ESTRUTURA DO DNA E COMPACTAÇÃO

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ESTRUTURA DO DNA E COMPACTAÇÃO
INTRODUÇÃO
Em 1869, Johann Friedrich Miescher foi a primeira pessoa a realizar um experimento de extração de DNA a partir de núcleo de leucócitos retirados de uma secreção de pus. A escolha por essas células se dá porque elas possuem o núcleo grande o suficiente para se ter bastante material. 
Ele utilizou uma metodologia que consistia em romper a célula e manter o núcleo dela intacto para extração do DNA. Quando extraído, ele percebeu que a substancia do interior do núcleo era um precipitado não solúvel em ácido, o que provavelmente classificava ele como um ácido, rico em fosforo e nitrogênio e chamou essa molécula de nucleína. Posteriormente, quando melhor estudadas, as moléculas foram denominadas ácidos nucleicos como uma homenagem a primeira descoberta de Miescher. 
Nessa época ainda não se sabia de onde vinha o material genética e existia até uma discussão se os cromossomos, que eram observados durante a fase de divisão celular, eram realmente reais ou se eram simplesmente artefatos da técnica de coloração, já que durante a fase da interfase, quando eles não estão se dividindo e não estão compactados, não é possível observa-los. 
Esse questionamento só foi finalmente resolvido quando Walter Fleming trabalhou com células vivas de larvas de salamandra, onde não é preciso nenhuma técnica de coloração, e foi possível observar os cromossomos, demonstrando então que não eram artefatos do método de coloração. 
No começo do século XX, os processos de divisão celular já eram conhecidos, mas o componente responsável pela hereditariedade não era conhecido. Os “potenciais canditados” a esse componente eram os cromossomos, as organelas, proteínas, vesículas e de uma maneira geral a maioria de todos os componentes das células. Os cromossomos eram os mais desconsiderados para serem os responsáveis pela passagem de informação, já que como eles só apareciam na divisão celular se pensava que eram apenas moléculas acessórias e secundárias. 
Em 1901 ocorreu a redescoberta dos trabalhos de Mendel e pela primeira vez a genética foi tomada como ciência, pois era possível predizer a característica genética de uma determinada população de acordo com o cruzamento genético que fosse feito. Nessa época então, os estudos sobre hereditariedade retornaram e vários experimentos foram feitos por cientistas diferentes. Sutton por exemplo, com células de testículo de gafanhoto, observou que sempre haviam 22 cromossomos em pares, demonstrando que não eram apenas estruturas secundárias. Em 1903, ele conseguiu demonstrar que o comportamento dos cromossomos tem uma impressionante semelhança com o comportamento dos fatores hereditários de Mendel.
Thedor Boveri foi o primeiro a demonstrar que o número de cromossomos precisava ser constante para que o indivíduo gerado fosse viável, já que em seus experimentos, ele acrescentava mais cromossomos a uma célula filha e o indivíduo não era desenvolvido em um embrião ou seria no mínimo anormal.
A partir então desses experimentos indiretos de Sutton e diretos de Boveri, culminou a Teoria Cromossômica da Hereditariedade ou Teoria Cromossômica de Sutton-Boveri, que fazia uma ponte entre a teoria mendeliana e a hereditariedade. 
Tem mais coisa – Thomas Hunt Morgan DROSOPHILAS
CARACTERÍSTICAS DO MATERIAL GENÉTICO: 
Capacidade de replicação: estocar informação e transmitir com precisão para a prole.
Controlar o desenvolvimento dos organismos e moldar sua estrutura funcional: o DNA possui toda a informação genética do metabolismo que será utilizada para que as proteínas executem.
Ser passível de mudanças para suportar a evolução.
Experimento do Griffiths das bactérias S e R 17:25
Experimento de Hershey e Chase 23:20 - 28:43 
Watson e Crick e Chargaff 29:46 – 35:00
ESTRUTURA DO DNA
Um nucleotídeo é composto por um anel de açúcar, uma pentose, que no caso do DNA é uma desoxirribose e no caso do RNA é uma ribose e esse anel tem 5 moléculas de carbonos lidas no sentido horário. O carbono 1 estará ligado a base nitrogenada, o carbono 3 é o que possui a hidroxila livre 3’ e o carbono 5 está ligado ao grupamento fosfato 5’, que quando ligado ao DNA é um monofosfato e quando está livre no núcleo ou no citoplasma é trifosfatado. 
