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1 Universidade Federal do Ceará Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem Departamento de Farmácia Curso de Farmácia ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS Pesquisa de Bactérias Gram Negativas no Leite de Saco Tipo A Disciplina: SH0927 - Microbiologia Básica e Aplicada Professor: Hélio Vitoriano Nobre Júnior Aluno: João Antônio, Pedro Nonato e Vinícius Serra Turma: 03A FORTALEZA 2016 2 Sumário INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 3 OBJETIVOS ................................................................................................................................. 4 MATERIAIS ................................................................................................................................. 4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ........................................................................................ 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................. 7 CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 7 ANEXOS....................................................................................................................................... 8 REFERÊNCIAIS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................... 9 3 INTRODUÇÃO Quase todos os alimentos que consumimos, estejam eles frescos, prontos ou em conserva, raramente são estéreis. Em vez disso, eles quase sempre se encontram contaminados com diversos microrganismos associados à deterioração dos alimentos e ocasionalmente com patógenos. Porém as atividades microbianas são essenciais para a produção de alguns alimentos, como os que são produzidos por processos de fermentação, tendo como exemplo pães, carnes para embutidos, queijos, vários laticínios, porém a maioria dos microrganismos encontrados são indesejados e diminuem a qualidade ou segurança do produto. Muitos alimentos fornecem um meio excelente para o crescimento de bactérias e fungos. Alimentos armazenados corretamente também podem sofrer deterioração, mas geralmente não constituem um veículo para a transmissão de doenças se estiverem inicialmente livres de patógenos. Isso se deve ao fato de que, com raras exceções, os organismos responsáveis pela deterioração dos alimentos não são os mesmos que desencadeiam as doenças alimentares. O leite de animais domesticados, objeto de análise microbiológica relatado no presente relatório é um dos componentes da base alimentar de muitos países e serve como precursor de numerosos laticínios, como a manteiga, o queijo, o iogurte, entre outros. As categorias de leite comercializadas no Brasil abrangem os tipos A, B e C, o tipo A corresponde a leite retirado pela ordenha mecânica que vai direto para um tanque, onde é aquecido até 72-75°C e depois resfriado imediatamente em aparelhagem a placas até temperatura igual ou inferior a 4°C, processo conhecido como pasteurização, onde toda a produção é feita na própria fazenda, com o mínimo de contato humano,. O tipo B assim como no leite tipo A, tem ordenha mecânica porém os processos de pasteurização e envasamento, podem ser feitos em fora da fazenda. No tipo C a ordenha é manual ou mecânica, o leite pode ser armazenado em tanques não refrigerados antes de seguir para o laticínio onde será pasteurizado e envasado, por estar sujeito a mais contaminação seus parâmetros de qualidade são menos rigorosos, porém visam manter a qualidade. O produto utilizado na análise microbiológica foi um leite tipo A da marca Maranguape acondicionado em embalagem plástica de saco, com o objetivo de constatar se o mesmo estava apto a consumo humano. Na literatura muitas bactérias de diferentes gêneros Streptococcus, Leuconostoc, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Proteus, Salmonella podem estar presente no leite e servir como parâmetro de qualidade para classificar o leite como seguro para consumo humano. 4 OBJETIVOS Realizar a análise microbiologia da amostra de leite tipo A da marca Maranguape, com o intuito de constatar sua qualidade e se a mesma preenche requisitos para consumo humano. MATERIAIS Bico de Bunsen Pipetas graduadas de vidro (1 mL) Tubos de ensaio Solução salina 0,75% Leite tipo A de saco Erlenmeyer Meio Àgar Plate Count Meio TSI Meio Hektoen Meio SIM Meio Àgar Citrato de Simmons Alça de Platina Agulha de Platina Placas de Petri PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL O procedimento experimental iniciou-se com o acendimento do bico Bunsen para que fosse criada uma área de esterilidade e o risco de contaminação das amostras fosse mínimo. Durante todo procedimento buscou-se trabalhar sempre atrás da chama e flambar alça e agulha de platina além das bocas dos tubos de ensaio antes e depois de semeá-los. Utilizando uma pipeta graduada transferiu-se 1 mL do leite para um dos tubos contendo 9 mL de solução salina 0,75%, em seguida a partir deste tubo mais concentrado (10-1) foram feitas sucessivas diluições da amostra em tubos semelhantes até que se criassem cinco concentrações da amostra de leite (10-1 ,10-2 ,10-3, 10-4, 10-5 ,10-6). 