Eletroforese_Manual

Prévia do material em texto

Andrey Borges Teixeira 
 
Manual da aula prática de 
eletroforese para DNA 
 
 
 
 
 
 
 
ANDREY BORGES TEIXEIRA 
andbt@yahoo.com 
http://www.geocities.com/andbt 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Botucatu 
2003 
 
Andrey Borges Teixeira 
Eletroforese para DNA 
 
Introdução: 
A eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida pode ser usada 
para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é simples, 
rápida e capaz de determinar fragmentos de DNA que não podem ser 
separados adequadamente por outros processos, como pela centrifugação 
através de um gradiente de concentração. Além disso a localização do DNA no 
gel pode ser determinada diretamente pela coloração através de fluoróforos 
como por exemplo o Brometo de Etidium. Bandas que contenham ao menos 
20pg de fita dupla de DNA podem ser diretamente detectadas em gel sob 
exposição de luz ultravioleta (UV). 
O gel de poliacrilamida tem maior capacidade de resolução e é mais 
efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de base). 
Além disso, fragmentos de DNA num mesmo gel que diferem por apenas 1 bp 
em comprimento ou por 0,1% de suas massas, podem ser separados neste 
gel. Esse gel também pode acomodar maiores quantidades de DNA sem perda 
de resolução, até 10mg, comparado ao de agarose que pode acomodar bandas 
que contenham até aproximadamente 10ng de DNA com boa resolução. 
Também é muito utilizado para recuperação e purificação de DNA. Contudo o 
gel de poliacrilamida comparado com o de agarose, é mais difícil de ser 
preparado e muito tóxico quando em pó ou em solução. Sua corrida se faz 
numa cuba vertical mediante campo elétrico constante. 
O gel de agarose tem menor capacidade de resolução, porém apresenta 
maior extensão de separação. Longos fragmentos de DNA (50-20.000 bp) 
podem ser separados em gel de agarose com diferentes concentrações. O 
tamanho dos poros do gel de agarose é diretamente proporcional ao tamanho 
do fragmento que se deseja separar. O tamanho do poro, ou a porosidade do 
gel de agarose, é definido pela concentração do gel: quanto menor for a 
concentração do gel maior será a porosidade e portanto maior o fragmento de 
DNA que poderá ser separado. Contudo, quanto menor a concentração do gel, 
mais frágil ele se torna. Geralmente se trabalha com géis de agarose de 1 a 
1,5%, dependendo do fragmento de DNA esperado. 
Andrey Borges Teixeira 
Mesmo assim, o gel de agarose é incapaz de separar moléculas de DNA 
maiores que 750 kb de comprimento. Uma solução para esse problema foi 
encontrada em 1984, quando Schwartz e Cantor, desenvolveram um sistema 
de campo de pulso (pulsed-field gel electrophoresis – PFGE), que consiste de 
forma simplificada de um gel com um campo elétrico ortogonal. 
 
A - GEL DE AGAROSE 
 
Alguns fatores determinam a migração do DNA através do gel de 
agarose: 
a) tamanho da molécula de DNA 
b) concentração da agarose 
c) conformação do DNA (formas circulares ou não lineares: I; II e III) 
d) a presença de brometo de etidium no gel 
e) voltagem aplicada 
f) tipo de agarose 
g) tipo do tampão de eletroforese 
 
B - GEL DE POLIACRILAMIDA 
 
Existem dois tipos de géis de poliacrilamida comumente utilizados: 
1- Gel de poliacrilamida denaturante: usado para separação e 
purificação de fragmentos de fitas simples de DNA. Esse gel é 
polimerizado na presença de um agente (uréia ou menos 
freqüentemente formamida). 
2- Gel de poliacrilamida não denaturante: usado para separação e 
purificação de fragmentos de fitas duplas de DNA. 
 
C – SOLUÇÕES E REAGENTES 
 
C-1) Tipos de tampões: 
a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão 
de eletroforese-Tris-acetato-EDTA) 
Andrey Borges Teixeira 
b) TPE (Tris-phosphate-EDTA electrophoresis buffer – 
Tampão de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA) 
c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão 
de eletroforese-Tris-borato-EDTA) 
d) 
C-2) Tampão de carregamento (loading buffer): 
 O tampão de carregamento é misturado às amostras antes de 
carregar o gel e possui três finalidades: 
1) aumentar a densidade da amostra 
2) adicionar cor às amostras 
3) simplificar o processo de carregamento 
 
C-3) Coloração do gel: 
 
C-3.1) Brometo de etidium (agarose e poliacrilamida) 
 O brometo de etidium intercala-se com a molécula de DNA 
a cada 2,5 bp do fragmento, após sua inserção esse exerce uma ligação do 
tipo van der Waals. A radiação UV é capaz de estimular essa ligação entre o 
DNA e o corante tornando a molécula ou banda visível no gel através de um 
dispositivo de transiluminação. 
 
