Eletroforese na Purificação de Moléculas

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Eletroforese	
  
	
  
Biotecnologia	
  
Purificação	
  de	
  moléculas	
  
IBF-­‐020	
  
	
  
[Transporte de partículas num campo eléctrico 
[Técnica usada para separar e às vezes purificar 
macromoléculas que diferem na carga, conformação 
ou tamanho 
Aplicações: 
PSeparação de compostos com carga 
(aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleícos). Carga 
dependente do pH do meio. Moléculas negativas e 
positivas movem- se em direcções opostas ao campo 
eléctrico. 
P Determinação da composição das proteínas por 
comparação com padrões electroforéticos 
Eletroforese	
  
Eletroforese	
  de	
  proteínas	
  
•  Separação	
  de	
  proteínas	
  de	
  uma	
  mistura	
  pela	
  massa	
  
molecular	
  e/ou	
  carga	
  (PI)	
  em	
  um	
  fluido	
  (gel)	
  sob	
  um	
  campo	
  
elétrico.	
  	
  
Ferdinand	
  Frederic	
  Reuss	
  	
  
—  Movimento molecular sob ação de um campo eléctrico 
Num solvente não condutor: Força de eléctrica (Coulomb): 
F = qE 
q= Z e Força de fricção: Ff = - f v 
No equilíbrio: V = Fe + Ft = 0 
Z = nº de cargas (sem dimensões) 
e = carga eléctrica (1,6022 x10-19 C) 
E= campo eléctrico (volt m-1) 
f = coeficiente de fricção (Kg s-1) 
Príncipios	
  da	
  eletroforese	
  
—  Aplica-se uma diferença de potencial e a partícula move-se na 
direcção do polo de carga oposta 
—  No início há resistência devido à viscosidade do meio mas a certa 
altura atinge-se um equilíbrio quando as forças electrostáticas 
atrativas se igualam à resistência ao fluxo. Então a mobilidade 
eletroforética passa a ser constante 
Príncipios	
  da	
  eletroforese	
  
Príncipios	
  da	
  eletroforese	
  
+
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  
APS	
  -­‐	
  iniciador	
  
TMED	
  -­‐	
  
catalisador	
  	
  
N,	
  N-­‐	
  MeMlenebisacrilamida	
  
–	
  monomêro	
  cross-­‐linking	
  	
  
Acrilamida	
  –	
  monomêro	
  
PAGE	
  =	
  polyacrylamide	
  gel	
  electrophoresis	
  
SDS	
  -­‐PAGE	
  
Agentes	
  redutores	
  
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 61 
Tampão	
  de	
  amostra	
  	
  	
  +	
  extrato	
  de	
  proteínas	
  	
  
Agente	
  redutor	
  
Fervura	
  5	
  minutos	
  	
  
Aplicação	
  da	
  amostra	
  em	
  
cada	
  canaleta	
  	
  
Aplicação	
  da	
  voltagem	
  =	
  
corrida	
  	
  	
  
Física Aplicada 2013/14 |MICF | FFUP 62 
PAGE	
  sistema	
  conDnuo	
  
PAGE	
  DesconDnuo	
  
Francis	
  H.	
  
Kirkpatrick	
  
Gel	
  de	
  empilhamento	
  (Stacking)	
  –	
  pH	
  =	
  6,8	
  
Gel	
  de	
  separação	
  (Running)	
  –	
  pH	
  =	
  8,8	
  
Geis	
  do	
  PAGE	
  DesconDnuo	
  
•  Composto	
  por	
  cloreto	
  e	
  glicina	
  (pH	
  ~	
  8,3).	
  	
  
•  Glicina	
  é	
  o	
  menor	
  aminoácido,	
  um	
  ácido	
  fraco,	
  em	
  pH	
  mais	
  baixo	
  (gel	
  de	
  
empilhamento	
  -­‐	
  6,8)	
  ele	
  estará	
  no	
  estado	
  zwiberion	
  
•  Em	
  pH	
  mais	
  alto	
  (gel	
  de	
  separação	
  -­‐	
  8,8),	
  a	
  glicina	
  é	
  negaMvamente	
  
carregada.	
  	
  
pKa	
  1	
  =	
  2,34	
  
pKa	
  2	
  =	
  9,60	
  
Tampão	
  de	
  corrida	
  
pI	
  da	
  Glicina??	
  
PAGE	
  desconDnuo	
  -­‐	
  Empilhamento	
  	
  
Glicina	
  
Cl-­‐	
  
Região	
  de	
  baixa	
  
condutância	
  	
  
PAGE	
  desconDnuo	
  -­‐	
  Empilhamento	
  	
  
Amostra	
  correndo	
  no	
  gel	
  
empilhador	
  
Entrada	
  das	
  amostras	
  no	
  gel	
  separador	
  
Amostra	
  entram	
  no	
  gel	
  
separador	
  no	
  mesmo	
  
momento	
  	
  
Assegura	
  que	
  a	
  separação	
  em	
  
função	
  do	
  tamanho/massa	
  	
  
Tampão	
  de	
  corrida	
  
Gel	
  empilhador	
  	
  	
  
4%	
  	
  	
  
Gel	
  separador	
  
12%	
  	
  	
  
	
  E:	
  Glicina	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  mobilidade	
  :	
  ultrapassa	
  e	
  corre	
  na	
  frente	
  das	
  ptns	
  
não	
  geram	
  resistência	
  	
  	
  
