Aula 10

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Análise Instrumental
Marilza Aguilar
Aula 10 – Cromatografia Líquida e Eletroforese Capilar 
I – Introdução – Cromatografia Líquida e Eletroforese Capilar  
A cromatografia líquida se dá quando a fase móvel é um líquido e a estacionaria é um solido, fazendo a separação através do sólido.
Na cromatografia líquida, a fase móvel é um liquido de baixa viscosidade. Se a fase estacionária for um adsorvente sólido através do qual e por recurso a uma alta pressão se faz passar a fase estacionária e a amostra, temos a cromatografia líquida de alta precisão (HPLC).
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Se a fase estacionária for um sólido iônico temos a cromatografia de permuta iônica (IEC) e se a fase estacionária for um sólido poroso fazendo-se a separação em função do tamanho  molecular (sem interações entálpicas) temos a cromatografia de exclusão molecular (SEC). 
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A cromatografia de adsorção é baseada em uma fase estacionaria sólida que adsorve (prende) certas moléculas em seu meio, da parte móvel que deve ser liquida. Essa adsorção é devida a certas interações entre os constituintes da parte liquida e da sólida.
A cromatografia de partição se dá pela diferença de solubilidade das substâncias que devem ser líquidas, e sua separação se dá com o auxílio de filtros de papel ou em colunas como suporte.
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Cromatografia de fase normal
   A cromatografia de fase normal (NP-HPLC) caracteriza-se por separar os compostos com base da na sua polaridade. Esta técnica utiliza uma fase estacionária polar e uma fase móvel apolar, e utiliza-se quando o composto de interesse é bastante polar. O composto polar associa-se e é retido pela fase estacionária. A força de absorção aumenta à medida que aumenta a polaridade do composto e a interação entre o composto polar e a fase estacionária polar aumenta também o tempo de retenção.
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 Cromatografia de fase reversa
   A HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste em uma fase imóvel apolar e uma fase móvel de polaridade moderada. O tempo de retenção é maior para as moléculas de natureza apolar, enquanto as moléculas de carácter polar eluem mais rapidamente.
   O tempo de retenção aumenta com a adição de solvente apolar à fase móvel e diminui com a introdução de solventes mas hidrofóbicos. A cromatografía de fase reversa é tão utilizada que com frequência lhe denominam de HPLC sem nenhuma especificação adicional.
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Troca Iônica : a fase estacionária é constituída de uma matriz onde são adicionados grupos funcionais ionizáveis (catiônicos ou aniônicos). A fase móvel é, geralmente, uma solução iônica com propriedades tamponantes, escolhidas de forma a ser compatível com o tipo de trocador usado.
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De acordo com a tríade vista na aula anterior, a fase móvel líquida, ao contrário da cromatografia em fase gasosa, é um componente essencial para o processo de separação.
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A cromatografia líquida de alta performance (CLAE), também conhecida como HPLC (high performance liquid chromatography), é muito utilizada nas indústrias farmacêuticas, indústrias de alimentos, em análises de dopping, forenses, dentre outras. 
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A cromatografia líquida de alta eficiência tem a vantagem de poder analisar 95% dos compostos como os iônicos, sais inorgânicos e orgânicos, aminoácidos puros, compostos polares de alto peso molecular, polímeros de baixo e alto peso molecular, compostos termicamente instáveis, corantes etc. Além disso, ela demanda um menor tempo de análise, alta resolução, bons resultados quantitativos, boa sensibilidade e versatilidade. Também permite a automatização das análises, sendo muito utilizada na indústria farmacêutica.
INSTRUMENTAÇÃO DE UM CLAE
Basicamente o sistema líquido cromatográfico é constituído por módulos conectados por pequenos dutos de aço, em que a fase móvel (líquida) elui sobre pressão e de maneira constante. O sistema líquido possui módulos importantes para o processo de separação dos analitos.
