a temperatura volta a 94 oC, que desnatura todas as fitas,
inclusive as recém sintetizadas, recomeçando o processo.
Figura 7.1 Eventos relacionados às três temperaturas básicas da PCR: Desnaturação a 94
oC, pareamento dos primers a 50 oC e extensão de novas fitas a 72 oC, supondo neste caso
que a enzima empregada seja a Taq polimerase ou outra DNA polimerase termo-estável.
 
O processo descrito acima gera dois tipos de fitas simples: uma de comprimento
variável, obtida a partir de um primer que tenha hibridizado com a fita de DNA
original (em geral um longo fragmento de DNA obtido diretamente de um ser vivo
ou de um vírus ou plasmídeo), e outra, de comprimento determinado, que é obtida
sempre que um DNA previamente copiado é empregado como molde em sua
síntese.
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Esta situação está claramente representada na figura abaixo, que mostra os três
primeiros ciclos de uma PCR. Observe que a fita estendida a partir de um primer
hibridizado com o DNA molde original não tem comprimento fixo, porque o molde é
muito longo. Seu comprimento final vai ser determinado pelo instante em que o
primer hibridizar com o sítio de complementariedade e pela tempo de extensão
total, à temperatura de 72 oC. As duas primeiras fitas estendidas estão indicadas
com a letra e à sua direita. Já as fitas que são produzidas a partir de primers que
hibridizaram em fitas previamente copiadas têm fatalmente ser comprimento
definido, já que inicia, no primer e terminam ao fim do DNA molde, que é
exatamentea e extremidade 5´do primer já incorporado na fita molde. As fitas de
comprimento definido aumentam de número exponencialmente, formando aos
poucos um imenso número d fita duplas de comprimento definido, enquanto as
fitas estendidas aumento linearmente (duas a cada ciclo, por alvo). Uma inspeção
da figura a seguir esclarecerá o leitor sobre esta questão.
Figura 7.2 Produção de novas fitas a partir de um DNA alvo pela PCR. Após hibridização dos
primers a 56 oC, as fitas novas são sintetizadas a 72 oC, dando origem a fragmentos
estendidos (indicados no primeiro ciclo pela letra e) e fragmentos amplificados (contornados
em amarelo). Os fragmentos amplificados acumulam exponencialmente na reação.
A visualização dos produtos de uma reação de PCR costuma ser feita através do
uso da eletroforese em gel. Pode-se usar um gel de poliacrilamida, que corre
verticalmente, e corar as bandas de DNA com nitrato de prata ou se pode optar
por correr um gel horizontal de agarose e visualizar as bandas por transiluminação
UV, "corando" previamente o DNA com brometo de etídio (esta substância se
intercala entre as fitas de DNA e nestas condições absorve o UV e fluoresce com
cor alaranjada). O produto de PCR será sempre um DNA fita dupla e o que
distingue um do outro, no gel, será apenas o comprimento relativo. Esta situação
está representada no esquema da figura seguinte.
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Figura 7.3 Visualização de três reações de PCR. Em a e b dois produtos são gerados, a
partir de dois pares de primers diferentes. Os dois produtos têm comprimentos de 400 e 360
pb. A migração das bandas na eletroforese é de cima para baixo. O fragmento menor migra
mais rápido e produz a banda em vermelho. O maior se desloca mais lentamente no gel e
produz a banda em verde. A coluna c é um controle negativo, essencial em qualquer reação de
PCR. A coluna d mostra os marcadores de peso molecular (neste caso, uma escada de DNA -
DNA ladder - de 100 pb). Na transiluminação ou na coloração por prata, evidentemente, todas
as bandas têm a mesma cor.
Quando fazemos um PCR, a prática aconselha a deixar o tubo com os reagentes
por 5 a 10 minutos a 94 oC antes de iniciar o ciclo. Em geral 1 minuto a cda
temperatura é suficiente para as etapas do ciclo, que é repetido de 35 a 40 vezes.
Por fim, ao terminar a última extensão muitas vezes os protocolos experimentais
sugerem a manutenção da temperatura de 72 oC por mais 5 a 10 minutos. A
opção de esperar 10 minutos antes de começar o ciclo, mantendo o tubo
aquecido, garante que todo o DNA alvo esteja desnaturado antes de se iniciar o
ciclo. Por outro lado, o período final a 72 oC garante que todas as fitas terão o
mesmo comprimento pois pode acontecer que, durante o ciclo, algumas fitas
copiadas não tenham atingido o fim do molde. A figura a seguir sintetiza o ciclo da
PCR.