C-3.2) SYBR GOLD (agarose e poliacrilamida) 
 Para maiores informações, consulte a referência 
bibliográfica citada. 
 
C-3.3) Metileno Blue (poliacrilamida) 
 Para maiores informações, consulte a referência 
bibliográfica citada. 
 
 
 
 
 
 
Andrey Borges Teixeira 
4 - PREPARO 
 
4.1. TBE 10 X e 1 X 
4.1.1. TBE 10x: 
Componente Quantidade Concentração 
Tris base 121,1g 1M 
Ácido Bórico Anidro 55,6g 0,9M 
Na2EDTA 2H2O 3,7g 10mM 
H2O deionizada ou Milli-Q 1 litro pH = 8,3 a 25oC 
 
 
4.1.2. TBE 1x: 
- 100ml de TBE 10x + 900ml de H2O (Milli-Q) 
 
4.2. Tampão de carregamento (loading buffer): 
4.2.1. Agarose: 
- 50% (peso/volume) glicerol (H2O DEPC) 
- 10 mM EDTA (pH 8,0). PM (EDTA) = 372,24 g/mol/litro 
- 0,25% (peso/volume) azul de bromofenol (bromophenol blue) 
- em um Becker colocar 5 mL de glicerol + 5 mL de água tratada com 
DEPC (dietil pirocarbonato) + 37,22 mg de EDTA, homogeneizar e 
acertar o pH em 8,0 
- acrescentar 25 mg de azul de bromofenol homogeneizar novamente e 
aliquotar (1 mL) em 10 microtubos (1,5 mL) 
- armazenar a temperatura de 4oC. 
 
4.2.2. Poliacrilamida: 
- 30% (p/v) glicerol (H2O DEPC) 
- 0,25% (p/v) azul de bromofenol 
- 0,25% (w/v) xileno cianol FF(xylene cyanol FF) 
- em um Becker colocar 3 mL de glicerol + 7 mL de água DEPC 
- acrescentar 25mg de azul de bromofenol + 25mg de xileno cianol FF 
homogeneizar novamente e aliquotar (1 mL) em 10 microtubos (1,5 mL). 
- armazenar a temperatura de 4oC. 
Andrey Borges Teixeira 
4.3. Gel agarose: 
 
Variação da % do gel de agarose para separação de diferentes 
quantidades de DNA esperado: 
Concentração de Agarose no gel 
(% [peso/volume]) 
Moléculas de lineares de DNA (kb) 
0,3 5-60 
0,6 1-20 
0,7 0,8-10 
0,9 0,5-7 
1,2 0,4-6 
1,5 0,2-3 
2,0 0,1-2 
 
4.3.1. Gel de agarose (1%) 
- 100 mL de TBE 1X / 1g de agarose 
- aquecer o gel de agarose no microondas até ferver 
- esperar diminuir a temperatura para 50-60°C 
- verificar o nível do tanque 
- despejar o gel de forma homogênea 
- passar delicadamente os pentes pelo gel para desfazer possíveis 
bolhas de ar colocando-os na posição adequada 
- deixar secar e retirar os pentes 
- colocar o tampão TBE 1X até cobrir o gel. 
 
4.3.2. Carregamento do gel horizontal: 
- colocar num pedaço de parafilme gotas do tampão de carregamento 
10% do volume da amostra (ex.: para 15ml da amostra, utilizar 1,5ml) 
- colocar a amostra de DNA na gota de corante e homogeneizar bem 
com o pipetador 
- carregar cada amostra em um pocinho do gel, tomando o cuidado 
para não perfurar o gel nem derramar a amostra fora do pocinho 
- adicionar o DNA Ladder (marcador) 
Andrey Borges Teixeira 
- conectar os cabos e estabelecer a voltagem ideal para cada gel (1-
5 V/cm para géis médios ou grandes e 5-20 V/cm para mini-géis) 
 
 
Sambrook & Russell (3a Edição). 
 
