Apostila Microbiologia 2014-1

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Faculdade de Tecnologia de Jaboticabal 
 
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MICROBIOLOGIA 
 
 
 
 
 
Manual de Aulas Práticas 
 
 
Professora Dra. Mariana Carina Frigieri 
Farmacêutica-Bioquímica, Mestre/Doutora em Biotecnologia e Aprimoramento em 
Microbiologia 
 
Auxiliares docentes: 
• Flávia Roberta De Annunzio 
Tecnóloga em Biocombustíveis 
 
• Márcio Roberto de Carvalho 
Tecnólogo em Biocombustíveis 
 
 
 
 
Aluno (a): 
 
 
 
2014
 
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NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE 
MICROBIOLOGIA 
 
1. É indispensável o uso de avental no laboratório. O avental deve atender as 
normas estabelecidas pela CIPA e estar abotoado durante toda a aula; 
2. Cabelos compridos deverão estar amarrados para evitar contato com o fogo; 
3. Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; 
4. O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser 
mantido longe das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o 
material necessário ao trabalho prático, como: roteiro de aula, papel e lápis 
ou caneta para anotações; 
5. Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, 
ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente a 
professora ou a auxiliar docente responsável pela aula prática; 
 
1. Iniciando os trabalhos práticos: 
a) Colocar o avental e prender os cabelos; 
b) Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou detergente; 
c) Finalizar a lavagem aplicando etanol 70% líquido ou em gel; 
d) Limpar a bancada com etanol 70% líquido. 
 
6. Descarte de material: 
a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, 
existentes nos laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; 
b) Placas de petri deverão ser guardadas na estufa e as que serão 
descartadas devem ser deixadas tampadas sobre a bancada; 
c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser descartadas em 
recipientes apropriados e identificados; 
d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. 
 
2. Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes 
3. Terminados os trabalhos práticos: 
a) Esterilizar alças de inoculação; 
b) Limpar a bancada com etanol 70% líquido; 
c) Desligar lâmpadas e microscópios; 
d) Limpar a lente de maior aumento com etanol e cobrir os 
microscópios com a capa; 
e) Tirar o avental e guardar em uma embalagem apropriada. NUNCA 
usar o avental em outros ambientes; 
f) Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou detergente; 
g) Finalizar a lavagem aplicando etanol 70% líquido ou em gel. 
h) O avental deve ser transportado utilizando um saco plástico para 
diminuir a possibilidade de propagação de microorganismos. 
Também deve ser constatemente lavado. É interessante deixar um 
tempo em contato com água sanitária para maior desinfecção. 
 
TODOS DEVEM CONTRIBUIR PARA A MANUTENÇÃO 
DA ORGANIZAÇÃO E LIMPEZA DO LABORATÓRIO 
 
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PROGRAMAÇÃO SEMESTRAL DAS AULAS PRÁTICAS 
 
Data Prática Página 
23/01 P1. TÉCNICA DE LAVAGEM DAS MÃOS 4
23/01 P2. MICRO-ORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE E NO CORPO 
HUMANO – Parte I 
5
30/01 P3. MICRO-ORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE E NO CORPO 
HUMANO – Parte II 
6
30/01 P4. TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO – Parte I 8
06/02 P5. TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO – Parte II 11
06/02 P6. CADEIA DE TRANSMISSÃO 14
13/02 P7. TÉCNICA DE COLORAÇÃO SIMPLES 16
20/02 P8. TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM 19
27/02 P9. TESTE DO PAPEL HIGIÊNICO 22
27/02 P10 MICRO-ORGANISMOS DO SOLO – Parte I 24
06/03 P11. MICRO-ORGANISMOS DO SOLO – Parte II 25
13/03 P12. MICRO-ORGANISMOS DO CALDO DE CANA 26
13/03 P13. CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS NA ESCOVA 
DENTAL – Parte I 27
20/03 P14. CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS NA ESCOVA 
DENTAL – Parte II 
29
20/03 P15. PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS 31
27/03 P16. VERIFICAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO 32
27/03 P17. VIABILIDADE CELULAR E CULTIVO DE LEVEDURAS 33
27/03 P18. QUANTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS PELO SISTEMA 
PETRIFILM (3M) 
35
03/04 P19. ISOLAMENTO DE RHIZOBIUM A PARTIR DOS NÓDULOS 
VEGETAIS 36
10/04 P20. AGENTES FÍSICOS NO CONTROLE BACTERIANO: 
TEMPERATURA E LUZ UV 
38
17/04 P21. AGENTES QUÍMICOS NO CONTROLE BACTERIANO: ANTI-
SÉPTICOS E DESINFETANTES 
41
17/04 P22. ANTIBIOGRAMA ou TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO – Parte I 43
24/04 P23. ANTIBIOGRAMA ou TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO – Parte 
II 
44
24/04 P24. AVALIAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS NA ÁGUA – Parte I 45
08/05 P25. AVALIAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS NA ÁGUA - Parte II 46
15/05 P26. AVALIAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS NA ÁGUA - Parte III 47
22/05 P27. Discussão e retirada de dúvidas 
 
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PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS 
 
P1. TÉCNICA DE LAVAGEM DAS MÃOS (23/01) 
 
Material e Reagentes 
• Guache 
• Venda para os olhos 
 
Procedimento experimental 
Um aluno de cada grupo será escolhido para a realização desta prática. 
O aluno deve sair do laboratório e aguardar. 
Ao mesmo tempo será passada a instrução para os demais alunos como segue: 
• Inicialmente o aluno deverá ser vendado; 
• A seguir deve ser passado o guache em suas mãos; 
• Após isso o aluno deverá ser conduzido até a pia e proceder a 
lavagem como de costume; 
• Finalmente a venda deverá ser retirada e todos deverão observar se 
houve sobra da tinta na mão. 
 
Questões: 
 
1. O que aconteceu com após a lavagem da tinta? Por quê? 
 
 
2. Qual seria a maneira correta de lavar as mãos? 
 
 
3. Por que esse processo deve ser feito de forma minuciosa? 
 
 
4. Em quais situações a lavagem das mãos é imprescindível? 
 
 
 
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P2. MICRO-ORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE E NO CORPO HUMANO –
Parte I (23/01) 
 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• 2 Placas contendo ágar nutriente (AN) 
• 1 Swab estéril 
• Caneta para marcação 
 
Procedimento experimental 
Verificar os micro-organismos existentes no ambiente e em partes do corpo. 
-Identificar a placa1 (sempre pelo fundo,onde está o meio de cultura, pois a tampa 
pode virar e confundir a marcação) 
-abrir a placa sobre a bancada e deixá-la exposta por 30 minutos. 
- Dividir a placa 2 (no fundo) e identificar 
 
 Passar swab 
Grupo 1: bochecha internamente 
Grupo 2: entre os dedos dos pés 
Grupo 3: nariz 
Grupo 4: axila 
Grupo 5: orelha 
Grupo 6: umbigo 
Grupo 7: nuca 
Grupo 8: sombrancelha 
 
As placas serão incubadas 24 horas à 37ºC. 
 
Na próxima aula as colônias desenvolvidas serão verificadas e classificadas 
Controle 
 
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P3. MICRO-ORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE E NO CORPO HUMANO – 
Parte II (30/01) 
 
Material e Reagentes 
• Contador manual 
• Caneta para marcação 
• Suporte escuro (preto ou azul) para facilitar a visualização 
Procedimento experimental 
Verificar as colônias crescidas na placa 1 e fazer a contagem do número de 
colônias (UFC- Unidades Formadoras de Colônias) de bactérias e de fungos 
utilizando o contador manual. Após isso, utilizando o microscópio esterioscópico 
classificar as colônias de acordo com o modelo abaixo e completar a tabela 
anotando o tamanho, cor, forma, margem e elevação de 3 tipos diferentes de 
colônias (se houver). 
 
Tabela: 
COLÔNIA COR TAMANHO FORMA MARGEM ELEVAÇÃO 
1 
23 
 
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P3. MICRO-ORGANISMOS NO MEIO AMBIENTE E NO CORPO HUMANO 
 
Questões: 
 
1) O que aconteceu com a placa 1, após 30 minutos de exposição ao ar e após 
o período de incubação? 
 
 
 
2) Qual foi o número total de colônias (UFC- Unidades Formadoras de 
Colônias) obtidas na placa 1? É possível separar as colônias de bactérias e de 
fungos? Qual foi a quantidade de cada uma? 
 
 
 
3) E com a placa 2 após a incubação, contendo micro-organismos do corpo? 
 
 
 
4) Por que os micro-organismos conseguem crescer em meio de cultura? 
 
 
 
5) Por que as placas são incubadas em temperatura controlada? Qual é essa 
temperatura? Por quê? 
 
 
 
 
 
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P4. TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO - Parte I (30/01) 
 
Introdução 
Para todo trabalho microbiológico há a necessidade de fazermos inoculações de 
micro-organismos, para testes ou simplesmente para manutenção. A inoculação 
pode ser feita em meio líquido, semi-sólido e em meio sólido. A inoculação em 
meio sólido pode ser por espalhamento, utilizando alça de Drigalski, por inclinação 
com movimentação da placa e por esgotamento fazendo riscos utilizando a alça de 
inoculação. 
 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• Placa de agar nutriente contendo crescimento bacteriano da aula anterior 
• Alça de inoculação 
• 2 placas de agar nutriente (AN) 
• 1 tubo com caldo nutriente 
• Etanol 70% 
• Caneta para marcação 
• 1 tubo meio semissólido 
• Agulha de inoculação 
 
Parte A: Inoculação por esgotamento 
Inicialmente, deve-se proceder a flambagem da alça de inoculação 
Esgotamento 
 
Com a alça de inoculação podemos fazer um inoculo continuo (geralmente quando 
queremos somente fazer a manutenção ou aumentar o número de micro-
 
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organismos) ou um inóculo por quadrante (para isolarmos as colônias, isso é muito 
importante para verificarmos se uma cultura não está contaminada). 
 
 
 
Todos os procedimentos devem ser feitos próximo à chama para evitar 
contaminações 
- Limpar a bancada com etanol 70% 
- Ligar a chama 
 - Você deve escolher duas colônias obtidas na aula anterior para proceder a 
inoculação por esgotamento contínuo e por quadrante. 
- Esterilizar e esfriar a alça na parte interna da placa contendo a cultura 
sólida 
- Pegar uma pequena quantidade da cultura e inocular em uma placa de AN 
pelo método de espalhamento por quadrante e na outra pelo método contínuo 
 
 
 
 
 
 
 
 
- Esterilizar e esfriar novamente a alça 
Cultura sólida 
Alça - 
estéril 
Placa de NA 
 
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Parte B: Inoculação de meio sólido para meio líquido 
 
- A seguir, você deve escolher mais uma colônia da placa anterior para 
proceder a inoculação do meio sólido para o meio líquido 
- Esterilizar e esfriar a alça na parte interna da placa contendo a cultura 
sólida 
- Pegar uma pequena quantidade da cultura e inocular em um tubo com 
caldo nutriente 
 
 
 
 
 
 
- Esterilizar a alça e deixá-la na estante dos tubos 
 
Parte C: Inoculação de meio sólido para meio semissólido 
- Mais uma colônia da placa anterior deverá ser escolhida para proceder a 
inoculação do meio sólido para o meio semissólido, com o objetivo de verificar 
movimentação bacteriana. Para essa inoculação usa-se a agulha de inoculação. 
- Esterilizar e esfriar a agulha na parte interna da placa contendo a cultura 
sólida 
- Pegar uma pequena quantidade da cultura e inocular verticalmente em um 
tubo com meio semissólido. 
 
 
 
 
 
 
 
- Esterilizar a agulha e deixá-la na estante dos tubos 
Identificar as placas e os tubos, os quais serão incubados 24 horas à 37ºC. 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
Cultura sólida 
Alça 
Caldo nutriente 
Cultura sólida 
Agulha 
Meio semissólido (Meio SIM) 
 
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P5. TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO – Parte II (06/02) 
 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• Tubo contendo crescimento bacteriano da aula anterior 
• Alça de Drigalski 
• Béquer com etanol absoluto 
• Copo descartável para descarte das ponteiras 
• 1 placas de agar nutriente (AN) 
• 1 tubo com caldo nutriente 
• 1 tubo com agar inclinado 
• Micropipeta com ponteiras 
• Etanol 70% 
• Caneta para marcação 
 
Parte A: Inoculação por espalhamento 
 
 
 
 
 
 
 
 
- Esterilizar a parte superior do tubo da aula anterior, contendo o 
crescimento bacteriano 
- Abri-lo corretamente próximo à chama 
- Inocular 0,2 mL da cultura líquida em uma placa de AN 
- Esterilizar a alça de Drigalski na chama após imergi-la em etanol absoluto. 
Muito cuidado nesta etapa. 
-Esfriar a alça na tampa da placa e proceder o espalhamento da cultura. 
 
 
 
 
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Parte B: Inoculação do meio líquido para o meio sólido 
 
- Esterilizar a alça de inoculação na chama 
- Esfriá-la na parte interna do tubo 
- Inocular a cultura líquida (verificar a formação de um filme na ponta da 
alça de inoculação) em uma placa de AN pelo método de espalhamento contínuo 
 
 
 
 
 
 
 
 
- Esterilizar a alça novamente 
 
 
Parte C: Inoculação do meio líquido para outro meio líquido 
 
- Esterilizar e esfriar novamente a alça 
- Inocular a cultura líquida em um tubo com caldo nutriente 
 
 
 
 
 
 
 
- Esterilizar a alça e deixá-la na estante dos tubos 
 
Identificar as placas e os tubos, os quais serão incubados 24 horas à 37ºC. 
 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
 
 
Cultura líquida 
Alça 
Caldo nutriente 
Cultura líquida 
Alça - 
contínuo 
Placa de AN Agar inclinado 
ou 
 
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P5. TÉCNICAS DE INOCULAÇÃO 
 
Questões: 
1) Quais os cuidados que devem ser tomados durante um processo de 
inoculação? 
 
 
 
2) Foram obtidas colônias isoladas? 
 
 
 
3) Como você reconhece o crescimento bacteriano em meio líquido? 
 
 
 
4) Qual é a importância da flambagem da alça de inoculação? 
 
 
 
5) Para que serve a alça de Drigalski? Como ela é esterilizada? 
 
 
 
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P6. CADEIA DE TRANSMISSÃO (06/02) 
 
Introdução 
Os micro-organismos, particularmente os patogênicos, podem estar dispersos na 
população e sua transmissão pode se dar por contato direto, por gotas ou aerossóis, 
insetos etc. Uma via freqüente de transmissão por contato direto é mediada pelo 
“aperto de mãos” inadequadamente limpas. 
 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• 2 Placa de agar nutriente (AN) 
• Etanol 70% 
• Caneta para marcação 
 
Procedimento experimental 
 
Inicialmente, as placas deverão ser dividida em 2 metades da seguinte 
forma: 
 
 
 
 
 
 
 
A seguir, um membro do grupo deve lavar muito bem as mãos com água e 
sabão, removendo os micro-organismos mecanicamente. 
Um dos dedos deve ser passado imediatamente após a lavagem em uma das 
placas de cultura no lado marcado como ML (Mão lavada). Então, essa mesma 
pessoa passa a apertar as mãos dos outros membros do grupo e colegas. Após isso,deve ser passado o mesmo dedo no lado marcado como MP (Mão após contato 
pessoal). 
ML MP ML MS 
Placa 1 Placa 2 
 
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Outro membro do grupo deve proceder a lavagem das mãos como descrito 
anteriormente e um dos dedos deve ser passado imediatamente na outra placa de 
cultura no lado marcado como ML (Mão lavada). Agora, essa mesma pessoa deve 
colocar a mão em contato com alguma superfície, como maçaneta, torneira, 
bebedouro, entre outras. Então, deve ser passado o mesmo dedo no lado marcado 
como MS (Mão após contato com superfície). 
 
Identificar a placa, a qual será incubada 24 horas à 37ºC. 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
 
Questões: 
1) Qual foi o objetivo desta prática? 
 
 
 
 
 
2) O que você observou na placa após a incubação? 
 
 
 
 
 
3) Qual foi a sua conclusão? 
 
 
 
 
 
 
 
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P7. TÉCNICA DE COLORAÇÃO SIMPLES (13/02) 
As técnicas de coloração são extremamente úteis reconhecimento e na identificação 
de micro-organismos. A coloração pode ser simples, para diferenciar os micro-
organismos do meio, ou podem ser diferenciais, as quais auxiliam na identificação 
dos micro-organismos entre si. 
 
Material e Reagentes 
• Placas ou tubos contendo crescimento bacteriano 
• Reagentes para coloração: azul de metileno, fucsina 
• Palitos de sorvete 
• Lâminas e lamínulas 
• Microscópio 
• Óleo de imersão 
• Éter ou etanol para a limpeza das lentes do microscópio 
• Caneta para marcação 
• Béquer para descarte das lâminas e lamínulas 
 
Procedimento experimental 
Preparação do esfregaço 
- Lâmina 1: Colocar uma gota de solução de azul de metileno . 
 Esterilizar a alça de inoculação 
 Coletar uma pequena quantidade de bactéria e espalhar na 
gota do corante fazendo movimentos elípticos. 
 Cobrir com uma lamínula e observar 
- Lâmina 2: Colocar uma gota de azul de metileno ou fucsina na lâmina 
Coletar as células da mucosa bucal com um palito de sorvete 
e espalhar as células obtidas na gota do corante com o auxílio do 
palito 
Cobrir com uma lamínula e observar 
 
 
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Observação ao microscópio 
1. ligar o microscópio 
2. abaixar totalmente a mesa 
3. encaixar a lâmina no suporte 
4. colocar na objetiva de menor aumento (2X ou 4X) 
5. focar usando o botão macrométrico 
6. melhorar o foco usando o botão micrométrico 
7. mudar de aumento focando sempre com o micrométrico 
8. antes de focar com o aumento de 100X, colocar uma gota de óleo de 
imersão 
9. focar com o micrométrico 
 
Após a visualização: 
- abaixar totalmente a mesa 
- retirar a lâmina 
- limpar a objetiva de 100X com etanol ou éter 
- deixar na objetiva de menor aumento 
- desligar o aparelho e cobrí-lo 
- descartar as lâminas utilizadas em recipiente adequado 
 
 
 
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P7. TÉCNICA DE COLORAÇÃO SIMPLES 
 
Questões: 
 
1) Por esse método de coloração micro-organismos são fixados na lâmina? 
Qual a vantagem deste processo? 
 
 
 
2) Qual foi a diferença observada entre as duas amostras? 
 
 
 
3) Você conseguiu focalizar facilmente? Por quê? 
 
 
 
4) Onde as lâminas foram descartadas? Qual reagente havia? 
 
 
 
 
 
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P8. TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM (20/02) 
 
Introdução 
Nesta técnica o esfregaço bacteriano é tratado com reagentes capazes de dividir as 
bactérias em dois grandes grupos: as Gram positivas e as Gram negativas. 
 
Material e Reagentes 
• Placa contendo crescimento bacteriano 
• Reagentes para coloração de gram e etanol absoluto 
• Pinças de madeira 
• Lâminas 
• Microscópio 
• Óleo de imersão 
• Éter ou etanol para a limpeza das lentes do microscópio 
• Caneta para marcação 
• Béquer para descarte das lâminas 
 
Procedimento experimental 
 
Preparação do esfregaço 
Inicialmente, identifique a lâmina 
 A seguir, prepare o esfregaço bacteriano: 
- colocar uma gota de soro fisiológico ou água destilada sobre a lâmina 
- distender a cultura bacteriana com movimentos elípticos (esfregaço) 
-deixar o esfregaço secar próximo à chama 
-fixar o esfregaço à lâmina passando o verso desta por 3 à 5 vezes sobre a 
chama 
 
Coloração do esfregaço bacteriano pelo método de Gram 
- cobrir o esfregaço som a solução de cristal violeta por 1 minuto. 
- desprezar o corante e lavar a lâmina com água corrente (não deixar que o 
jato de água incida diretamente sobre o esfregaço) 
 
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- cobrir o esfregaço com a solução de lugol (iodo + iodeto de potássio) por 
1 minuto 
- desprezar o corante e lavar a lâmina com água corrente 
- cobrir o esfregaço com a solução de descorante (etanol ou acetona) por 
alguns segundos e desprezar 
- lavar a lâmina com água corrente 
- cobrir o esfregaço com a solução de contracorante (safranina ou fucsina) 
por 30 segundos 
-desprezar o contracorante e lavar a lâmina com água corrente 
- secar a lâmina e observar ao microscópio óptico 
 
 
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P8. TÉCNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM 
 
Questões: 
 
1) Qual é a importância das colorações diferenciais? 
 
 
 
2) Por que as bactérias se coram de maneira diferente pelo método de gram? 
 
 
 
3) Por que não há necessidade do uso de lamínula? 
 
 
 
4) Neste tipo de coloração é possível observar bactérias vivas? Por quê? 
 
 
 
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P9. TESTE DO PAPEL HIGIÊNICO (27/02) 
 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• 1 Placa de meio AN (agar nutriente) 
• 1 par de luvas 
• Papel higiênico (PH) 
• Placa contendo crescimento de bacteriano 
• Caneta para marcação 
• Local adequado para descarte das luvas e do PH contaminado (saco 
plástico) 
 
Procedimento experimental 
 
Inicialmente, a placa deverá ser dividida em 2 metades as quais deverão ser 
identificadas da seguinte forma: 
 
 
 
 
 
Um membro do grupo deve colocar as luvas e envolver um dos dedos com 
papel higiênico 
- tocar a placa contendo crescimento bacteriano 
- descartar o papel higiênico em um recipiente adequado (Não retirar as 
luvas!!!) 
- o dedo deve ser passado na placa de cultura no lado marcado como antes. 
- lavar a mão, sem retirar as luvas, simulando uma lavagem comum de 
quando vai ao banheiro 
- passar o mesmo dedo no lado marcado como depois. 
-descartar as luvas no local apropriado 
Identificar a placa, a qual será incubada 24 horas à 37ºC. 
 Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
Antes Depois 
 
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P9. TESTE DO PAPEL HIGIÊNICO 
 
Questões: 
1) Qual foi o objetivo desta prática? 
 
 
 
 
2) Por que foi preciso usar luvas? 
 
 
 
 
3) A E. coli é um dos principais micro-organismos intestinais. O que ela 
pode causar? 
 
 
 
 
4) Qual seria o resultado esperado? 
 
 
 
 
 
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P10. MICRO-ORGANISMOS DO SOLO I (27/02) 
 
Material e Reagentes 
• 2 copos descartáveis 
• Espátulas 
• Seringa 
• Caneta para marcação 
• Soluçãode glicose a 1% com de nitrato de amônio (NH4NO3-200mg) 
 
Procedimento experimental 
- Coletar o solo a ser analisado; 
- Completar até 2 dedos abaixo da superfície do copo descartável; 
- Umedecer o solo com a solução glicose/nitrato de amônio preparada, adicionando 
pequenas quantidades de cada vez até obter saturação e mexer com uma espátula; 
- Espetar verticalmente 2 lâminas de vidro dentro do solo, deixando 2 cm de fora; 
- Cobrir os copos com filme plástico e furar várias vezes para permitir a entrada de 
ar e ao mesmo tempo impedir a evaporação excessiva; 
- Incubar à temperatura ambiente durante uma semana. 
 
 
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 P11. MICRO-ORGANISMOS DO SOLO - Parte II (06/03) 
 
Material e Reagentes 
• Papel toalha 
• Recipiente com ácido acético a 40% 
• Azul de metileno 
• Microscópio 
 
Procedimento experimental 
- Remover as lâminas do solo, de forma que se possam retirar sem que a face 
superior seja perturbada; 
- Bater gentilmente com a lâmina na borda do copo de forma que saia a maioria do 
solo aderido; limpar a superfície inferior da lâmina com papel toalha úmido e 
deixar secar ao ar; 
- Com cuidado para não tocar com os dedos, colocar a lâmina de vidro dentro de 
ácido acético a 40% durante 1-3 minutos; 
- Lavar o excesso de ácido debaixo de água corrente (sem muita pressão para que 
os micro-organismos aderidos não sejam removidos); 
- Usando um conta-gotas cobrir a superfície com corante azul de metileno 5 
minutos sem deixar a lâmina secar; 
- Lavar delicadamente a lâmina com água corrente, secar e observar no 
microscópio; 
- Descrever o tamanho e a forma das células, tentando distinguir vários tipos de 
micro-organismos. 
 
Questões: 
1) Por que houve a necessidade de colocar glicose no solo coletado? 
 
 
2) Qual é a função do nitrato de amônio (NH4NO3)? 
 
 
3) O que você observou no microscópio? 
 
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P12. MICRO-ORGANISMOS DO CALDO DE CANA (13/03) 
 
Material e Reagentes 
• Alça de inoculação 
• 2 placas de ágar nutriente 
• Caneta para marcação 
• Tubos cônicos contendo caldo de cana: 
o Contaminado (CCont) 
o Sem contaminação (SC) 
o Caldo clarificado (CClarif) 
o Caldo filtrado (CF) 
 
Procedimento experimental 
 
- Dividir e identificar as placas de AN para cada tubo 
 
 
 
 
 
 
- Com o auxilio de uma alça, proceder as inoculações 
As placas serão incubadas à 37°C por 48 horas. 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
 
Questões: 
 
1) Houve diferença de crescimento? 
 
 
2) O que você conclui com esses dados? 
 
CCont SC CClarif CF 
Placa 1 Placa 2 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
27
P13. CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS NA ESCOVA DENTAL- Parte I 
(13/03) 
 
Material e Reagentes 
• Escova de dentes 
• Tubo cônico 50mL com caldo nutritivo 
• Micropipetas, ponteiras e descarte para ponteiras 
• 5 tubos de ensaio contendo 9mL de solução salina 
 
Procedimento experimental 
Inicialmente os tubos contendo solução salina e as placas deverão ser 
identificados como 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 e 10-5. Após isso, realizar o processo como 
segue: 
 
1. Mergulhar a escova dental no tubo com caldo nutritivo estéril (trabalhe 
próximo à chama do Bico de Bunsen). 
2. Agite a solução por 1 minuto. 
3. Retire a escova. 
4. Faça a diluição, retirando, com auxílio de uma micropipeta, 1mL da 
solução e transferindo para um tubo contendo 9 mL de solução salina. 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
28
5. Agite bem o tubo. 
6. Repita os procedimentos 4 e 5 para cada nova diluição sempre utilizando 
1 mL da última solução preparada, e não esquecendo de a cada nova 
diluição utilizar uma nova ponteira. 
7. Após concluir todas as diluições, retire 0,1 mL da solução com diluição 
de 10-1. 
8. Espalhe por toda a superfície da placa de ágar, utilizando a alça de 
Drigalski. 
9. Repita os procedimentos 7 e 8 para as outras diluições de 10-2, 10-3, 10-4 e 
10-5. 
10. Incubar as placas à 37°C por 48 horas. 
 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
29
P14. CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS NA ESCOVA DENTAL- Parte 
II (20/03) 
 
Material e Reagentes 
• Contador manual 
• Placas da aula anterior 
• Suporte escuro (preto ou azul) para facilitar a contagemTubo cônico 50mL 
com caldo nutritivo 
• Reagentes para a coloração de Gram 
• Alça de inoculação 
• Frasco contendo água destilada 
• Microscópio 
• Óleo de imersão 
• Béquer para descarte de lâminas 
• Caneta para marcação 
 
Procedimento experimental 
Análise dos Resultados 
1- Análise quantitativa: 
O objetivo desta análise é determinar o número de bactérias por mL, para isso: 
- Selecione uma das placas incubadas, que contenha entre 25 e 250 colônias; 
- Conte o número de colônias, com o contador manual; 
- Calcule, no espaço abaixo reservado, a quantidade de micro-organismos 
utilizando a seguinte fórmula: 
 
* UFC significa Unidade Formadora de Colônia, uma 
vez que a contagem feita é referente às colônias e 
não às células presentes. 
** 10 é um fator de correção. 
 
EXEMPLO: 
 Se são contadas 105 colônias em uma placa onde foi feita 
diluição de 10-2 , o cálculo final será: 
 
 UFC= 105 x 10 x 102 = 1,05 x 105 UFC/ml 
 
UFC* = (nº de colônias) x 10** x (diluição utilizada para contagem) 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
30
2- Análise qualitativa dos micro-organismos através do método de Gram. 
 
O objetivo desta análise é verificar o tipo de micro-organismos presentes segundo: 
forma, arranjo e reação tintorial (Gram positivo ou Gram negativo). 
 
- Com a alça esterilizada colete uma colônia e faça o esfregaço com o auxílio de 
uma gota de água destilada; 
- Fixar, proceder a coloração e observar no microscópio óptico. 
 
Questões: 
 
1- Calcule a quantidade de micro-organismos (UFC), seguindo as instruções da 
Análise Quantitativa, dos cultivos feitos a partir de micro-organismos da escova 
dental. 
 
 
 
2- O que se pode concluir a respeito da quantidade de micro-organismos 
encontrados na escova dental ? 
 
 
 
3- Utilizando o método de Gram, quais os tipos bacterianos foram 
predominantemente observados dentre os micro-organismos encontrados na 
escova dental? 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
31
P15. PESQUISA DE PRODUTOS NATURAIS ANTIBACTERIANOS (20/03) 
Material e reagentes 
• Placas de ágar nutriente (AN); 
• Alho, cebola e outros vegetais de interesse já preparados (amassados); 
• Swab; 
• Discos de papel de filtro; 
• Culturas bacterianas a serem testadas 
 
Procedimento experimental 
1. Dividir a placa em quatro partes 
2. Mergulhar o Swab na suspensão do micro-organismo; 
3. Espalhar sobre a superfície do meio de forma homogênea com o 
próprio Swab embebido na cultura; 
4. Embeber os discos de papel de filtro nos vegetais preparados e 
colocá-los sobre a superfície do meio semeado como no esquema: 
 
 
 
 
 
5. Incubar a 37°C por 2 ou 3 dias e observar os halos de inibição. 
 
Questões: 
1) Quais foram os vegetais testados? 
 