	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  F:	
  	
  proteínas	
  submeMdas	
  a	
  corrente	
  elétrica	
  mais	
  uniforme	
  	
  
Detecção	
  das	
  bandas	
  proteícas	
  
Gel	
  de	
  proteínas	
  naGvas	
  
-­‐	
  Gel	
  naGvo-­‐	
  
Serva	
  blue	
  G	
  
Confere	
  carga	
  negaMva	
  à	
  
proteína	
  sem	
  levar	
  a	
  sua	
  
desnaturação	
  
Proteína	
  naMva	
  
oligomérica	
  em	
  	
  
interação	
  não	
  
covalente	
  com	
  
Serva	
  blue	
  
A carga e as propriedades hidrodinâmicas da proteína são função do seu peso 
molecular 
 
log M = a - bx 
M = peso molecular da 
proteína; 
X = distância de migração 
no gel (proporcional à 
mobilidade) 
a e b = constantes para 
um dado gel e um dado 
campo eléctrico 
Calibrar com proteínas de peso molecular conhecido 
Determinação	
  do	
  peso	
  molecular	
  das	
  proteínas	
  
Solução	
  para	
  o	
  gel	
  separador	
  desnaturante	
  12%	
  acrilamida	
  (Laemmli,	
  1970)	
  
1.Solução	
  de	
  acrilamida:bis-­‐acrilamida	
  29:1	
  (p/p)	
  30%	
  (p/v)	
  ..............4	
  ml	
  	
  
2.Tampão	
  Tris-­‐HCl	
  1,5	
  M	
  pH	
  8,8	
  ……………………………………………………….2,5	
  ml	
  
3.	
  SDS	
  	
  10%	
  (p/v)	
  …………………………………………………………....................	
  100	
  μl	
  
4.	
  Água	
  deionizada	
  ............................................................................	
  3,35	
  ml	
  
5.	
  Solução	
  aquosa	
  de	
  persulfato	
  de	
  amônio	
  10%	
  (p/v)	
  ........................	
  100	
  μl	
  
6.	
  TEMED	
  ...............................................................................................	
  10	
  μl	
  
	
  	
  
	
  
Solução	
  para	
  o	
  gel	
  concentrador	
  desnaturante	
  4%	
  acrilamida	
  (Laemmli,	
  1970)	
  
	
  
1.Solução	
  de	
  acrilamida:bis-­‐acrilamida	
  29:1	
  (p/p)	
  30%	
  (p/v)	
  .............	
  260	
  μl	
  
6.	
  Tampão	
  Tris-­‐HCl	
  0,5	
  M	
  pH	
  6,8………………………….................................0,5ml	
  
3.	
  SDS	
  	
  10%	
  (p/v)	
  …………………………………………………………....................	
  …	
  20	
  μl	
  
4.	
  Água	
  deionizada	
  ................................................................................1,22	
  ml	
  
5.	
  Solução	
  aquosa	
  de	
  persulfato	
  de	
  amônio	
  10%	
  (p/v)	
  ........................	
  20	
  μl	
  
6.	
  TEMED	
  ...............................................................................................	
  2	
  μl	
  
	
  	
  
	
  
Soluções	
  estoques	
  para	
  cada	
  item	
  a	
  ser	
  usado	
  na	
  solução	
  dos	
  géis	
  
Solução	
  para	
  o	
  gel	
  separador	
  desnaturante	
  12%	
  acrilamida	
  (Laemmli,	
  1970)	
  
1.Solução	
  de	
  acrilamida:bis-­‐acrilamida	
  29:1	
  (p/p)	
  30%	
  (p/v)	
  ..............4	
  ml	
  	
  
2a.Tampão	
  Tris-­‐HCl	
  1,5	
  M	
  pH	
  8,8	
  ……………………………………………………….2,5	
  ml	
  
3.	
  SDS	
  	
  10%	
  (p/v)	
  …………………………………………………………....................	
  100	
  μl	
  
4.	
  Água	
  deionizada	
  ............................................................................	
  3,35	
  ml	
  
5.	
  Solução	
  aquosa	
  de	
  persulfato	
  de	
  amônio	
  10%	
  (p/v)	
  ........................	
  100	
  μl	
  
6.	
  TEMED	
  ...............................................................................................10	
  μl	
  
	
  	
  
	
  
Solução	
  para	
  o	
  gel	
  concentrador	
  desnaturante	
  4%	
  acrilamida	
  (Laemmli,	
  1970)	
  
	
  
1.Solução	
  de	
  acrilamida:bis-­‐acrilamida	
  29:1	
  (p/p)	
  30%	
  (p/v)	
  .............	
  260	
  μl	
  
2b.	
  Tampão	
  Tris-­‐HCl	
  0,5	
  M	
  pH	
  6,8………………………….................................0,5ml	
  
3.	
  SDS	
  	
  10%	
  (p/v)	
  …………………………………………………………....................	
  …	
  20	
  μl	
  
4.	
  Água	
  deionizada	
  ................................................................................1,22	
  ml	
  
5.	
  Solução	
  aquosa	
  de	
  persulfato	
  de	
  amônio	
  10%	
  (p/v)	
  ........................	
  20	
  μl	
  
6.	
  TEMED	
  ...............................................................................................	
  2	
  μl	
  
	
  	
  
	
  
Soluções	
  estoques	
  para	
  cada	
  item	
  a	
  ser	
  usado	
  na	
  solução	
  dos	
  géis	
  
Tampão	
  de	
  corrida	
  eletroforese	
  desnaturante	
  
Tris	
  base	
  ........................................................................................	
  0,755	
  g	
  
Glicina	
  ...............................................................................................	
  3,6	
  g	
  
SDS	
  .................................................................................................	
  0,25	
  g	
  
	
  	
  
Água	
  desMlada	
  q.s.p.	
  ......................................................................	
  250	
  ml	
  
	
  	
  
	
  	
  
Preparo	
  do	
  tampão	
  de	
  corrida	
  	
  
A	
  receita	
  é	
  para	
  250ml	
  mas	
  iremos	
  preparar	
  500ml.