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Figura 7.4. Ciclo padrão de uma PCR. Antes de iniciar o ciclo o tubo com os reagentes é
mantido a 94 oC para garantir a desnaturação inicial de todo DNA alvo. Da mesma forma, ao
terminar o ciclo, a manutenção do tubo a 72 oC garante que todos as fitas tenham exatamente
o mesmo número de bases.
 
Quando PCRs são realizadas, gerando produtos de diferentes comprimentos, e
estes produtos são analisados por transiluminação UV em gel de agarose, o
resultado que se obtém pode ser semelhante ao mostrado abaixo. O menor dos
produtos migra mais rápido e gera a banda mais em baixo no gel. Em geral o gel
de agarose separa bem fragmentos entre 150 pb e 1000 pb. Fora desta faixa pode
ser necessário usar um gel de poliacrilamida.
Figura 7.5 Imagem obtida de um gel de agarose mostrando bandas correspondentes a
produtos de PCR com diferentes comprimentos (número total de pares de bases) (colunas 2 a
5). Na coluna 1 estão os marcadores de peso molecular, fragmentos de DNA fita dupla de
comprimento conhecido, obtidos por digestão por enzima de restrição de um DNA conhecido
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ou sintetizados por máquinas. A coluna 6 é um controle negativo e a pequena banda difusa no
fim do gel é apenas a fronteira da eletroforese.
Nos dias de hoje uma PCR é feita numa máquina chamada termociclador. É
simplesmente um bloco aquecido, controlado por um sistema digital, que eleva e
abaixa a temperatura do material nele inserido (tubos de ensaio pequenos, micro-
placas de 96 poços, etc), de acordo com a programação digitada pelo operador.
Mais de duas décadas foram necessárias para que estas máquinas pudessem
atingir um grau de precisão e confiabilidade aceitáveis, aliado a um preço
razoável. Também os reagentes para PCR reduziram de preço consideravelmente
na última década, tornando o método comercialmente atrativo. Uma reação de
PCR pode, agora, ser feita por US$ 1,00.
Além do cuidado com a contaminação de amplicons, a PCR exige atenção em
vários outros detalhes. Um deles diz respeito ao pareamento dos primers: a última
base da extremidade 3´ do primer tem que estar corretamente pareada com o DNA
alvo, sem o que não ocorrerá amplificação. No restante do primer a necessidade
de um pareamento exato não existe e, na extremidade 5´podemos até mesmo
adicionar um segmento fita simples que não vai parear com o DNA alvo. Este
ressalto (overhang) não atrapalha em nada a reação e pode adicionar
propriedades importantes ao nosso amplicon final. Vejam um exemplo disso na
construção da biblioteca de cDNA na aula 6!
Outro ponto importante é a questão dos erros na sequência devido à tautomeria
de bases. A Taq polimerase não faz revisão (proof reading) in vitro. Se, ao copiar
pela primeira vez o DNA alvo, ela introduzir uma base errada numa das duas fitas,
25% do produto final estará com sua sequência diferente nesta base. As
consequências deste erro podem ser trágicas se estamos procurando fazer um
diagnóstico genético (veja item correspondente). Para evitar isto todos os testes
são feitos em duplicata. A idéia é que a probabilidade da Taq polimerase "errar"
nas duas reações sempre na primeira extensão é muito reduzida e se um
resultado conflitante surgir, fica claro que num dos tubos a Taq "errou". Se o
"erro" for cometido depois do terceiro ciclo ele já se torna praticamente
imperceptível, pois uma pequena porcentagem das fitas terá erro e não será
possível detectá-lo facilmente.
Seria ideal que pudéssemos disponibilizar em Downloads um relato de Mullis
sobre o PCR a partir da sua apresentação na Academia Nobel. Entretanto, não há
na página da Academia Sueca que coordena o Nobel (http://www.nobel.se) as
palestras de Kary Mullis e Michael Smith. Uma apresentação on-line dos trabalhos
dos dois laureados Nobel em Química, do ano de 1993 está disponível: Michael
Smith (pelo aperfeiçoamento da tecnologia da mutação sítio-dirigida) e Kary B.
Mullis (pela invenção da PCR).
 http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/illpres/index.html
 
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7.2. RAPD - uma PCR com um primer só...e amplificando qualquer DNA!
Uma limitação séria na PCR convencional é a necessidade de se conhecer
previamente a sequência que se quer amplificar ou, pelo menos, suas
extremidades, para que se possa sintetizar os primers a elas complementares. Se,
contudo, baixarmos a temperatura de hibridização (pareamento) para menos de 45
oC, poderemos fazer com que os primers hibridizem com baixa especificidade em
muitos sítios do DNA. Em verdade, não precisamos sequer de dois primers, basta
um.