5 Para o plaqueamento utilizou-se apenas as soluções com concentrações intermediárias (10-2 à 10-5), descartando assim a solução mais concentrada (10-1) e a mais diluída (10-6). Em duplicata foi colocada uma alíquota de 1 mL de cada um dos tubos de ensaio em uma placa de petri. O meio ágar plate count é um meio nutrivo destinado à contagem de microrganismos, sendo utilizado principalmente no controle microbiológico de alimentos, à temperatura ambiente encontra-se solidificado, por isso foi necessário aquecê-lo em micro-ondas para que ele se tornasse liquido, após a realização desta etapa ele foi adicionado ainda quente a cada uma das placas, e após esta ação foi feito um movimento em forma de “oito” sobre a bancada com a placa para que houvesse homogeneização do meio na mesma. Por fim as placas devidamente identificadas foram levadas para a estufa onde permaneceram por 24 horas à 35 ± 2° C. Após o período de incubação as colônias de cada uma das placas foi contada e foi feito o cálculo para determinar o grau de contaminação de cada uma das concentrações: Fórmula: P1 + P2/ 2= Z P1:Placa 1 da concentração X P2:Placa 2 da concentração X O resultado obtido foi multiplicado pelo inverso do fator de diluição de cada uma das amostras e o grau de contaminação foi expresso em UFC/mL (unidades formadoras de colônia por mililitro). CONCENTRAÇÃO P1 P2 UFC/mL 10-5 < 30 < 30 - 10-4 < 30 < 30 - 10-3 < 30 < 30 - 10-2 49 150 9850 UFC/mL Como a concentração de 10-2 ela foi escolhida para o procedimento subsequente, neste utilizando uma alça de platina foi semeado colônias isoladas da amostra escolhida em meios: MacConkey, utilizado para detecção de bactérias Gram (-) em especial Enterobacteriaceae e Eschereshia coli, fermentadoras ou não de lactose; e meio Hektoen, 6 utilizado para identificação de Salmonella e Shingela, além de poder detectar microrganismos produtores de H2S (colônias com centro negro), microrganismos gram (+) não crescem nestemeio devido a mistura de sais biliares e corantes presente nele. Após semear as placas estas foram levadas para a estufa onde permaneceram por 24 horas à 35 ± 2° C. No dia seguinte foi observado se houve ou não crescimento nos meios de cultura, no meio MacConkey não houve alteração, já o Henktoen passou de sua cor verde escura e uniforme para uma cor mais amarronzada com várias camadas, presumiu-se então que houve crescimento de bactérias neste meio, este então foi utilizado para a última parte do procedimento experimental que consistia nas provas bioquímicas. Com o auxilio de uma agulha de platina foram semeadas alíquotas da possível cultura que havia crescido no meio Hektoen, em meios: SIM (Sulfeto Indol Motilidade), utilizado para avaliar a motilidade, produção de indol (em conjunto com reagente de Kovacs) e sulfeto; TSI (Tríplice Sugar and Iron) é um meio sólido distribuído em uma base de inclinação, é constituído de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas, aminoácidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de sódio e citrato férrico amoniacal (indicador da produção de H2S), com pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol; e Citrato de Simmons que consiste em um meio semi-sólido de base inclinada que possui azul de bromotimol como indicador, em pH entre 6,8 e 7 apresenta- se verde, a alcalinização do meio resulta em prova positiva provocada pela produção de oxalacetato e acetato pela enzima citratase, que faz com que o meio se torne azul. Ao fim das experimentações e traçando um paralelo entre os resultados foi possível avaliar se realmente havia algum tipo de contaminação na amostra e se sim, avaliar qual seria o microrganismo responsável por ela. 7 RESULTADOS E DISCUSSÃO Não foi observado crescimento microbiano em nenhum dos testes bioquímicos. Isso nos leva a pensar que o leite analisado encontrava-se sem contaminações, porém uma série de fatores pode ter induzido esse resultado: O meio Agar Plate count foi colocado numa temperatura muito elevada sobre a amostra de leite nas placas, o que poderia justificar o baixo crescimento microbiano. Como foi previamente dito, apenas uma das placas foi observado crescimento microbiano considerável (9.850 UFC/mL) Outro fator associado ao baixo crescimento microbiano foi a possível homogeneização inadequada do meio na placa. O pouco crescimento observado não foi pontual, podia ser obsevado na placa na forma de manchas ; Formação de grumos na primeira placa (10-5), isso se devido pois o meio já estava resfriando. Acreditou-se que a mudança no meio Hektoen entérico de verde para marrom fosse em decorrência do crescimento bacteriano. Mas como não foi observado crescimento de colônias nas provas bioquímicas, concluiu-se que a alteração na coloração do meio se deu pelo tempo que a placa passou na estufa (mais de 48h) e não pela proliferação de algum microrganismo CONCLUSÃO A amostra de leite apresentou uma carga bacteriana correspondente a 9.850 UFC/mL que está dentro do que preconiza a Instrução Normartiva nº 62 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (100.000 UFC/mL). Porém este resultado não é confiável haja vista, os erros enfrentados durante o procedimento experimental da análise. Seria recomendável refazer os testes para confirmar se este resultado é fidedigno. 8 ANEXOS Figura 1- Placa contendo o meio Àgar Plate Count com grumos Figura 2 – Meio Hektoen antes (à esquerda) e depois (à direita) da semeadura 9 REFERÊNCIAIS BIBLIOGRÁFICAS Disponível em: http://www.agricultura.gov.br/arq_editor/file/CRC/SENAR%20- %20Produ%C3%A7%C3%A3o%20de%20leite%20conforme%20IN%2062.pdf BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.– ANVISA. Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica, Brasília, 2004. BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.– ANVISA. Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos, Brasília, 2004. Michael T. Madigan; John M. Martinko; Kelly S. Bender; Microbiologia de Brock, 14 edição, artmed, 2016, cap.31, pág 909-911.
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