4.4. Gel poliacrilamida não denaturante:Variação da % do gel de poliacrilamida e tipos de corantes para 
separação de diferentes quantidades de DNA esperado: 
Concentração do 
gel (%) 
Intervalo de 
separação (bp) 
Xileno Cianol FF Bromophenol 
Blue 
3,5 1000-2000 460 100 
5,0 80-500 260 65 
8,0 60-400 160 45 
12,0 40-200 70 20 
15,0 25-150 60 15 
20,0 6-100 45 12 
 
 
 
 
 
 
 
Andrey Borges Teixeira 
Volume dos reagentes usados: 
% gel 29:1 acri-bis (mL) H2O (mL) TBE 10X H2O (mL) PA (10%[mL]) 
3,5 11,6 77,7 10,0 0,7 
5,0 16,6 72,7 10,0 0,7 
8,0 26,6 62,7 10,0 0,7 
12,0 40,0 49,3 10,0 0,7 
20,0 66,6 22,7 10,0 0,7 
 
 
4.4.1. Soluções estoque: 
4.4.1a. Acrilamida (29):(1) Bisacrilamida 
- 29g Acrilamida 
- 1g N,N’ - Metilenebisacrilamida 
- completar para 100mL de H2O deionizada e destilada ou 
Milli-Q, homogeneizar sob placa agitadora aquecida 
- armazenar à 4oC 
4.4.1b. Persulfato de amonio (PA [10%]) 
- 1g Persulfato de amonio 
- completar para 10mL de H2O deionizada e destilada ou 
Milli-Q (armazenar à 4oC) 
 
4.4.2. Gel de poliacrilamida não denaturante (5%) 
- 16,6mL solução estoque (29:1) 
- 0,7mL de PA (10%) 
- 10,0mL de TBE 10x 
- 72,7mL de H2O 
- adicionar 35mL de TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) 
somente na hora de preparar o gel 
- homogeneizar sob placa agitadora 
- limpar as placas de vidro para montagem do gel com etanol (do lado 
onde for aplicar o gel), colocando os espaçadores adequados para 
espessura do gel desejado 
- colocar a placa num ângulo de aproximadamente 20o 
Andrey Borges Teixeira 
- colocar o gel com auxílio de uma seringa de forma homogênea sem 
deixar fazer bolhas (“rapidamente”) 
- deixar a placa na posição vertical 
- colocar o pente e completar com os espaços para formar 
corretamente as paredes dos poços 
- deixar polimerizar até atingir um padrão de “Schlieren” visível e logo 
após retirar os pentes delicadamente 
- com auxílio de uma seringa, lave os poços do gel usando tampão 
TBE 1X 
- coloque a placa no tanque e cubra-o com tampão TBE 1X 
 
4.4.3. Carregamento do gel vertical: 
- colocar num pedaço de parafilme gotas do tampão de carregamento 
10% do volume da amostra (ex.: para 15ml da amostra, utilizar 
1,5ml) 
- colocar a amostra de DNA na gota de corante e homogeneizar bem 
com o pipetador 
- colocar cada amostra em um pocinho do gel, tomando o cuidado de 
não perfurar o gel nem derramar a amostra fora do pocinho 
- adicionar o DNA Ladder (marcador) 
- conectar os cabos e estabelecer a voltagem ideal para o gel 
(1-8 V/cm) 
 
Sambrook & Russell (3a Edição). 
Andrey Borges Teixeira 
5. Coloração do gel: 
5.1. Brometo de etidium (BE): 
- BE estoque - 10mg/ml 
- 1 pastilha de BE contém 100mg, portanto, diluir 1 pastilha em 10 ml de 
H2O Milli-Q. 
5.1.1. Corando o gel antes da corrida (agarose): 
- BE no gel - 0,5 mg de BE por mL de gel 
5.1.2. Corando o gel depois da corrida (agarose e poliacrilamida): 
- fazer o gel sem BE 
- preparar solução corante de BE/TBE 1X (1ml de BE estoque / 10ml 
TBE 1X) 
- manter essa solução no tupeware por no máximo 3 dias (o BE 
acaba perdendo sua ação pela ação da luz solar) 
- preparar solução suficiente para cobrir o gel e colocá-la no 
tupeware 
- após a corrida colocar o gel imerso na solução corante por 30 
minutos (gel de agarose) ou 15 minutos (gel de poliacrilamida) 
- após aguardar o tempo necessário para cada gel, este estará pronto 
para fotodocumentação ou captura de imagem do gel. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Andrey Borges Teixeira 
6. Fotodocumentação ou captura de imagem do gel: 
 
 
Sambrook & Russell (3a Edição). 
 
 
Amersham Biosciences (VDS-CL - Filmless detection of chemiluminescence) 
 
7. Referência Bibliográfica: 
 
 Sambrook J, Russel DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3th 
Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 2001.