Uma PCR feita com um só primer e empregando uma temperatura de hibridização
(pareamento ou annealing) de 45 oC ou inferior gera, muitas vezes, um número
considerável de bandas em muitos diferentes DNAs, através do pareamento com
baixa estringência do primer (em geral ele também, pequeno, com 10 a 15 bases,
o que facilita os pareamentos). O curioso é que, se repetirmos o experimento nas
mesmas condições experimentais, obteremos as mesmasbandas mais uma vez.
As bandas, então, não são uma amplificação completamente aleatória de trechos
de DNA, mas sim de trechos flanqueados por sequências que pareiam com o
primer com baixa estringência, o que é muito diferente. Apesar disso, a técnica de
PCR descrita aqui ganhou o nome de RAPD: de fato é rápida, mas o nome -
randomly amplified polymorphic DNA - DNA polimórfico amplificado aleatoriamente
- dá margem a certa confusão. Se, por um lado, o pareamento não é aleatório
completamente, por outro a existência das sequências com homologia é de fato
aleatória, pois não sabemos de antemão se um DNA terá regiões com
complementariedade para o primer escolhido.
A figura abaixo mostra esquematicamente o resultado de um RAPD. Observe que
as bandas coloridas podem ser amplificadas de cromossomas diferentes ou do
mesmo cromossoma, mas os primers que as flanqueiam (e a todas as demais
bandas) são sempre os mesmos.
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Fig. 7.6a Representação esquemática do resultado de um RAPD empregando DNA extraído
de indivíduos de três populações distintas de insetos (a,b,c), (d,e) e (f,g,h). Os indivíduos i e j
não tinham origem determinada e poderiam pertencer a qualquer um dos três grupos. A
semelhança do padrão de bandas com o primeiro grupo sugere a origem. Na parte de baixo
da figura uma representação esquemática dos sítios de pareamento que geram as bandas
representadas em vermelho, azul e amarelo.
 
Idealmente um RAPD deve gerar um número de bandas superior a 4, e estas
bandas devem ser polimórficas (isto é, com diferentes migrações) para indivíduos
diferentes, ao menos entr grupos distintos. Isto, contudo, nem sempre ocorre.
Ainda assim, o RAPD é uma técnica extremamente poderosa porque os
marcadores são bastante polimórficos e porque se pode testar um grande número
de primers em cada situação. Além disso a técnica é rápida e de baixo custo. A
figura a seguir mostra o resultado de um experimento real do Gentrop/ UFPE, no
contexto do trabalho desenvolvido pelo nosso colega Valdir Balbino. DNA de
diferentes exemplares de Lutzomyia longipalpis, o vetor da leishmaniose visceral
nas Américas, foi empregado em reações de RAPD. Os exemplares provieram de
uma mesma localidade. Pode-se observar o acentuado polimorfismo destes
marcadores.
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Fig7.6b RAPD obtido de exemplares de Lutzomyia longipalpis, inseto vetor da leishmaniose
visceral. Todos os exemplares foram capturados no município de Calumbi, PE, a a
amplificação feita com o primer OPP-04 (cortesia Valdir de Queiroz Balbino). A primeira
coluna à esquerda é a escada de DNA de 100 pb. A terceira banda mais forte, de cima para
baixo, corresponde a 600 pb.
O RAPD permite não apenas discriminar entre populações diferentes de
organismos, mas inferir sua correlação filogenética. A técnica tem, contudo, suas
limitações, sendo a mais grave a dificuldade em reproduzir exatamente os mesmos
resultados de um laboratório para outro.
 
7.3. PCR na investigação de Paternidade
Uma das aplicações mais conhecidas da PCR é a investigação de paternidade.
Técnicas bioquímicas ou moleculares (voltadas ao DNA) já existiam muito antes
da descoberta da PCR, mas foi com o desenvolvimento de sistemas diagnósticos
baseados em PCR que a investigação de paternidade alcançou o mercado com
mais abrangência, pela redução dos custos do exame e democratização dos
reagentes (pode-se realizar o teste sem pagar royalties).
Para se compreender como funciona a técnica precisamos recordar um pouco a
organização do genoma humano ( e de muitos outros organismos complexos).
Apenas 3% do nosso genoma é composto de genes. Há, ao contrário, uma
enorme parte dele composta de repetições mais ou menos longas, conforme o
caso. Não sabemos ainda porque isto ocorre, mas estas repetições podem ser
usadas vantajosamente como marcadores moleculares em muitos casos. Como
não são genes, não estão sob uma pressão seletiva tão grande e mostram muito
mais variação do que as sequências de genes propriamente ditas.