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Reservatório da Fase Móvel
Bomba
Injetor
Coluna
Computador
Detector
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BOMBA
Sistema que impulsiona a fase móvel líquida sobre o sistema de maneira constante.  A bomba opera em pressões de até 500 atm, com precisão e exatidão, e com vazões de 0,01 a 10 ml/min. Há duas maneiras de a fase móvel eluir: por bombeamento isocrático e por gradiente. No bombeamento isocrático, a composição da fase móvel e fluxo constante durante a análise cromatográfica. 
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Muito utilizada em análises de rotina como análise de teor de formas farmacêuticas; Já por gradiente, há uma alteração na composição do fluxo e/ou fase móvel durante a análise cromatográfica, podendo ser por fluxo ou pela fase móvel. Em geral utilizamos o gradiente em condições especiais tais como: Análise de componentes com polaridades variadas; Análise de pureza de novos fármacos; Análise de substâncias em matrizes complexas; Pesquisa de extratos, forense e dopping. É muito utilizada em análises de rotina como análise de teor de formas farmacêuticas;
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Já por gradiente, há uma alteração na composição do fluxo e/ou fase móvel durante a análise cromatográfica, podendo ser por fluxo ou pela fase móvel. Em geral utilizamos o gradiente em condições especiais tais como: 
• Análise de componentes com polaridades variadas;
• Análise de pureza de novos fármacos;
• Análise de substâncias em matrizes complexas;
• Pesquisa de extratos, forense, dopping, dentre outras.
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INJETOR:
Fundamental para inserir a amostra (matriz) no sistema cromatográfico para obtermos as análises. Podemos injetar manualmente com uma seringa ou ainda de forma automática, como no caso das indústrias farmacêuticas, onde a quantidade de análises é muito grande.
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COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
É nelas que ocorre o processo de separação dos analitos, onde se encontra a fase estacionária. Podem ter como material as colunas de aço inoxidável ou titânio. As características das colunas são:
• Inércia química e baixa solubilidade em solventes; 
• Resistentes a altas pressões e corrosão. 
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Isto é importante para reproduzir o processo de separação dos analitos, pois na cromatografia é importante a repetição dos resultados. Podemos ter vários tipos de fases estacionárias, como:  
• Fase normal;
• Exclusão molecular;
• Fase reversa;
• Quiral;
• Troca iônica;
• Imunoafinidade.
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SISTEMAS DE DETECÇÃO:
Em geral, o detector é onde conseguimos reproduzir o sinal do analito em um cromatograma, tanto nas análises qualitativas como nas quantitativas. O detector que fica no final da coluna é onde se transforma o analito em sinal. Neste caso, uma lâmpada é responsável pela emissão da luz que o analito irá absorver e transformar em sinal. Há vários tipos de detectores para a cromatografia líquida de alta pressão.
SÍNTESE DA AULA
Aprendeu a técnica e os princípios da cromatografia gasosa;
A instrumentação da cromatografia;
A importância da cromatografia nas análises farmacêuticas;
Aplicação da cromatografia.
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Tipos de detectores para a cromatografia líquida de alta pressão 
CLASSES DE DETECTORES:
 
• UNIVERSAIS:
 
Índice de refração;
Infravermelho; 
Massas. 
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• SELETIVOS 
Ultravioleta visível; 
Infravermelho; 
Fluorescência; 
Massa; 
Eletroquímico. 
Em geral, utilizamos o detector de ultravioleta, por seu baixo custo e boa empregabilidade nas análises. A interpretação do cromatograma produz dados qualitativos e quantitativos sobre a amostra. 
Princípios de separação da cromatografia líquida de alta eficiência
Em geral, na separação da cromatografia líquida, utilizamos uma fase reversa, na qual a fase estacionária é apolar, chamada de C-18, pois possui uma cadeia de 18 átomos de carbonos que fazem as interações apolares, conforme imagem a seguir.