A diferença entre uma desoxirribose e uma ribose é que na desoxirribose, o carbono 2 está ligado a duas moléculas de hidrogênio e na ribose ele estará ligado a um hidrogênio e uma molécula de hidroxila. 
As três forças químicas que atuam dentro de uma molécula de DNA são: 
Ligação covalente em forma de ligação fosfodiester: liga um nucleotídeo ao outro ao longo da cadeia de DNA. São as ligações mais fortes que existem.
Pontes de hidrogênio: ligações entre as bases nitrogenadas, onde C e G fazem três pontes de hidrogênio e A e T apenas duas. 
A molécula de DNA é hidrofílica por hora e hidrofóbica por dentro (?!?!!?)
A dupla fita de DNA é antiparalela, o que significa que enquanto uma fita está na posição 5’-3’ a outra estará na posição 3’-5’ e essa conformação é a única maneira de manter a estabilidade da molécula. 
A dobradura da dupla fita não é perfeita, geralmente possuindo uma fenda maior e uma fenda menor sempre alternadas mas se uma reta for traçada, a estrutura sempre será constante. Cada volta da dupla hélice tem em torno de 10 pares de bases, então cada fita de DNA terá em torno de 10 nucleotídeos a cada volta, totalizando 20 nucleotídeos ou 10 pares de bases.
O DNA pode existir em várias formas que são conseguidas artificialmente em laboratório e de todas essas formas, apenas 3 são vistas em vida real: B-DNA, A-DNA e Z-DNA.
B-DNA: Essa forma é a que em geral ele apresenta em condições normais.
A-DNA: Geralmente ocorre quando se tem uma dupla fita DNA-RNA, como ocorre na transcrição.
Z-DNA: Em geral acontece quando o DNA está associado a proteínas, como por exemplo quando a molécula esta metilada ou então durante o processo de transcrição, quando a molécula de DNA é liberada da RNA polimerase e essa forma garante uma diminuição da tensão ao abrir a fita de DNA.
DIFERENÇAS ENTRE O MATERIAL GENÉTICO DE PROCARIONTES E EUCARIONTES:
Em geral bactérias apresentam um único cromossomo circular, enquanto que organismos eucariontes possuem cromossomos de forma circular e o número varias de organismo para organismo.
Procariontes não possuem núcleo, então o DNA está distribuído no citoplasma e eucariontes possuem uma estrutura compartimentalizadora chamada de núcleo. Algumas bactérias fazem pseudonucleos, onde pegam a membrana interna do citoplasma e mantem seu DNA dentro desse pseudo núcleo. Em ambos os casos, o DNA nunca está solto e “flutuando” dentro do compartimento onde se encontram.
O material genético de procariontes é consideravelmente menor do que dos eucariontes.
Bactérias possuem plasmídeos – pequenos DNAs circulares que possuem genes acessórios, ou seja, não são essenciais para a vida da bactéria, mas eles podem conter genes associados a resistência à antibióticos ou seja, genes relacionados a virulência da bactéria em questão. 
OBS: Vírus
Não são considerados células vivas, mas são divididos em grupos de acordo com seu material genético (tabela do slide). 
COMPACTAÇÃO DO DNA 
O DNA fica de forma compactada na célula associado a proteínas chamadas histonas e outras proteínas não-histonicas também. Basicamente, a forma de máxima compactação do DNA é o cromossomo ou cromátide (duplicada), em que há uma região mais compactada chamada de centrômero. 
A compactação do DNA se deve ao seu enorme tamanho e se não houvesse compactação, a célula teria que abarcar quase 2 metros de DNA espalhado entre os 46 cromossomos existentes dentro de um núcleo. Então a compactação máxima do nosso DNA equivale a 10.000 vezes. 
Bactérias também compactam DNA pois o DNA cromossômico de uma bactéria, apesar de ser somente uma fita circular de DNA, ainda sim ocupa 1/3 do volume celular de uma bactéria. A forma de compactação do DNA bacteriano é a formação de alças e essas alças não ocorrem pela presença deproteínas do tipo histona e sim proteínas de outro tipo. São em torno de 100 alças e cada uma tem em média 40 mil pares de bases. O DNA bacteriano compactado é denominado de nucleóide. As proteínas responsáveis pela compactação do DNA bacteriano são chamadas de HU e H1, ambas compostas por duas subunidades e aparentemente elas têm funções redundantes. Elas têm forma de grampos e basicamente a função delas é pegar o DNA e formar uma alça e colocar um grampo para que a alça continue formada. 
O DNA eucariótico fica compactado sob a forma dos cromossomos dentro do núcleo, sendo que o DNA em cromossomos e as histonas compõe a maior parte do conteúdo nuclear. Mas além desses componentes, ainda há proteínas não histonicas que também estão relacionadas a compactação do DNA, RNA – sendo que esses dois como estão relacionados com a compactação do DNA, podem aparecer em quantidades diferentes dependendo da fase de divisão celular- e uma série de constituintes nucleares não cromáticos como outras proteínas de importação/exportação, açúcares, nucleotídeos, etc. 
O DNA apresenta 5 níveis de compactação – sendo que a dupla fita não é considerada um deles, pois naturalmente o DNA fica sob essa forma:
Nucleossomos ou “colar de contas”: Quando o DNA está enrolado em histonas, sendo essas formadas por 8 subunidades de 4 proteínas diferentes – essas proteínas aparecem em pares: 2 moléculas de H4, 2 moléculas de H3, 2 moléculas de H2A e 2 moléculas de H2B. Além dessas 8 subunidades, há uma subunidade maior chamada de H1, que forma uma cauda e está ligada ao 2º nível de compactação.
A dupla hélice de DNA se enrola duas vezes em cada histona, há um espaço chamado de DNA espaçador – que não está envolto na histona – e na sequencia há mais uma histona sendo envolta por DNA, etc. 
Cada nucleossomo empacota 147 pares de base, independente do organismo e essa compactação reduz o DNA a 1/3 do seu tamanho original. As histonas são básicas – as proteínas mais básicas do organismo – para que o DNA, que possui carga negativa, ou seja, é ácido, consiga se enovelar naturalmente nelas. 
Solenoide: A histona H1 é responsável por estruturar o 2º nível de compactação pois o DNA tem que passar por ela para entrar e sair da histona e isso faz com que a H1 determine o ângulo de entrada e saída do DNA em 60°. Esse ângulo possibilita que os nucleossomos se compactem sobre si mesmos. Cada solenoide é um conjunto de 6 nucleossomos compactados um sobre o outro em uma volta de 360°. Os solenoides compactam 100x os cromossomos. 
OBS1: HISTONAS CENTRAIS X HISTONA H1
As histonas centrais são as proteínas mais conservadas na natureza e a H1 é a que mais varia entre os organismos em sua composição de aminoácidos e ausente nas leveduras. 
O DNA espaçador tem em média 200 pares de bases, mas essa distância pode variar de tamanho dependendo do organismo e ainda dependendo de qual tecido está se tratando. São nesses espaços que ocorrem a interação do DNA com outras proteínas, então por exemplo, se o promotor de um gene X estiver dentro de um nucleossomo, esse gene não é expresso e então quanto mais descompactado o DNA está, maior é o tamanho do DNA espaçador.
OBS2: O PRIMEIRO NIVEL DE COMPACTAÇÃO NÃO EXISTE NA VIDA REAL!
O DNA nunca irá se descompactar ao ponto de ficar somente associado as histonas em nucleossomos então podemos dizer que o 1º nível e o 2º nível são o mesmo nível de compactação já que esses processos ocorrem simultaneamente: ao passo que uma parte do DNA está se enovelando nas histonas, outras porções que já formaram nucleossomos já estão se compactando uns sobre os outros e etc, então o 1º nível de compactação nunca será observado in vivo.
Dúvida: Fibra de cromatina é o solenoide ou os nucleossomos ainda não compactados uns sobre outros outros? Porque no áudio, Andre diz “o DNA nunca será visto in vivo sob a forma de colar de contas, no máximo ele irá se descompactar em fibra de cromatina”.
Arcabouço: Há uma matriz proteica, que não é formada por histonas, com alças de DNA, que se ligam nas proteínas dessa matriz. A formação dessas alças permite, que tridimensionalmente, ocorra a possibilidade de aproximar regiões do genoma que espacialmente estariam distantes com o DNA esticado. Por causa disso, genes que estão tridimensionalmente próximas e estariam espacialmente distantes podem ter o mesmo fator de transcrição.
As regiões onde o DNA se liga à matriz proteica foram identificadas por DNAses como sequencias que aparentemente são reconhecidas pelas proteínas da matriz e foram denominadas de MAR: não são sequencias conservadas e ricas em pares de A=T.