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Dentre as regiões repetidas a investigação de paternidade por PCR costuma
empregar uma classe de repetições conhecidas como STR - small tandem
repeats ou pequenas repetições em tandem. São pequenas regiões de DNA com
um número variável de repetições de 3 ou 4 nucleotídeos cada, flanqueadas por
regiões conservadas. Um esquema simplificado de um STR está mostrado na
figura abaixo. Como os seres humanos e os demais mamíferos são diplóides,
cada região de um cromossomo (exceto nos machos o par XY) está presente no
outro. Elas não precisam, contudo, ser exatamente iguais. Na representação da
figura abaixo chamamos alelos as duas rgiões homólogas nos dois cromossomos,
por analogia ao que fazemos com genes, embora os STRs não sejam genes.
Observe que as regiões repetidas estão flanqueadas por regiões conservadas
que se estendem à esquerda (5´) e à direita (3´) das repetições. Para qualquer ser
humano estas regiões conservadas são as mesmas, mas cada um de nós pode
ter um número diferente de repetições em cada alelo. Quanto maior o conjunto de
diferentes repetições maior será a informação colhida pela realização da análise
da região. Assim, se o número de repetições para o caso estudado (cada caso é
chamado sistema e em geral empregam-se 8 a 16 sistemas, cada um lançando
mão de um STR de um cromossoma diferente) varia, digamos, de 3 a 15, haveria
12 possibilidades em cada alelo. Apenas como exercício, se a probabilidade na
natureza fosse a mesma para qualquer uma das repetições (i.e., a frequência
alélica fosse a mesma), a probabilidade de um indivíduo qualquer ter o arranjo de
4 e 9 repetições mostrado abaixo seria 1/12 x 1/12 = 1/ 144.
Fig 7.7 Representação esquemática de um STR e sua amplificação por PCR, através de
primers dirigidos às regiões flanqueadoras conservadas. Os dois produtos gerados tem
comprimentos diferentes pois a parte interna da sequência difere de um alelo para o outro.
Quando o sistema acima é analisado em gel de agarose, duas bandas serão
visíveis se o indivíduo for heterozigoto para aquele STR. No caso de investigação
de paternidade, o filho de um casal deve herdar um cromossoma do pai e outro da
mãe. Isto que dizer que, para um sistema qualquer, o filho terá um STR (e uma
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banda) materno e outro paterno. A figura abaixo retrata a situação onde um casal
avalia a paternidade de dois meninos. O primeiro (Fo.1) tem claramente uma
banda de origem materna e a segunda banda está na mesma altura da banda
paterna. Portanto, o marido não pode ser excluído de ser o pai. No segundo caso,
contudo, a criança tem uma banda materna mas nenhuma que corresponda a
alguma banda paterna. Esta situação exclui o marido de ser pai do segundo filho
(Fo. 2).
Fig. 7.8 Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de
STR para investigação de paternidade. A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão,
equivalentes aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3, 4 e 5 mostram o resultado
da amplificação de um sistema para o suposto pai, a mãe e dois filhos. A banda materna de
cada filho está indicada e a banda paterna de um deles está contornada com uma elipse. O
teste exclui o suposto pai da paternidade do segundo filho.
A inclusão obrigatória da mãe em testes de paternidade evita que uma eventual
troca de recém-nascido na maternidade possa confundir os resultados. O mesmo
processo descrito acima pode ser empregado em qualquer animal que tenha
reprodução sexuada. É preciso apenas identificar os STRs candidatos e avaliar
criteriosamente a distribuição dos alelos na população em estudo. Para os seres
humanos os alelos estão distribuídos igualmente em todas as populações do
globo, mas em bovinos, por exemplo, devido ao cruzamento controlado pelo
produtor, os STRs estão distribuídos de formamuito diferente de uma raça para
outra. Ainda assim, a avaliação de pedigree em animais de raça é um campo
crescente de aplicação desta tecnologia.
Apenas como lembrete: os STRs não são os únicos alvos possíveis para
investigação de paternidade via DNA. Além disso, a investigação bioquímica e
genética de paternidade já era um método bem estabelecido muito antes da
invenção do PCR. Sugerimos que o leitor mais interessado procure informações
na internet para complementar esta questão.
