Mecanismo de coloração de gram

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Universidade Estadual do Maranhão – Centro de Ciências Agrárias
Departamento de Patologia
Microbiologia Geral
Diego Marques Costa Silva
Mecanismo de coloração de Gram
São Luís/MA
2015
Universidade Estadual do Maranhão – Centro de Ciências Agrárias
Departamento de Patologia
Microbiologia Geral
Diego Marques Costa Silva
Mecanismo de coloração de Gram
Relatório de Microbiologia geral sobre a
prática ocorrida de coloração de Gram, sob orientação da professora Larissa Sarmento dos Santos, como trabalho avaliativo referente ao segundo período do curso de medicina veterinária.
São Luís/MA
2015
1. Introdução
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram. Ela é um dos processos de coloração mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivas (que coram em roxo) e gram-negativas (coram em rosa). (DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, UFMG)
Essa diferença da coloração está diretamente ligada com a parede bacteriana. As bactérias Gram-positivas elas tem uma cama de mais grossa (espessa) de peptideoglicano, já a Gram-negativa ela tem uma camada mais fina (delgada) em sua parede (Figura 1). 
Figura 1: Paredes celulares de bactérias gram-negativa e gram-positiva
Fonte: www.icb.ufmg.br/mic
O método utilizado hoje em dia, já não é o original. Quando a técnica foi descoberta, se utilizam violeta-de-gencina, na qual foi substituída pelo o cristal-violeta. Antigamente no lugar do álcool era uma mistura de solventes. Hoje em dia alguns laboratórios ainda utilizam a fucsina, mas outros já a substituíram pela a safranina. O motivo dessa mudança é pela distancia do tom violeta.
Figura 2: Distância entre a safranina e a fucsina em relação ao tom violeta
Fonte: Brasilia: Ministerio da Saúde, Programa Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS,1997.
2. Objetivos 
Aprender na pratica como se realiza o mecanismo de coloração de Gram, do esfregaço á coloração.
Visualizarmos tanto bactérias Gram-positivas como Gram-negativas.
Compreender a diferença da parede celular das bactérias Gram-positivas e negativas.
3. Metodologia
Para realizar a coloração de Gram, tem que se fazer primeiramente o processo de fixação, onde se tem que secar a lamina com fogo para não correr o risco de as bactérias saírem no momento de utilizar os produtos para a coloração. O segundo processo é o mecanismo de coloração, utilizando o cristal-violeta, lugol, álcool e fucsina para poder colorir afim de descobrir se a bactéria é Gram-positiva ou negativa.
4. Desenvolvimento 
4.1 Materiais
Pinça
Alça
Lamina
Papel toalha
Bico de Bunsen
Placa de cultura
Cristal-Violeta
Lugol
Álcool 
Fucsina
Água
4.2 Métodos 
Pegamos a lamina que estava mergulhada em álcool com uma pinça, colocamo-a em um papel toalha para podermos enxuga-la, quando estava enxuta colocamos um pouco de solução salina em cima da lamina. Fizemos o processo de flambagem na alça (esterilização a seco), esse processo é realizado devido se está mexendo com meio de cultura, para que não tenha contaminação. Depois de esterilizar, encostamos a alça onde não tem microrganismo e depois passamos em cima da colônia para pegar apenas um pouco de bactéria, a quantidade tem que ser pequena por que se for colocado muita na lamina elas ficarão muito unidas e isso vai dificultar ver no microscópio depois. Colocamos as bactérias em cima da solução salina e começamos a espalhar. Conseguimos verificar uma parte esbranquiçada, a qual seria as bactérias. Foi espalhado bastante sobre a lamina para que não ficasse nenhuma bactéria sobre a outra, para mais na frente verificarmos melhor no microscópio. Esterilizamos novamente a alça para podemos colocar em cima da bancada, esse processo foi realizado de novo já que estávamos mexendo com bactérias. O próximo passo foi o de fixação, fomos encostando a lamina no fogo, em uma sequencia de colocar e retirar rapidamente para que não esquentasse muito. Esse processo foi realizado até o momento em que a solução salina secasse por completo. Então esse foi o processo de fixação, que tem como objetivo fixar as bactérias na lamina para que nos momento da coloração elas não soltem. Todo esse processo foi feito mais de uma vez, isso por que queríamos mais de uma lamina.
O próximo passo foi o de coloração, inicialmente nos foi mostrado a bateria de coloração de Gram (cristal-violeta, lugol, álcool e a fucsina). Nessa primeira etapa, cobrimos os esfregaços com cristal-violeta e cronometramos por um tempo de 60 segundos e lavamos a lamina. No momento de retirar o excesso de cristal-violeta, deixamos a água cair pela nossa mão e escorrer na lamina, pois se colocar diretamente a água, todo o cristal-violeta vai ser retirado. O segundo a ser utilizado é o lugol, fizemos o mesmo processo do cristal-violeta, cobrimos toda a lamina, deixamos 60 segundos e fizemos a mesma lavagem. O terceiro passo realizado da coloração, foi lavar as laminas com álcool, deixamos sobre ela por 15 segundos. O ultimo passo da coloração foi a aplicação da fucsina, cobrimos toda a lamina e depois de 20 segundos fizemos a lavagem.
Observação: sempre tomar cuidado no momento de realizar processor nos laboratórios, como sabemos, um dos tipos de risco é o físico (causados por exemplo, algum equipamento que gera calor), e mesmo a professora com toda a experiência se queimou um pouco no momento de encostar a lamina no bico de Bunsen.
5. Resultados e discussão
O resultado que obtivemos foi tanto de lamina de bactérias Gram-positivas (ficou com uma coloração roxa) como de bactérias Gram-negativas (tom rosa). Essa coloração da Gram positivo é devido sua parede celular que é espessa, e como a Gram-negativa tem uma parede celular mais delgada, o cristal violeta não consegue se fixar. Além de a Gram-negativa ter a parede mais delgada, com a aplicação do álcool ainda se tem o aumento da porosidade fazendo com que o Cristal-Violeta saia por completo e por isso se tem a aplicação da fucsina, que age como um contra corante deixando-a que um tom mais vermelho. Em ambas as laminas foram vistas bactérias na forma de cocos e no arranjo de Sthaphylococcus.
6. Conclusão
A técnica de coloração de Gram ela é de grande importância para a microbiologia, sendo uma técnica viável, devido ser um método fácil e rápido.
Por conseguinte, essa diferença na coloração vai ser devido a sua relativa resistência ao efeito que o álcool causa na parede da bactéria, além disso, nas bactérias Gram-positivas, ele também faz com haja uma diminuição da porosidade, impedindo que o corante de Cristal-violeta não possa sair e continue violeta.
7. Referencias bibliográficas 
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, UFMG. Net micro. Disponível em:<http://icb.ufmg.info/mic/diaadia/wpcontent/uploads/2012/10/Colora%C3%A7%C3%A3o-de-gram-T.pdf. >. Acesso em: 19 de setembro de 2015.
Ministério da Saúde. Secretaria de Políticas de Saúde. Programa nacional de DST e Aids. Técnica de Coloração de GRAM. Brasília, 2001.