Aminoácidos, Peptídeos e Proteínas

Esta é uma pré-visualização de arquivo. Entre para ver o arquivo original

*
*
Aminoácidos, peptídeos e proteínas
*
*
Funções das proteínas
Vagalume
Enzima luciferase quebra a proteína luciferina na presença de ATP
*
*
Características químicas dos aminoácidos
*
*
Os aminoácidos
Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L
A biologia é canhota
Glicina não tem isomeria óptica
Carbono alfa
*
*
Grupo R apolar e alifáticos
Aminoácidos apolares e hidrofóbicos
Ligações de Van der Waals
Ala, Val, Leu, Iso
Interações hidrofóbicas
Gly; menor aminoácido
Met
Possui átomo de enxofre
Pro
Iminoácido, menor flexibilidade estrutural
*
*
Grupo R aromáticos
Aminoácidos hidrofóbicos
Tirosina pode formar pontes de hidrogênio com a água
Modificações pós- traducionais
Fosforilação do OH da tirosina
Fenilalanina
Mais apolar
*
*
Grupos R polares, não carregados
Solubilidade intermediária em água
Serina e treonina
Grupos hidroxil
Asparagina e glutamina
Grupo amida
Cisteína
Grupo sulfidril
Ligações dissulfeto
*
*
Grupos R carregados
Aminoácidos básicos
Carga positiva
Lisina, segundo grupo amino
Arginina, grupo guanidina
Histidina, grupo aromático imidazol
Aminoácidos ácidos
Carga negativa
Possuem segundo grupo ácido carboxílico
*
*
Aminoácidos incomuns
Modificações pós-traducionais
4-hidroxiprolina
5-hidroxilisina
6-N-metil-lisina
Gama-carboxiglutamato
Fosforilação de resíduos
Selenocisteína
Selênio ao invés de enxofre na Cys
É adicionado durante a tradução por mecanismo específico e regulado
*
*
pH e pKa
Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas
Ionização
< pH; > [H]+ estado não-ionizado
*
*
Aminoácidos são ionizáveis
Substâncias anfóteras: possuem natureza dual
Podem funcionar assim como ácidos ou bases
Doam ou recebem prótons
*
*
Titulação de um aminoácidos
pKa: tendência de um grupo fornecer um próton ao meio
Aminoácidos podem perder até 2 prótons para o meio
Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas
*
*
Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos
Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral
*
*
Peptídeos e proteínas
*
*
Polipeptídeo
>Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN 
*
*
Peptídeos tbm são ionizáveis
Ou seja, possuem curva de titulação característica
Funcionam em faixas de pH ótimas
*
*
Número de resíduos por proteína
*
*
Uso de aminoácidos
Varia bastante entre as proteínas
Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula
*
*
Proteínas com outros grupos químicos
Adicionados pós-traducionalmente
*
*
Trabalhando com proteínas
*
*
Proteínas podem ser separadas e purificadas
Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas?
Basta selecionar por propriedade
Tamanho, carga e propriedades de ligação
Obter o extrato bruto
“correr” em cromatografia de coluna
Fase estável (matriz)
Fase móvel (solução com tampão)
Coluna maior permite maior resolução na separação
*
*
Cromatografia por troca iônica
Polímero carregado negativamente
Proteínas positivas ligam ao polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna
Afinidade da proteína é definido também pelo pH
*
*
Cromatografia por exclusão de tamanho
Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores
Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro
*
*
Cromatografia de afinidade
Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse
Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz
Elui-se com solução de ATP
*
Eletroforese -- Histórico
1952, Markham and Smith
Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico
1955, Smithies
Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano
1967, Loening 
Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda moléculas grandes de DNA
1980, Schwartz and Cantor 
Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes
É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...
Vou ali correr um gelzinho e já volto
Tenho que ir senão vou perder meu gel
*
Eletroforese
Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme
DNA, carga negativa
Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico
Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica 
Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS)
Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular
*
Eletroforese, etapas
Preparação do gel
Aplicação das amostras
Eletroforese
Coloração
 Análise dos resultados
*
*
Preparação do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
*
*
Aplicação das amostras
Definição do mapa das amostras por canaleta
*
Corrida do gel
Aplicação do campo elétrico
Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão
Terminais positivo e negativo
Tempo adequado, senão o DNA sai do gel
*
Coloração das moléculas
Prata
Gel SDS-PAGE
PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
Melhor resolução
Coomassie blue, etc
Brometo de etídio
Agente intercalante do DNA
Cancerígeno!
Composto fluorescente à luz UV
Gel de agarose
*
*
*
*
Eletroforese de um resultado de cromatografia
*
*
O marcador de peso molecular
Comprado de uma empresa
Possui proteínas de peso molecular bem conhecido
Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra
*
*
Geis bidimensionais
Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois vira-se-o e corre-se em outra dimensão
Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra
Maiores géis dão maiores resolução
*
*
Proteínas não separadas podem ser quantificadas
Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa
Deve-se poder medir o produto da ação enzimática
Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC
*
*
Estrutura primária das proteínas
*
*
Níveis estruturais das proteínas
*
*
As estruturas primárias das proteínas são conhecidas
Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo
As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas
E principalmente dentro da mesma
*
*
Sequenciamento de peptídeos
Degradação de Edman
Marca e remove apenas o resíduo N-terminal
Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas
Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina
*
*
Produção de peptídeos
Purificação a partir de tecidos
Engenharia genética
Síntese química direta
*
*
Alinhamento de sequências
Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas)
Derivam do ancestral comum entre os organismos
O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína
*
*
Evolução molecular
Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente
*
*
Árvore molecular da vida
*
*
Conclusões
Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas
Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas ou milhares para formar peptídeos e proteínas
As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente
As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e afinidade e assim estudadas isoladamente –
cromatografia e eletroforese
As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida)
As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra