RELATORIO DE BROMATO-PROTEINA

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FACULDADE ESTÁCIO FASE
NUTRIÇÃO
DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE PROTEINA METODO DO BIURETO
EQUIPE TÉCNICA
Priscila dos Santos Ramos
Maria Daiana Santana
ARACAJU, 24/08/2013
INTRODUÇÃO
O MÉTODO DE BIURETO
Princípio
As origens do método do biureto podem ser traçadas desde a proposta inicial de Autenrieth, em 1915; posteriormente diversos autores propuseram modificações do mesmo, sendo, atualmente, a proposta metodológica de Gornall e cols9. a mais utilizada. O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com
um complexante que estabiliza o cobre em solução, sendo o tartarato de sódio o recomendado por Gornall e cols.9. O cobre, em meio alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do método do biureto14, a banda na região de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, porque diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na região de 270 nm
causando muita interferência no método. O método de biureto tem sido aplicado para determinar a 788 QUÍMICA NOVA, 21(6) (1998) concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sangüíneo15,16,18,19, líquido cérebro espinhal (líqüor)20,21, urina22-24, alimentos25-29, saliva30, fibrinogênio31 e tecido animal32. O método de biureto tem sido, também, utilizado em análise por injeção em fluxo19, assim como em alguns métodos cinéticos21,33. Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas9,20,21,30, este método não é muito sensível, como foi destacado por diversos autores20,24,30, colocando-o em grande desvantagem, em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto continua sendo recomendado para a determinação da concentração de proteínas totais em plasma sangüíneo pela Associação Americana de Análises Clínicas e por diversos autores15,16,34, bem como para a determinação de proteínas totais em saliva30 e leite29, quando comparado com outros métodos. Verifica-se que o método de biureto está sujeito à interferência de substâncias que possam reagir com os íons cobre
(II). Na tabela 1 estão listados alguns interferentes; os métodos para sua eliminação variam conforme o caso, como discutido nas referências citadas nessa tabela, no entanto, recomendamos a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético e posterior solubilização para determinação das mesmas.
	O método fotocolorimétrico foi desenvolvido com a finalidade de dosar substâncias biológicas. Neste método são utilizadas reações que resultam em soluções coloridas. A intensidade da cor produzida é proporcional à concentração da substância que está sendo dosada. Em conseqüência desta proporcionalidade, é possível dosar substâncias em soluções de concentração desconhecida (AMOSTRA), ao comparar a intensidade da cor produzida por esta substância à intensidade da cor produzida pela mesma substância em uma outra solução onde a concentração é previamente determinada (PADRÃO). 	
	A diferença de coloração é muitas vezes imperceptível a olho nu. A medida da intensidade de cor é efetuada por instrumentos denominados fotocolorímetros ou espectrofotômetros. Estes instrumentos possuem uma fonte de luz branca, filtros coloridos (fotocolorímetro), prismas ou retículos de difração (espectrofotômetro), através dos quais pode ser feita a seleção do comprimento de onda (), e um sistema onde a intensidade da luz é detectada, transformada em corrente elétrica, amplificada e medida.
	Ao incidir um feixe de luz sobre uma solução corada, verifica-se que a intensidade de luz que emerge da solução (I), é menor que a intensidade de luz incidente nesta solução (Io). A diferença entre a intensidade de luz de incide e a intensidade de luz que atravessa a solução corada pode ser medida e expressa pelo coeficiente obtido através da divisão da intensidade da luz emergente (I) pela intensidade da luz incidente (Io). Este coeficiente é chamado de transmitância (T). Por sua vez, mede-se a intensidade de luz absorvida por uma solução corada pela redução da medida da intensidade de luz transmitida. A medida de absorção é chamada de absorbância (A) ou extinção (E), logo A e T são inversamente proporcionais.
> concentração > intensidade de cor > Absorbância < Transmitância
A relação entre e concentração da substância e a absorbância é chamada de fator de calibração (FC). Fc = C/A.
A concentração de uma substância em uma determinada amostra pode ser determinada através da comparação da intensidade da cor obtida nesta amostra com a intensidade da cor produzida em uma solução padrão aplicando uma regra de três. Para evitar erros de aferição, não é utilizado um único padrão para realizar a comparação. É realizada uma série de determinações com concentrações crescentes da solução padrão, medindo as suas respectivas absorbâncias, a CURVA PADRÃO. É calculado o fator de calibração para cada solução padrão e é feita uma média destes fatores, o fator de calibração médio (FCM).
As praticas a seguir apresentas tem como objetivo observar a presença de proteína no leite, a partir da utilização de um reativo que identifica as ligações peptídicas, comprovando a presença de caseína (proteína do leite).
METODOLOGIA
Em um tubo de ensaio foi colocado 2 mL de leite liquido integral, 2 ml de leite fermentado, quatro colheres de leite em pó, sendo que os dois últimos dissolvidos em 100ml de água destilada, acrescente 2 mL de biureto e 2 gotas de hidróxido de sódio e homogeneizados. 
RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Foi observado se há diferença na coloração das duas reações.
Tabela 1. Efeito da diluição na intensidade da cor
	AMOSTRAS
	
ÁGUA (mL)
	BIURETO (mL)
	HIDRÓXIDO DE SÓDIO (GOTAS)
	INTENSIDADE DA COR
	LEITE INTEGRAL 2ML
	0
	2
	3
	+++
	LEITE EM PÓ 4 COLHERES
	100
	2
	3
	++
	LEITE FERMENRADO 2ML
	100
	2
	3
	+
INTESNSIDADE DA COR
+++ MUITO CONCENTRADO
++ CONCENTRADO	
+ POUCO CONCENTRADO
+\- POUQUISSIMO CONCENTRADO
- AUSENCIA
CONCLUSÃO
Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de uma metodologia para a determinação de proteínas totais, porém, um deles é essencial: o conhecimento, o mais preciso possível, da natureza dos constituintes da amostra e de suas concentrações aproximadas. Isto facilitará a identificação dos possíveis interferentes e consequentemente ajudará na escolha do método mais apropriado para cada situação. Outros fatores, também importantes, são a sensibilidade necessária, que é dependente da concentração de proteína na amostra e do volume de amostra disponível; a rapidez e o custo da metodologia; e, não menos importante, o grau de confiabilidade nos resultados obtidos devido aos interferentes no método escolhido. Temos observado que muitas vezes a escolha de uma metodologia para a determinação de proteínas totais é feita com base na popularidade de um determinado método e isto acontece em parte devido à falta de trabalhos de comparação de metodologias. Portanto, acreditamos que muitos trabalhos deste tipo devam ainda ser desenvolvidos principalmente nas áreas de análises clínicas, ciências e tecnologia de alimentos.
REFERÊNCIAS
- DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS
MÉTODOS EXISTENTESDimas A. M. Zaia* Departamento de Química - CCE - Universidade Estadual de Londrina - 86051-970 - Londrina - PR
Cássia Thaïs B. V. Zaia Departamento de Ciências Fisiológicas - CCB - Universidade Estadualde Londrina - 86051-970 - Londrina - PR
Jaim LichtigInstituto de Química - Universidade de São Paulo - 05599-970 - São Paulo - SP
Recebido em 23/7/97; aceito em 19/6/98
- CECCHI, HELOÍSA MÁSCIA; FUNDAMENTOS TEÓRICOS EPRÁTICOS EM
ANÁLISE DE ALIMENTOS; editora da Unicamp, Campinas, São Paulo, 2003, p.49-59
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