2) A sua cultura ficou homogênea? Por quê? 
 
3) Foi possível verificar a presença de halos após o período de incubação? 
 
4) Qual foi o resultado obtido? 
 
5) O que você pode concluir?________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
32
P16. VERIFICAÇÃO DO PROCESSO FERMENTATIVO (27/03) 
 
Material e reagentes 
 
• Saquinhos de sorvete. 
• Balança 
• Açúcar cristal e refinado 
• Fermento biológico (200g de levedura para 12 grupos) 
• Água morna 
• Seringa 10mL 
 
Procedimento experimental 
 
• Identificar 3 saquinhos e prepara-los como segue 
 
1° saquinho: Adicionar 5g de fermento e 10mL de água morna (30°C) 
2° saquinho: Adicionar 5g de açúcar cristal, 5g de fermento e 10mL de água morna 
3° saquinho: Adicionar 5g de açúcar refinado, 5g de fermento e 10mL de água 
morna 
 
A seguir colocar os saquinhos em um béquer com água e incuba-los à 30°C 
Observar os resultados 
 
 
Questões: 
 
1) Qual foi o objetivo desta prática? 
 
 
 
2) O que você observou após o período de incubação? 
 
 
 
3) O que você pode concluir? 
 
 
 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
33
P17. VIABILIDADE CELULAR E CULTIVO DE LEVEDURAS (27/03) 
 
Introdução 
Neste trabalho utilizamos a levedura Saccharomyces cerevisiae e verificamos a 
viabilidade celular pelo emprego do corante azul de metileno e posterior 
visualização microscópica. Leveduras vivas não são coradas e as leveduras mortas 
passam a apresentar a coloração azul. 
 
Material e Reagentes 
• Placa contendo crescimento de Saccharomyces cerevisiae, fermento ou 
outras fontes de levedura 
• Lâminas 
• Lamínulas 
• Azul de metileno 0,1% 
• Microscópio 
• Óleo de imersão 
• Etanol ou éter para a limpeza das lentes 
• Placa de YPD 
• tubo contendo caldo de cana ou meio YPD líquido 
 
Procedimento experimental 
Parte A: Viabilidade 
- colocar uma gota de azul de metileno sobre a lâmina 
- distender a cultura com movimentos elípticos (esfregaço) 
-colocar a lamínula sobre o esfregaço e fazer a visualização utilizando o 
microscópio óptico. 
 
Parte B: Cultivo 
- Próximo à chama coletar uma alça de levedura e proceder a inoculação em 
meio YPD sólido e tubo contendo caldo de cana ou meio YPD líquido; 
- Identificar a placa e o tubo, os quais deverão ser incubados 24 horas à 
30ºC. 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
34
P17. VIABILIDADE CELULAR E CULTIVO DE LEVEDURAS 
 
Questões: 
 
1) O que são leveduras? 
 
 
 
 
2) Como elas se multiplicam? 
 
 
 
 
3) Esquematize a reprodução por acasalamento? 
 
 
 
 
4) O que é necessário para que ocorra a reprodução por acasalamento? 
 
 
 
 
5) Por que as leveduras vivas e mortas se coram de maneira diferente? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
35
P18. QUANTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS PELO SISTEMA PETRIFILM (3M) 
(27/03) 
 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• Crescimento de leveduras em caldo de cana ou em meio YPD líquido 
• Microtubos 
• Estante para microtubos 
• Frasco com solução salina 
• Micropipetas, ponteiras e descarte para ponteiras 
• Sistema Petrifilm para quantificação de leveduras 
• Difusor 
• Caneta para marcação 
 
Procedimento experimental 
Colocar na estante 3 microtubos e identificar como 10-1, 10-2 e 10-3. 
Proceder a diluição, retirando, com auxílio de uma micropipeta, 0,1mL da 
solução e transferindo para um microtubo contendo 0,9 mL de solução salina. 
Agitar bem o microtubo e fazer nova diluição utilizando 0,1 mL da última 
solução preparada até chegar na diluição 10-3 não esquecendo de a cada nova 
diluição utilizar uma nova ponteira. 
Após concluir todas as diluições adicionar todo o conteúdo da diluição de 
10-3 Sistema Petrifilm com o auxílio da micropipeta e fazer o espalhamento com o 
difusor. 
As placas deverão ser incubadas à 30°C por 48 horas. 
 
Os resultados serão visualizados na próxima aula na qual deverá ser 
feita a contagem das colônias. 
 
Questões: 
1) Qual é a vantagem em utilizar sistemas de meio de cultura prontos como o 
Petrifim? 
 
 
2) Quantas colônias por mL você obteve? 
 
 
 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
36
P19. ISOLAMENTO DE RHIZOBIUM A PARTIR DOS NÓDULOS VEGETAIS 
(03/04) 
 
Material e Reagentes 
• -Microscópio 
• -Lâminas e lamínulas 
• -Placas de Petri estéreis 
• -Alça de inoculação 
• Pinça 
• Béquer ou tubo cônico 
• Tesoura 
• Etanol 70% 
• -Água esterilizada distribuída em tubos com 20mL 
• -Solução de NaOH 1% 
• -Placas com Agar de Manitol-levedura 
• Placas com Agar de Manitol-levedura + vermelho do Congo 
• Placas com Agar de Manitol-levedura + azul de Bromotimol 
• Caneta para marcação 
 
Procedimento experimental 
Cortar com uma tesoura várias partes da raiz de 1cm que contenham 
nódulos saudáveis (rosa); 
Mergulhar dentro de um béquer ou tubo cônico com NaOH1%, durante 15 
min.; 
Retirar da solução e mergulhar em 20 ml de etanol a 70% durante 1 min.; 
Retirar as do etanol e mergulhar em 20 ml de água estéril durante 1 min.; 
Repetir as lavagens com água estéril pelo menos 3 vezes; 
Transferir um dos nódulos para uma placa de Petri estéril e esmagar com 
um bastão vidro estéril; 
Observar o líquido extraído ao microscópio; 
Semear em uma placa de Petri com meio de Manitol levedura; e no meio 
Manitol mais os corantes. 
Incubar as placa de Petri a 25˚C durante 3 a 5 dias. 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
37
Os resultados serão visualizados na próxima aula na qual deverá ser 
feita a contagem das colônias. 
 