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Os analitos mais apolares ficam aderidos nela, enquanto os analitos mais polares irão eluir primeiro, tendo como consequência um tempo de retenção menor que os analitos apolares.
Separação dos componentes da amostra
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Injeção Migração Eluição
Parâmetro de Seletividade
A seletividade depende tanto da fasemóvel quanto da fase estacionária. O sistema de eluição (solvente) é fundamental para o processo de separação.
Alguns fatores afetam a seletividade de uma separação cromatográfica, como:
*Composição ou troca do solvente;
* Troca de coluna.
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A troca de solvente aumentou a seletividade da análise.
50 % Metanol
25 % THF
Vantagens e desvantagens da cromatografia líquida de alta performance
VANTAGENS:
• Menor tempo de análise;
• Alta resolução;
• Resultados quantitativos;
• Boa sensibilidade;
• Versatilidade;
• Automatização.
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DESVANTAGENS:
• Alto custo da instrumentação;
• Alto custo de operação;
• Difícil análise qualitativa;
• Alto custo de detectores universais e sensíveis;
• Experiência do operador.
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Princípios da Eletroforese Capilar
Podemos definir a eletroforese capilar (CE) como a migração de espécies eletricamente carregadas em um solvente líquido, em geral aquoso, na ação de um campo elétrico. Esta técnica é muito utilizada em análises de biomoléculas, como proteínas e peptídeos.
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A eletroforese capilar ganhou grande vulto em razão da simplicidade de sua análise, que é conduzida em tubos com dimensões de 15-100mm de diâmetro e 50-100cm de comprimento, sendo preenchidos com um eletrólito condutor, sendo este submetido a um campo elétrico.
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As amostras são introduzidas na extremidade do capilar oposta ao detector, e o capilar é preenchido com uma solução tampão, com uma voltagem que pode variar entre 5-60Kv e correntes entre 10-100mA, sendo o detector de UV-Vis. A diferença nas velocidades de migração de compostos diferentes, quando aplicado uma diferença de voltagem entre as extremidades do capilar, é que perfaz a separação dos analitos. 
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Os íons da amostra irão migrar em direção a um ou outro eletrodo. Então, a diferença da velocidade de migração depende da sua carga e do seu tamanho.
A diferença entre altos potenciais permite uma migração mais elevada, portanto, uma separação mais rápida.
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Ânodo
Cátodo
Computador
Capilar
Amostra
Solução de Eletrólitos
Detector
Fonte de Alta Tensão
Fluxo eletro- osmótico (FEO)
O fluxo eletro-osmótico (FEO) ocorre devido à presença de grupos silanóis na parede interna do capilar, que apresentam um caráter ácido e se ionizam quando em contato com soluções com pH superior a 3. Com isto, a parede interna do capilar torna-se carregada negativamente
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Este fluxo é responsável pelo transporte diferenciado de todas as espécies presentes na amostra até o detector. No entanto, como depende do grau de ionização da parede do capilar, o eletrólito utilizado deve ser tamponado, para que não haja variações da velocidade dos analitos estabelecida durante uma análise.
SÍNTESE DA AULA
Aprendeu a técnica e os princípios da cromatografia em fase líquida;
A instrumentação do cromatógrafo líquido;
Aplicação da cromatografia líquida.
Os princípios da eletroforese capilar.
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Análise Instrumental
Profa. Marilza Aguilar
Atividade 10
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1) Como é realizada a confirmação da identidade (análise qualitativa) de compostos quando aanálise emprega CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)?
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência a confirmação da identidade de um composto é feita através da comparação entre os tempos de retenção das substâncias e dos padrões, ou seja, compostos iguais apresentam tempo de retenção iguais.
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2) Quais espécies podem ser separadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência, mas não
podem ser separadas por Cromatografia Gasosa?
Substâncias não-voláteis ou termicamente frágeis podem ser separadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e não por Cromatografia Gasosa.