Bromo 5

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Análises em Mousse de Morango
Determinação da presença de Coliformes Totais e Fecais
RELATÓRIO DE BROMATOLOGIA
Detecção de coliformes fecais e totais pelo método Tubos Múltiplos em amostras de Mousse de morango.
 RESUMO:
A atividade foi baseada na preocupação de doenças transmitidas por alimentos (DTAs), que atualmente tem sido motivo de muitas interações e mortes por ingestão desses alimentos, está aula prática em laboratório apropriado da “Faculdade Santa Rita``veio para demonstrar detalhamente como detectar bactérias do grupo coliformes através do Método através Tubos Múltiplos em amostra de “mousse de morango``. 
 Palavras-chaves: Método mais provável, Replicata, Coliformes totais.
1 - INTRODUÇÃO 
 Estima se que 2 milhões de mortes ocorrem por água e alimentos e contaminados em todo mundo. Em 2010 as doenças de origem alimentar causaram   a 351 mil óbitos. Dentre essas doenças, somente a bactéria Salmonela provocou a morte de 52 mil pessoas, e pela Escherichia coli que tem como seu principal habitat, o intestino humano, mais de mais 37 mil mortes foram apuradas. Na África, cerca de 40 % das crianças menores de 5 anos tiveram essas enfermidades.
A diretora geral da OMS alega que as mudanças e fortes processos de industrializados aumenta a contaminação por bactérias, vírus e parasitas e produtos químicos, confirma que mais de 200 tipos de doenças dês de diarreia até câncer podem ocorrer com a má comercialização de alimentos, higienização adequada e água potável (Nações unidas .org)
As doenças de origem alimentar especialmente causadas por microrganismos patógenos como a diarreia com 70 % de todos episódios resultam da ingestão de alimentos e água contaminadas que levam a óbitos.
No livro da OMS: Doenças de origem alimentar destaca a importância na educação e tem como principal objetivo desenvolver programas para indústrias e consumidores para a segurança como alimentos. (Pelczar Jr et al.1997).
Alguns indicadores funcionam, para quantificar micro biologicamente os alimentos em relação à segurança, à presença de patógenos alimentares em geral, são utilizados para avaliar a sanidade dos alimentos, mas também podem ser usados para avaliar aspectos gerais de qualidade. (Brasil, 2011). 
.Julio Zanella(Colaborou Genira Chagas)
4-Materiais e métodos
- Material:
 -Algodão 
 -Luvas
- Alça de inoculáveis
- Bico de Bunsen
- Pipetas estéreis
- Provetas de 100ml
-Tubo de Durham
- Tubos de Vidro
´- Equipamento:
 - Autoclave
 -Balança
 - Estufa bacteriológica
	
- Reagentes:
- Água peptonada
- EC
- Lauril sulfato
- Verde brilhante bile
O Propósito da diluição seriada, sendo uma técnica possível de quantificar os microrganismos presentes nas amostras.
Na aplicação da técnica dos tubos múltiplos, foi capaz de estabelecer o número mais provável (NMP) de coliformes na amostra de mousse de morango. De modo que as bactérias presentes na amostra são separadas por agitação apresentando uma suspensão de células bacterianas bem distribuídas.
Preparo das diluições para obtenção das amostras para análise microbiológica
 