Questões: 
1) Descrever ou desenhar as formas das células observadas ao 
microscópio diretamente do nódulo; 
 
 
 
 
2) Registar as características das colônias formadas no meio de 
manitol levedura simples e com adição dos indicadores - 
vermelho do Congo e azul de Bromotimol; 
 
 
 
Agar de Manitol-levedura 
• Fosfato de potássio .................................... 0,5 g 
• Sulfato de magnésio .................................. 0,2 g 
• Cloreto de sódio ........................................ 0,1 g 
• Manitol ..................................................... 10 g 
• Extracto de levedura ................................. 0,4 g 
• Agar ........................................................ 15 g 
• Água destilada ..................................... 1000 mL 
Acertar a pH 6,8-7,0. 
Adicionar os corantes Vermelho do Congo (1%) ou Azul de 
Bromotimol (0,5%) 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
38
P20. AGENTES FÍSICOS NO CONTROLE BACTERIANO: TEMPERATURA E 
LUZ UV (10/04) 
 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• Banho-maria 
• Pinças de madeira 
• 2 Placa de agar nutriente (AN) 
• Alça de inoculação 
• Tubo de vidro contendo crescimento bacteriano 
• Autoclave 
• 2 tubos contendo caldo nutriente (CN) 
• Pinça de metal 
• Tesoura 
• Papel toalha, madeira, plástico, pano etc 
• Caneta para marcação 
• Relógio – Timer 
• Suporte para tubos na autoclave 
• Fluxo laminar 
 
Procedimento experimental 
Parte A: 
Inicialmente, dividir o fundo da placa de AN em quatro partes e marcar 
tempo 0, 5, 15 e 30 minutos, de acordo com o esquema abaixo: 
A seguir, inocular o crescimento bacteriano com alça de inoculação na parte 
da placa identificada como 0 (tempo zero). 
Após isso, colocar o tubo com o crescimento bacteriano em banho-maria à 
100ºC e marcar o tempo. Fazer inóculos após 5, 15 e 30 minutos como realizado 
anteriormente. Ao final do processo a placa deve serincubada 48 horas à 37ºC. 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
39
 
 
 
 
 
 
Parte B: 
Inicialmente, marcar os tubos de ensaio como A e E. 
A seguir, colocar um fio de cabelo sobre o papel toalha e dividir em duas 
partes com o auxílio de uma tesoura. Próximo à chama, inocular uma parte em cada 
tubo utilizando uma pinça. 
Após isso, colocar o tubo (E) na estufa e o tubo (A) na autoclave e proceder 
o processo de autoclavação. Finalmente colocar o tubo (A) também na estufa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Os tubos devem ser incubados 48 horas à 37ºC. 
 
Parte C: 
Inicialmente, dividir uma placa de ágar nutriente ao meio marcar com UV e 
sem UV. 
A seguir, colocar placa em fluxo laminar aberta e cobrir a parte sem UV 
(folhas de papel toalha, plástico, madeira, pano etc e deixar por 15 minutos. Fechar 
a placa e incubar 48 horas à 37ºC. 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
0 min 5 min 
15 min 30 min 
Fio de 
cabelo 
Estufa 
Parte 1 
Parte 2 
A 
E 
Autoclave 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
40
P20. AGENTES FÍSICOS NO CONTROLE BACTERIANO: 
TEMPERATURA E LUZ UV 
 
Questões: 
1) Por que o aquecimento do crescimento bacteriano foi feito em 
banho-maria? 
 
 
 
 
2) Por que foi utilizada a temperatura de 100ºC? 
 
 
 
 
3) O que aconteceu com o crescimento bacteriano em relação ao 
tempo de exposição à alta temperatura? 
 
 
 
 
4) O que ocorreu com os tubos (A) e (E)? Por quê? 
 
 
 
 
5) O que ocorreu com a placa exposta a luz UV? Por quê? Qual 
material você utilizou para cobrir a placa? 
 
 
 
6) A que conclusão você chegou? 
 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
41
 P21. AGENTES QUÍMICOS NO CONTROLE BACTERIANO: ANTI-
SÉPTICOS E DESINFETANTES (17/04) 
 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• Desinfetantes e anti-sépticos (lysoform, etanol 70%, iodo, enxágüe bucal e 
outros produtos que pretendam testar) 
• 1 Placa de agar nutriente (AN) 
• Alça de Drigalski 
• Béquer com etanol absoluto 
• Copo descartável para descarte de ponteiras 
• Micropipeta com ponteiras 
• Pinça estéril e Caneta para marcação 
• Discos de Papel estéreis 
• Tubo contendo crescimento bacteriano 
 
Procedimento experimental 
Inicialmente, inocular a placa de agar nutriente com 0,2mL de cultura 
líquida pelo método de inclinação com movimento ou por espalhamento utilizando 
alça de Drigalski. Esperar secar!!! 
A seguir, a placa deverá ser dividida em 4 partes, as quais deverão ser 
identificadas com o nome do reagente a ser testado 
Após isso, os discos de papel deverão ser coletados um a um com o auxílio 
de uma pinça estéril e embebidos no anti-septico ou desinfetante a ser testado. Os 
discos devem ser colocados sobre a placa inoculada e deve ser feita uma leve 
pressão com a pinça, para garantir que o disco fixe bem. Entre um disco e outro a 
pinça deve ser passada na chama e esfriada. 
 
 
 
 
Identificar a placa, a qual será incubada 24 horas à 37ºC. 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
42
P21. AGENTES QUÍMICOS NO CONTROLE BACTERIANO: ANTI-
SÉPTICOS E DESINFETANTES 
 
Questões: 
1) Quais foram os reagentes testados? 
 
 
 
 
 
2) Quais foram os resultados observados? 
 
 
 
 
3) A que conclusão você chegou? 
 
 
 
 
 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
43
P22. ANTIBIOGRAMA ou TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO I (17/04) 
 
Introdução 
O antibiograma é um método útil para avaliar a sensibilidade bacteriana à diversas 
drogas. 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• 1 Placa de agar nutriente (AN) 
• Alça de Drigalski 
• Micropipeta com ponteiras 
• Béquer com etanol absoluto 
• Copo descartável para descarte de ponteiras 
• Pinça estéril 
• Discos de antibióticos 
• Placa ou tubo contendo crescimento bacteriano 
• Caneta para marcação 
• Régua (próxima aula) 
 
Procedimento experimental 
Inicialmente, inocular a placa de agar nutriente com 0,3mL de cultura 
líquida pelo método de inclinação com movimento ou por espalhamento utilizando 
alça de Drigalski. Esperar secar!!! 
A seguir, a placa deverá ser dividida em 4 partes, as quais deverão ser 
identificadas com o nome do antibiótico a ser testado 
Após isso, os discos de antibióticos deverão ser coletados um a um com o 
auxílio de uma pinça estéril. Os discos devem ser colocados sobre a placa 
inoculada e deve ser feita uma leve pressão com a pinça, para garantir que o disco 
fixe bem. Entre um disco e outro a pinça deve ser passada na chama e esfriada. 
Identificar a placa, a qual será incubada 24 horas à 37ºC. 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
44
 P23. ANTIBIOGRAMA ou TESTE DE DIFUSÃO EM DISCO – Parte II (24/04) 
 
Medir os halos e interpretar os dados utilizando a tabela a seguir: 
 
Sensibilidade bacteriana – medida dos halos (mm) 
Antibiótico Símbolo Concentração 
µg ou mcg 
Resistente 
(mm) 
Intermediário 
(mm) 
Sensível 
(mm) 
Ampicilina AP ou AMP 10 ≤ 11 12-13 ≥ 14 
Cloranfenicol CO ou CLO 30 ≤ 12 13-17 ≥ 18 
Norfloxacino NOR 10 ≤ 12 13-16 ≥ 17 
Polimixina B PL ou POL 30 unid. ≤ 8 9-11 ≥ 12 
 
Questões: 
1) Como agem os antibióticos testados? 
 
 
 
 
2) Por que deve ser mantida uma distância entre os discos? 
 
 
 
3) Qual foi o resultado obtido pela medida dos halos e comparados com a 
Tabela Padrão? 
 
 
 
4) O que você pode concluir? 
 
 
 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
45
P24. AVALIAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS NA ÁGUA – Parte I (24/04) 
 
Material e Reagentes 
• Amostras de água para serem testadas 
• Estufa de incubação 
• Sistema de filtração 
• Membranas estéreis 
• 1 Placas de agar nutriente (AN) 
• 1 Placas de agar eosina-azul de metileno (EMB) 
• 1 Tubos com caldo nutriente (CN) e tubo de Durham 
• 1 Tubos com caldo P/A e tubo de Durham 
• Micropipeta e ponteiras e descarte para ponteiras 
• Sistema Petrifilm para quantificação de anaeróbios 
• Micropipetas, ponteiras e descarte para ponteiras 
• Sistema Petrifilm para quantificação coliformes/E. coli 
• Difusor 
• Pinça estéril 
• Caneta para marcação 
• Frascos com 247,5mL de água estéril 
 
Procedimento experimental 
Inicialmente, deve-se identificar os tubos de CN e de caldo P/A contendo os 
tubos de Durham e as placas de AN, de agar EMB e os sistemas Petrifilm; 
Diluir (100X) a água a ser testada (colocar 2,5 mL em um frasco contendo 
247,5mL de água estéril) Proceder a filtração das amostras de água utilizando 
membranas estéreis; 
Realizada a filtração as membranas devem ser colocadas sobre os meios de 
cultura nas placas de AN, de EMB e nos sistemas Petrifilm com o auxílio de uma 
pinça estéril. A seguir, deverá ser inoculado 0,5mL da amostra de água diluída a ser 
testada nos caldos CN e P/A. 
As placas os sistemas Petrifilm e os tubos serão incubados 24-48 horas à 
35ºC. 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
 
Questões: 
1) O que você observou nos tubos de Durhan? 
 
2) Como é possível suspeitar que uma amostra de água esteja contaminada 
com coliformes? 
 
 
3) Por que a membrana utilizada na filtração deve ser estéril? 
 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA46
P25. AVALIAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS NA ÁGUA – Parte II (08/05) 
 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• 1 Placas de agar eosina-azul de metileno (EMB) 
• 1 Placas de meio presença/ausência (EC) 
• 1 Tubos com meio SIM 
• Alça de inoculação 
• Agulha de inoculação 
• Caneta para marcação 
 
 
Observar se houve alterção da coloração e formação de gás no caldo P/A e a 
presença de colônias típicas de coliformes em meio EMB. As amostras positivas 
no P/A devem ser selecionadas e repassadas em, caldo EC com a alça de 
inoculação. As colônias típicas de coliformes e E. coli em meio EMB devem ser 
inoculadas em meio SIM com a agulha de inoculação. 
 
Os tubos EC e SIM serão incubados 24 horas à 45ºC e 35°C, 
respectivamente. 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
 
Questões: 
1) O que você observou nos tubos EC? 
 
 
2) Como é possível suspeitar que uma amostra de água esteja 
contaminada com coliformes? 
 
 
3) O que aconteceu no meio SIM? 
 
 
 
________________________________________________________MICROBIOLOGIA 
47
P26. AVALIAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS NA ÁGUA – Parte III (15/05) 
 
Material e Reagentes 
• Estufa de incubação 
• Reagente de Kovacs 
• Micropipeta, ponteiras e descarte para ponteiras 
• Sistema Petrifilm para quantificação de coliformes e E. coli 
• Difusor 
• Caneta para marcação 
 
Ao tubo contendo o meio SIM preparado na aula anterior adicionar o 
reagente de Kovacs e observar. 
 
Observar a presença de colônias positivas no meio caldo EC e repassar para 
meio EMB, incubando 24-48 horas à 35ºC. 
 
Os resultados serão visualizados na próxima aula. 
 
Questão: 
A que conclusão você chegou? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
"Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina" (Cora Coralina)