 
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7.4. PCR na investigação de crimes
Outro campo fértil para o uso da PCR é a criminalística. A possibilidade de
amplificar um pequeno trecho de DNA milhões de vezes permite, em muitos casos,
amplificar de uma pequena amostra biológica (mancha de sangue, bulbo de
cabelo, fragmentos de pele), mesmo em um estado de conservação, suficiente
DNA para uma análise de STRs como a descrita acima. Um caso clássico é a
investigação da procedência de uma mancha de sangue no casaco da vítima (ou
resto de pele sob as unhas da vítima). Supondo, para fins deste exemplo, que o
material não contivesse restos de células da própria vítima, o procedimento para
análise do caso estaria em conformidade com o mostrado na figura abaixo.
Observe que, neste caso, cada suspeito aparece, para cada sistema com duas
bandas (aparecerá apenas uma se o indivíduo for "homozigoto" para aquele STR).
Na amostra as duas bandas do suspeito 2 estão claramente visíveis. O suspeito
um tem apenas uma banda, a outra portanto o exclui de ser a fonte da amostra. O
teste exclui dois indivíduos, mas não prova, como na paternidade, que o outro é o
"dono" da amostra. A inclusão do resultado de 5 a 8 sistemas eleva a
probabilbidade de não exclusão (como no caso de paternidade) para
99,99999999%. Isto quer dizer que não podemos excluir o suspeito dois com uma
margem de acerto de 99,99999999%.
 
Fig. 7.9 Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de
STR para investigação criminal. Três suspeitos estão sendo investigados e uma amostra de
sangue está disponível. A primeira coluna tem marcadores alélicos padrão, equivalentes aos
marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3 e 4 mostram o resultado da amplificação de
um sistema para os possíveis criminosos. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema
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para a amostra. O padrão de duas bandas é idêntico ao do suspeito 2 e exclui os demais.
Os casos de estupro, em geral, trazem uma complicação adicional: o material
colhido na vítima (por exemplo, esperma do criminoso) está misturado com o DNA
da vítima (e com muito DNA contaminante não humano, da flora vaginal). Nestes
casos o DNA dos suspeitos é sempre misturado com o DNA das vítimas antes da
amplificação dos STRs. O resultado é feito por comparação do padrão de 4
bandas das misturas de DNA, uma a uma, de suspeito + vítima, com o padrão
obtido da amostra colhida da vítima no corpo de delito. A figura abaixo ilustra este
caso.
Fig. 7.10 Representação esquemática de um gel representando o resultado de um sistema de
STR para investigação criminal. Três suspeitos estão sendo investigados num caso de
estupor e uma amostra de sangue está disponível. A primeira coluna tem marcadores alélicos
padrão, equivalentes aos marcadores de peso molecular. As colunas 2, 3 e 4 mostram o
resultado da amplificação de um sistema para os possíveis criminosos, sempre em mistura
com o DNA da vítima.. A coluna 5 mostra o resultado do mesmo sistema para a amostra
colhida no corpo de delito que, supostamente contendo DNA da vítima e do criminoso. A
última coluna da direita é a amplificação apenas do DNA da vítima. O padrão de quatro
bandas da amostra é idêntico ao do suspeito 3 e exclui os demais.
As aplicações forenses (na justiça) da PCR são ilimitadas, mas não há espaço
aqui para maior detalhamento.
 
7.5. PCR no diagnóstico de enfermidades genéticas e na identificação de
portadores sãos de alelos mutantes.
Doenças genéticas podem, algumas vezes, ser difíceis de diagnosticar.
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Adicionalmente, no aconselhamento genético de casais é importante determinar
inequivocamente se um indivíduo é portador de um alelo mutante (portador são). A
identificação de mutações em genes pode ser feita também por PCR, em geral
com a manipulação posterior do produto de amplificação. A seguir exemplificamos
duas destas aplicações. Numa delas o nucleotídeo mutado faz parte de um sítio
de restrição (se você lembrar que são mais de 600 as enzimas de restrição, cada
uma com seu próprio sítio, não será muito difícil encontrar uma que corte um sítio
incluindo o nucleotídeo em estudo). Na outra um artifício permite detectar
qualquer nucleotídeo mutado, faça ele parte de um sítio de restrição ou não.