A diluição é o método de adição de uma substância a outra para reduzir a concentração de uma dos elementos. Indica a quantidade relativa de substâncias em uma solução. O uso mais comum da palavra diluição ocorre no sentido de que “tantas partes de uma amostra” estão sendo diluídas em um número total de partes do produto final, que é a soma do diluente com a amostra (Brasil, 2003). 
Diluições decimais 
Conforme Brasil (2003), as diluições decimais são soluções em que a quantidade de substância a ser diluída corresponde à unidade, ou múltiplos da unidade e o volume final da solução diluída é igual a 10 ou múltiplo de 10 (diluições de base 10). 
Diluições decimais seriadas 
A IN 62 (2003), diz que são diluições decimais preparadas em série e que possuem um fator de diluição único e igual a 10. Exemplo: Preparar diluições decimais de uma cultura bacteriana em fase estacionária (sem crescimento) até a 10-3. Os passos com as explicações serão descritos a seguir de acordo com Brasil (2003). 
I. Preparar uma diluição 1:10 da cultura em fase estacionária em solução de água peptonada, isto é, misturar 1 ml da cultura em fase estacionária com 9 ml de solução água peptonada (10-1). 
II. A partir da diluição 1:10 preparada conforme o item I, após homogeneização em agitador de tubos, tomar 1 ml e misturar com 9 ml de solução água peptonada, de forma a obter a diluição 1:100 da cultura em fase estacionária (10-2) 
III. A partir da diluição 1:100 preparada conforme o item II, após homogeneização em agitador de tubos, tomar 1 mL e misturar com 9 mL de solução peptonada, de forma a obter a solvência de 1:1000 da cultura em fase estacionária (10-3) 
Reagente Lauril Sulfato de Sódio
Reagente Verde Brilhante Bile 2% lactose (VBBL)
Reagente EC
-1°- foram colocados 9ml da diluição 10-1 em dois tubos, 9ml em cada tubo para teste nulo.
2°- Foram colocados 10 ml da diluição 10-1 (1 tubo) 10-2  (1 tubo) 10-3 (1 tubo) da série de três tubos contendo Caldo Lauril sulfato de sódio;
3°- Foram colocados 10 ml da diluição 10-1 verde brilhante para cada tubo da segunda série de nove tubos 10-1 (3 tubos) 10-2 (3 tubos) 10-2  (3 tubos);
4°-Foram colocados 10 ml da diluição 10-1 Caldo EC para cada tubo da segunda série de nove tubos 10-1 (3 tubos) 10-2 (3 tubos) 10-2  (3 tubos);
- Posteriormente, foram colocados a quantidade que tínhamos dos tubos de Durham nos tubos com os caldos;
-Todos os tubos foram identificados;
- Estes tubos foram levados a Estufa para serem mantidos incubar a 36 ± 1°C por 24 a 48 horas.
Foto:
Fonte: arquivo pessoal
Em um segundo instante
1°- Foi realizada a pesagem de 5 gramas da amostra de mousse de morango, e adicionados 45ml de água peptonada. Realizando do a homogeneização da amostra.
2°- Com o auxílio de uma pipeta retira-se 1ml da amostra e faz-se a transferência para o tubo de vidro contendo 9 ml do caldo de Lauril Sulfato de triptose. Obtendo a proporção 1:10.
3°-Retira-se 1 ml da primeira amostra (1:10) e acrescenta-se a um tubo de vidro contendo 9 ml de água peptonada. Desta forma, é retirado 1 ml desta proporção e colocando no tubo de vidro o Caldo Lauril Sulfato Triptose. Obtendo a proporção 1:100.
4°-Retira-se 1 ml da segunda amostra (1:100) e acrescenta –se a um tubo de vidro contendo 9 ml de água peptonada. Então é retirado 1 ml desta proporção e colocado no tubo de vidro Caldo Lauril Sulfato Triptose. Obtendo proporção 1:1000 
Foto:
Fonte: arquivo pessoal
Tubos de Lauril
- Com os tubos identificados adicionamos 1 ml da amostra ao tubo 10ml 
(10-1 ) do caldo Lauril;
- Retiramos do tubo de diluição 10-1 do caldo Lauril e adicionamos no tubo (10-2) do caldo Lauril.
- Retiramos do tubo de diluição (10-2) do caldo Lauril e adicionamos no tubo (10-3) do caldo Lauril.
- Estes tubos foram para estufa a 35°C ± 0,5°C por mais dos que as 24 horas que deveriam permanecer.
Em um terceiro instante	
- Após o intervalo de incubação, os tubos apresentaram resultados positivos para presença de Coliformes totais. (Resultados presuntivo);
- A presença de coliformes fecais é confirmada pela formação de gás no tubo de Durhan, presente de forma invertida no interior do tubo contendo caldo EC, e turvamento do caldo. Presença confirmada nos 3 tubos. 
- Para se confirmar o resultado, foram feitos “testes confirmativos”;
- Com a alça de inoculação esterilizada com chama inoculamos o caldo verde brilhante cultura positiva em caldo Lauril;
Fonte: arquivo pessoal
- O caldo verde brilhante com a cultura positiva em caldo Lauril foi incubado a 35° C no período de 24 horas.
Em um Quarto instante
- Com a alça de inoculação esterilizada com chama, inoculamos o caldo EC com a cultura positiva do caldo verde brilhante;
- O EC deveria incubado a 44,5°C em banho Maria agitando por 24 horas, porém,foi incubado a 35° C no período de maior do que 24 horas.
Em um Quinto instante
- A presença de coliformes fecais é confirmada pela formação de gás no tubo de Durhan, presente de forma invertida no interior do tubo contendo caldo EC, e turvamento do caldo. Presença confirmada nos 3 tubos. 
- Ao término do processo e já com todas as informações necessárias obtidas, todos os frascos foram colocados em uma autoclave para que assim os microrganismos presentes fossem eliminados.
 Resultados
A presença de coliformes fecais foi comprovada pela formação de gás no tubo de Durhan, presente de forma invertida no interior do tubo contendo caldo EC, e turvamento do caldo. Presença confirmada nos 3 tubos.
Em nossa prática de laboratório, coliformes totais e fecais apresentaram a seguinte sequência: 3 3 3 que foi o resultado de 3 tubos positivos. Esse Resultado na tabela indica um NMP/100 ml >1100. 
“A partir da combinação de números correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e termo tolerantes), verifica-se o número mais provável, como mostra a tabela 1 de NMP (Blodgett, 2003). Expressar o valor encontrado em NMP/g ou ml.” (Brasil, 2003). 
 
 Fonte: arquivo pessoal
7. Conclusão
A técnica de tubos múltiplos ( NMP) se mostrou efetivo com resultados de fácil interpretação que foi possível e apropriável a diluição seriada com a presença dos reagentes e do tubo de Durham. 
Nas práticas ficou evidente a importância dos cuidados com as contaminações o manuseio e a incubação.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
http://www.unesp.br/aci/jornal/220/alimentos.php
Acesso:26/10/2017
http://portal.anvisa.gov.br/
Acesso:26/10/2017
 https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm109656.htm#tab1
Acesso: 28/10/2017
http://estudio01.proj.ufsm.br/cadernos/cafw/tecnico_agroindustria/bromatologia.pdf
Acesso: 28/10/2017
Bolzan, Rodrigo Cordeiro
Bromatologia /Rodrigo Cordeiro Bolzan. –Frederico
Westphalen: Universidade Federal de Santa Maria, colégio agrícola de Frederico Westphalen,2013
lll. Título Páginas visitadas 33,34 e 35
Acesso: 27/10/2017