Rosetas: Há um enovelamento do arcabouço sobre ele mesmo.
Aproximação das Rosetas
OBS3: PROTEINAS DO ARCABOUÇO
As bactérias não possuem histonas, então consequentemente elas não realizam o 1º e o 2º nível de compactação, mas elas formam alças para compactar seu DNA e utilizam proteínas similares as utilizadas no 3º nível de compactação dos eucariontes. 
A formação das alças ocorre pelo alinhamento aleatório de proteínas chamadas condensinas. O 4º nível de compactação, onde ocorre a formação das rosetas, se dá quando há o alinhamento das condensinas uma ao lado da outra.
Há condensinas do tipo I e do tipo II, em que a do tipo I só está presente no núcleo, então o núcleo, quando em interfase, consegue alcançar o 4º nível de compactação. A condensina do tipo II, presente somente no citoplasma, consegue entrar no núcleo quando ele começa a se desfazer no processo de divisão celular, e finalmente o 5º nível de compactação – os cromossomos efetivamente – consegue ser alcançado pela ligação com as condensinas do tipo I que já estavam presentes. 
Dúvida!!! SLIDE 29
COMPLEXO SINAPTONEMICO 
Complexo proteico que permite que as cromátides-irmãs consigam ficar unidas e basicamente ocorre pela ação de proteínas – que possuem a mesma origem evolutiva das condensinas - chamadas de coesinas. DUVIDA
CENTRÔMERO
Região do cromossomo que é constrita, onde os microtubulos que surgem durante a divisão celular se ligam. Esses microtubulos se ligam no cinetócoro, uma estrutura proteica associada ao centrômero, que funciona como uma ancora, montando um anel ao redor do microtubulo para prendê-lo ao cromossomo e quando isso ocorre, há um sinal para que esse microtubulo que estava se expandindo anteriormente comece a se retrair. 
CITOGENETICA 
CROMOSSOMOS POLITÊNICOS
Cromossomos encontrados em glândulas salivares em diversas larvas de dípteros e eles se duplicam e as cromátides continuam juntas, formando então um cromossomo gigante. Eles serviram para determinação dos padrões de bandeamento, ou seja, padrões de condensação de DNA pois nas regiões “mais escuras” há mais DNA do que nas mais claras. SLIDE 41
Os cromossomos humanos têm um padrão muito especifico de bandeamento, independente do indivíduo em que se faça o cariótipo. Esse cariótipo é originalmente utilizado para determinar síndromes como a trissomia do 21 por exemplo (Síndrome de Down). Além disso, ele pode ser utilizado para identificar espécies muito parecidas também, como por exemplo duas espécies de cabras que possuem exatamente o mesmo número de genes, mas quando é feito o cariótipo, elas possuem cromossomos completamente diferentes, em que uma possui muito mais do que a outra, com somente 4, então pode ter ocorrido um evento de fusão de cromossomos ou quebra de cromossomos. 
Além de auxiliar na determinação dos padrões de bandeamento, os cromossomos politênicos também auxiliaram na determinação do local da transcrição, pela descoberta dos chamados “puffs” ou anéis de Balbiani, que são aglomerações de RNA nos cromossomos politênicos que eram originados de regiões mais claras de DNA, ou seja, regiões menos compactadas do DNA.
EUCROMATINA X HETEROCROMATINA
Eucromatina significa “cromatina verdadeira”, ou seja, a região do DNA menos compactada onde estão efetivamente os genes e a Heterocromatina seria a “falsa cromatina”, regiões mais escuras. Nas regiões em que o DNA está muito compactado – heterocromatina -a RNA polimerase não consegue chegar, então a transcrição não ocorre e geralmente replica mais tardiamente também, já que haverá mais DNA na região compactada. A condensação também significa inatividade genica do gene que estiver presente nessa região do DNA, pois ele não será expresso, mas isso não significa que região não condensadas obrigatoriamente estarão expressando todos os seus genes. 
As regiões de eucromatina e heterocromatina não são fixas, ou seja, em um dado momento uma região de heterocromatina pode se descompactar e passar a formar uma região de eucromatina, passando então a expressar os genes daquela região. Além disso, existem regiões de cromossomo dentro do núcleo, em que eles se aglomeram e geralmente se posicionam em polos distintos, demonstrando que eles não ficam soltos no núcleo.