A figura abaixo ilustra o caso em que o sítio de restrição para EcoRI, GAATTC,
inclui um nucleotídeo que está frequentemente mutado no caso da doença
genética em estudo. No alelo normal o sítio de restrição está preservado e no
alelo mutante ele foi perdido, pela troca de um par AT por um GC. Se o contrário
tivesse acontecido, a técnica também poderia ser aplicada da mesma forma,
apenas com a mudança equivalente na interpretação dos resultados. Quando o
trecho de DNA em estudo é amplificado por dois primers anelando nas regiões
acima e abaixo da mutação (em princípio todo o restante do gene é conservado),
os produtos gênicos terão o mesmo tamanho, sejam provenientes do alelo normal
(wt - wild type)ou do mutante. Então, será preciso uma intervenção nos produtos
para que uma distinção entre eles possa aparecer. Isto é feito pela ação da
enzima de restrição escolhida (no caso, a EcoRI). O produto de PCR produzido a
partir do alelo normal pode ser clivado pela enzima de restrição, dando origem a
duas bandas. O produto originado da amplificação do alelo mutante não tem mais
o sítio para EcoRI e não pode ser clivado, permanecendo do tamanho original.
Assim, num indivíduo heterozigoto (portador são de uma mutação recessiva) o
sistema produzirá três bandas: a maior, correspondente ao produto de PCR do
alelo mutante, que não pôde ser clivado pela EcoRI, e duas menores, fruto da
clivagem do produto de PCR do alelo normal.
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Fig. 7.11 Princípio da identificação de mutações pontuais através da eliminação/criação de
sítios de restrição e geração de fragmentos de digestão com polimorfismo de comprimento a
partir de produtos de PCR (PCR/RFLP). A figura representa o caso de um indivíduo
heterozigoto para a marca estudada. A mutação elimina um sítio EcoRI existente no alelo
selvagem (wt). A amplificação dos dois alelos produz fragmentos de mesmo comprimento.
Entretanto, a digestão destes fragmentos com a enzima EcoRI gera um polimorfismo de
comprimentos, com o alelo mutante permanecendo não cortado, enquanto o alelo selvagem é
clivado em dois pedaços de tamanho distinto.
Na avaliação do resultado da PCR/RFLP discutida acima, o gel deve mostrar uma
banda única apenas para o indivíduo afetado (homozigoto mutante, com clínica da
doença), já que os produtos de PCR dos dois alelos não podem ser clivados pois
perderam o sítio de restrição para EcoRI. Já o homozigoto normal terá seus os
produtos de PCR de dois alelos clivados e no gel apenas duas bandas estarão
visíveis. Apenas no caso já discutido (portador são, heterozigoto wt/m) serão
visíveis três bandas. A figura abaixo representa de forma esquemática o resultado
de uma análise PCR/RFLP.
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Fig. 7.12 Resultado da investigação da presença de mutação no sítio EcoRI por PCR
(PCR/RFLP). A figura representa o caso de um indivíduo heterozigoto para a marca estudada
(coluna b), um indivíduo afetado e um normal homozigoto. A mutação elimina um sítio EcoRI
existente no alelo selvagem (wt). A amplificaçãodos dois alelos produz fragmentos de mesmo
comprimento. Entretanto, a digestão destes fragmentos com a enzima gera um polimorfismo
de comprimentos, com o alelo mutante permanecendo não cortado, enquanto o alelo selvagem
é clivado em dois pedaços de tamanho distinto.
 
Em muitos casos de mutações pontuais a técnica de PCR/RFLP não pode ser
aplicada, seja porque não há sítio de restrição conhecido para o entorno da
mutação, seja porque múltiplas mutações são possíveis no gene de interesse,
tornando a abordagem acima impraticável. Uma alternativa é o mis-match PCR, ou
PCR com pareamento errôneo. O princípio desta técnica, descrito pela primeira
vez por Cotton et al., em 1988, e também conhecido com CMC - chemical
mismatch cleavage - baseia-se na clivagem de DNA em locais com pareamento
errôneo pela piperidina, e está representada na figura abaixo. Um indivíduo
heterozigoto tem uma mutação pontual numa região qualquer do gene. Podemos
amplificar esta região com primers dirigidos a suas extremidades, como fizemos na
PCR/RFLP. Em seguida aquecemos o produto do PCR e deixamos esfriar
rapidamente para induzir a formação de heteroduplexes (uma fita simples de um
alelo e a complementar do outro) além dos homoduplexes (as dus fitas pareadas
de volta, de um mesmo alelo). Nas região não pareadas ou com pareamento
errôneo com bases C e T liga-se o produto hidroxilamina ou o tetróxido de ósmio,
respectivamente. Uma vez ligados, estes produtos permitem a clivagem do DNA
neste local pela piperidina. Assim, 50% dos produtos de PCR serão cortados por
este sistema em todo lugar onde houver uma mutação. Em geral os fragmentos
gerados pro este sistema são pequenos e devem ser visualizados em gel de
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poliacrilamida. A figura abaixo mostra como funciona este sistema.
