A maior rede de estudos do Brasil

Grátis
74 pág.
estrategias de purificacao  e analises protenas

Pré-visualização | Página 1 de 7

Fundamentos de Proteínas
Aula 3 – Estratégias de Purificação e 
Análises de Proteínas
BCM13042
Principais componentes moleculares da bactéria Principais componentes moleculares da bactéria E. coliE. coli
Componentes Nº de moléculas diferentes Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total% peso total
H2O 1 70
Proteínas 3.000 15
Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7
Carbohidratos 50 3
Lipídeos 40 2
Outros Íons - 12 3
 Mol. Monoméricas - 500
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede 
os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D 
e a compreensão de suas propriedades biológicas. 
Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou 
seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada 
proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os 
mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.
 Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifuação, diálise, gel-filtração)
 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) 
 Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas 
 moléculas:
 
 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que 
 interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
 
Métodos de Isolamento de BiomoléculasMétodos de Isolamento de Biomoléculas
Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. 
Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo 
de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas 
tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:
ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F 1 F 2 F 3 F 4
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatograf ia Troca Iônica
Cromatograf ia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F 2 .3.N.X
 
1 Proteína apenas
 (0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filt ração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) 
O fluxograma ao lado representa a 
“marcha” de purificação de uma proteína, 
mostrando as etapas sucessivas, cada 
uma consistindo de método, que levam ao 
isolamento de uma proteína presente 
numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas 
(100g) presente no material inicial e 
quanto da proteína purificada se obtém no 
final (0,001g). Esses números são típicos 
para a purificação da maioria das 
proteínas, em especial enzimas. 
Em cada etapa, a proteína de interesse é 
separada das demais com base em uma 
propriedade diferente. Consequente-
mente, as proteínas ainda misturadas com 
aquela que está sendo isolada são cada 
vez mais semelhantes em suas 
características físico-químicas, exigindo 
métodos cada mais sensíveis, capazes 
de explorar pequenas diferenças, para se 
chegar à proteína pura. 
• Medida da atividade biológica
 - particular para cada proteína
 - deve ser quantitativa, para estimar quanto 
da proteína de interesse há em cada fração.
• Medidas do conteúdo proteico (diversos)
 - absorbância de luz UV de 280 nm
 - métodos colorimétricos 
 (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
Além dos métodos de purificação, análises 
complementares devem ser feitas ao longo da 
purificação, para verificar se o processo de 
separação está sendo eficiente.
A medida da atividade biológica da proteína 
de interesse e do conteúdo de proteínas de 
cada fração resultante do processo de 
separação devem ser feitas a cada passo. 
Assim, apenas a fração que contém a 
proteína de interesse, marcada com um 
círculo vermelho no fluxograma, é submetida 
à próxima etapa de purificação.
ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F 1 F 2 F 3 F 4
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatograf ia Troca Iônica
Cromatograf ia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F 2 .3.N.X
 
1 Proteína apenas
 (0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filt ração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) 
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo 
proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos aromáticos na sua composição, 
especialmente triptofano. 
A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma 
leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.
Ácidos nucleicos também absorvem luz UV – máxomo 260 nm. Proteína: razão A280/A260 > 1
Comprimento de onda
Ab
so
rt
iv
id
ad
e 
m
ol
ar
, ε
BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 
4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline
Reagente Bradford 
= Coomassie 
Brilliant Blue G-250
 Método baseado em uma mudança espectral do 
reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor 
azul), quando interage com proteínas.
 Interação com proteínas se dá através de 
forças de Van der Waals e ligações iônicas, 
especialmente com arginina, mas também com 
resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e 
fenlialanina.
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de 
proteínas reagem fortemente com o BCA 
formando um composto azul, 
Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato 
 Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um 
complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 
 
1. Cu2+ é chelado pela proteína
 [Cu2+-proteina]
2. Reação redox 
 Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína] 
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de 
proteínas e cadeias laterais de aminoácidos 
aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o 
reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- 
mobidênio-tungstênio), dando um composto 
de cor azul.
Método de Lowry
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse 
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio 
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). 
 
tecidos
células
Homogeneização 
(para romper tecidos e células)
por pressão
(prensa francesa)
liquefação
(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material 
de 
partida
Material na 
fonte
por ultra-som com
detergente
Vários métodos são 
possíveis para transformar 
células, órgãos, tecidos em 
um homogenado, ou extrato 
bruto, como mostra a figura.
Sendo a proteína de interesse 
uma proteína de membrana, é 
necessário solubilizá-la. Para 
esse fim são utilizados 
detergentes, que dissolvem a 
membrana plasmática e 
formando complexos solúveis 
com as proteínas.
Proteínas 
integrais da 
membrana
detergente micelas
Complexos 
não micelares
Dependendo da concentração
Detergentes podem ser 
iônicos e não

Crie agora seu perfil grátis para visualizar sem restrições.