Fig. 7.13 Resultado da investigação da presença de mutação em uma base desconhecida
pela técnica de PCR-mismatch. A figura representa o caso de um indivíduo heterozigoto para
a marca estudada: o alelo selvagem tem o par TA e o mutante o par GC. A amplificação por
PCR do trecho onde a mutação está usa primers que estão a alguma distância à direita e à
esquerda da provável mutação. Quando o produto do PCR é aquecido os dois tipos de fita
(TA e GC) se separam, dando origem a 4 fitas simples. Quando a mistura é rapidamente
aquecida, as fitas simples se reassociam ao acaso de 4 formas distintas, pois a diferença de
uma única base não impede o pareamento das fitas quase complementares. Após o uso de
um sistema químico adequado, os pares de base errôneos são clivados e as fitas com mis-
match geram dois fragmentos no gel, ao contrário das fitas com pareamento perfeito. O
heretozigoto aparece, no gel, com três bandas (veja figura abaixo).
O resultado do experimento descrito acima está esquematicamente representado
na figura seguinte. O portador são, heterozigoto, tem uma mutação na posição
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descrita na figura anterior. O primeiro afetado tem esta mutação nos dois alelos.
Já o segundo afetado tem um alelo com a mutação da figura anterior e outro alelo
com uma mutação mais a direita, como representado na barra vertical ao lado do
gel.
Fig. 7.14 Resultado da investigação da presença de mutação pela técnica de mismatch PCR.
A figura representa o caso de um indivíduo heterozigoto para a marca estudada (coluna b),
dois indivíduo afetados e um normal homozigoto. A amplificação dos dois alelos produz
fragmentos de mesmo comprimento. Entretanto, a clivagem destes fragmentos pela piperidina
gera um polimorfismo de comprimentos, com o alelo mutante permanecendo não cortado,
enquanto o alelo selvagem é clivado em dois pedaços de tamanho distinto. No caso do
primeiro afetado (homozigoto) não há mismatch interno porque os dois alelos são idênticos.
Nocaso do afetado heterozigoto cada alelo é diferente do outro em dois pontos distintos, o
que gera três fragmentos pela piperidina, mais o produto não clivado do homoduplex.
Não se deve esquecer, contudo, que a presença de um mismatch não significa
diretamente uma mutação, pois há na natureza diferenças individuais entre
qualquer ser vivo. Estad diferenças, que não significam doença mas diferenças
simples entre indivíduos são chamadas SNPs. O teste final para o
reconhecimento de presença de uma mutação é, de fato, o sequenciamento direto
do produto de PCR. Se houver diferença entre os alelos, no lugar correspondente
eletroferograma haverá duas bases possíveis (p.ex. T ou A). (veja aula sobre
sequenciamento, a seguir). A consulta num banco de dados público de SNPs será
essencial, também (ver aula de Introdução à Bioinformática, mais adiante).
 
7.6. PCR em tempo real - o sistema Taqman
Recentemente foi desenvolvido um sistema pela empresa Applied Biosystems
(fundida com a Celera na atual Applera), para detectar o produto do PCR à
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medida em que esta vai sendo sintetizado na reação. O engenhoso sistema é
baseado no uso de uma sonda, dirigida contra uma região interna da sequência
que se deseja amplificar, e que tem dois fluorocromos, um em cada extremidade
da sonda (um DNA fita simples). Na extremidade 5´ há um fluorocromo que só
fluoresce se estiver distante fisicamente do fluorocromo na posição 3´. Este
segundo fluorocromo funciona como capturador de energia (quencher) e não
deixa com que a energia luminosa usada para excitar a sonda chegue em
quantidade suficiente para excitar o primeiro fluorocromo. Estes dois fluorocromos
estão representados como R e Q (para quencher). Quando o primer hibridiza na
região 5´, a sonda também o faz no meio da sequência. À medida em que a Taq
polimerase avança sintetizando a fita nova, ela vai degradando a sonda à sua
frente, liberando o fluorocromo R da sonda e permitindo que absorva energia e
emita luz. A energia para a excitação dos fluorocromos provem de um feixe de
laser que atravessa a amostra e o equipamento que faz isto chama-se PCR em
tempo real (real time PCR) ou Taqman. A figura abaixo esclarece este princípio.
Fig. 7.15 Princípio de funcionamento do Taqman, ou PCR em tempo real. Uma sonda fita
simples com dois florocromos é adicionada à reação de PCR. O fluorocromo Q atua com
atenuador da fluorescência de R, sendo protanto um quencher. Para isto é preciso que esteja
próximo a R. A TAq polimerase separa os dois fluorcromos à medida em que degrada a
sonda quando sintetiza a fita nova. O fluorocromo R recém liberado da sonda emite então luz
num comprimento de onda característico, diferente de Q. A excitação dos fluorocromos é feita
com laser que atravesse o tubo de reação.
A medição da radiação é feita pelo aparelho, que taça um gráfico com a absorção
obtida após cada ciclo de PCR. O ciclo em que o patamar (limite) de negatividade
é ultrapassado está diretamente relacionado à quantidade de DNA molde na
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mistura. Com isto, a quantificação de DNA molde passou a ser não apenas
possível, mais rápida. O sistema ainda é bastante dispendioso mas tenderá a se
tornar mais barato à medida em que novos sistemas entrarem no mercado e um
maior número de máquinas for disponível.
Fig. 7.16 Gráfico obtido com o Taqman. A seta indica o ciclo em que a reação ultrapassa o
limite da reação negativa. Quanto menor a quantidade de DNA molde no tubo de reação maior
o número de ciclos necessários para ultrapassar o limite da negatividade. A reação de PCR
no Taqman emprega em geral apenas duas temperaturas (94 oC para desnaturação e 60 oC,
para hibridização e extensão) e o resultado da PCR pode ser dado em menos de 30 minutos.
 
7. 7 Um pouco de história
em construção
A reação em cadeia da polimerase foi desenvolvida a partir de uma idéia de Kary
B. Mullis.
K. Mullis nasceu em 1944 em Lenoir, Carolina do Norte, EUA. Obteve o grau de
bacharel em química em 1966 no Instituto de Tecnologia da geórgia eo PhD em
Bioquímica pela Universidade da Califórnia em Berkeley. Passou então 7 anos
como pós-doutor em Cardiologia Pediatria e Química Farmacêutica na Escola de
Medicina da Universidade de Kansas (EUA). Em seguida reebu um convite para
trabalhar como técncio na Cetur Corporation, em Emeryville, em 1978. Foi lá que
teve a idéia da PCR.
Segundo ele, foi dirigindo seu carro de San Francisco para sua casa em La Jolla,
California, que ele começou a imaginar uma maneira simples de determinar uma
sequência de nucleotídeos a partir de um trecho de DNA. Ele então, como querem
para si outros cientistas, tece uma inspiração súbita: a solução não era apenas
para seu problema original, mas tinha um alcance muito maior. Ele imaginou uma
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forma de fazer a DNA polimerase iniciar e terminar seu trabalho em pontos pré-
determinados e, consequentemente, pelo uso desta proipriedade, descobriu uma
maneira de amplificar exponencialmente uma sequencia de DNA num tubo de
ensaio.
Mullis então levou a idéia para seus colegas da Cetus e juntos eles a colocaram
para trabalhar de verdade. Ela foi apresentada pela primeira vez ao público numa
conferência em 1985 e foi pronta e amplamente aceita pela comunidade científica.
A popularidade da técnica, assim como seu conceito, ganhou crescente
popularidade ao longo dos anos seguintes.
Em 1989 a revista Science escolheu a molécula usada na PCR, a Taq
polimerase, como a primeira "Molécula do Ano".
Em 1991 a PCR se tornou extremamente comum em laboratórios pelo mundo
afora e referências ao uso da técnica já somavam milhares nas revistas
científicas. Um ano depois a Cetus, depois de uma reorganização corporativa,
vendeu a patente da PCR para a Hoffman - La Roche por US$ 300.000.000,00.
Devido ao alcance e popularidade da PCR Kary Mullis foi apontado e recebeu o
prêmio Nobel de Química em 1995. Esta indicação foi duramente contestada por
muitos que acreditavam que a PCR foi apenas um desenvolvimento de técnica e
que sua concepção não era suficiente para dar a Mullis o status de nobelista.
Mullis argumentou a seu favor que a união das técnicas pré-existentes no formato
por ele criado fazia toda a diferença.
Para uma história um pouco mais detalhada sobre o desenvolvimento da PCR
veja o site http://usitweb.shef.ac.uk/~mba97cmh/history/history.htm
 
7.8 Artigos importantes sobre PCR
Uma seleção dos mais importantes artigos sobre PCR, tanto durante o
desenvolvimento da técnica quanto para diversas aplicações, pode ser
encontrada na página específica da Universidade de Berkeley:
http://sunsite.berkeley.edu/pcr/foundationalPCR.html#anchor1239949
Vale a pena conferir!
 
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