Determinação do Ponto Isoelétrico da Caseína - UFPE

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Universidade Federal de Pernambuco 
Centro de Tecnologia e Geociências 
Departamento de Engenharia Química 
Química Industrial – Bioquímica Aplicada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Determinação do Ponto Isoelétrico da 
Caseína 
 
Everton Fidelis 
Lucas Fernando 
Mellina Praxedes 
Marcela Lima 
Pedro Gabriel 
Vanessa Silva 
 
 
 
 
 
 
Recife, 2016 
 
 
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1. Introdução 
 
Em geral, as proteínas são macromoléculas orgânicas formadas por aminoácidos ligados 
por ligações peptídicas. Elas apresentam diversas funções no organismo como: estrutural, 
hormonal, enzimática, imunológica, nutritiva e de transporte citoplasmático. 
O leite contém de 30 a 36 g/L de proteínas, que são classificadas como caseínas e 
proteínas do soro. A fração de caseína no leite pode ser encontrada em maior quantidade na 
forma de agregados coloidais chamados de micelas. A micelas são constituídas de água, 
proteína e de sais. A caseína encontra-se na forma de caseinato, ligados principalmente a cálcio 
e magnésio. Isso contribui para a solubilização das altas concentrações de cálcio e fosfato e 
fluidização das moléculas de caseína. 
 Durante a hidratação, a interação entre a água e a proteína são liberados resíduos de 
aminoácidos iônicos que provocam repulsão eletrostática entre as moléculas de proteína devido 
a carga liquida positiva ou negativa em qualquer pH diferente do isoelétrico. Em valores abaixo 
desse pH, a proteína apresenta carga líquida positiva, devido à protonação dos grupos básicos 
(-NH2), e acima deste apresenta carga líquida negativa. Porém no pH isoelétrico, o número de 
cargas positivas equivale ao número de cargas negativas e este é denominado ponto isoelétrico 
(PI). 
No pH isoelétrico, as propriedades físicas de uma proteína são mínimas. Por exemplo, 
a mobilidade em um campo elétrico, pressão osmótica, viscosidade e solubilidade são mínimas. 
Essas características são usadas para a determinação do ponto isoelétrico (Powar, C.B., and 
Chatwal, G.R). Neste ponto a falta de repulsão eletrostática promove a agregação e a 
precipitação por meio de interações hidrofóbicas. 
Em pH 4,5 – 4,6, a caseína, proteína majoritária do leite, precipita em seu ponto 
isoelétrico, coalhando o leite, que mais tarde poderá ser usado para a produção de queijo. 
 
 
 
2. Objetivo 
 
Determinar experimentalmente o ponto isoelétrico da caseína. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3. Materiais 
 
 
 Ácido acético 1,0 mol/L 
 Água destilada 
 Balão volumétrico de 50,0mL 
 Banho-maria 
 Bastão de vidro 
 Béqueres 
 Centrífuga 
 Estante para tubo de ensaio 
 Funil 
 Hidróxido de sódio 1,0mol/L 
 Leite desnatado 
 Pipeta graduada 
 Potenciômetro 
 Proveta 
 Recipiente para centrífuga 
 Tubos de ensaio 
 Tubo falcon 
 
 
 
4. Procedimento experimental 
 
Com auxílio de uma proveta, mediu-se 50,0 mL de leite desnatado, o volume foi transferido 
para dois tubos falcon de 25,0 mL e em sequência juntou-se ácido acético 1,0 mol/L até se 
observar precipitação. Em seguida, foram adicionados mais 5,0 mL do ácido acético 1,0 mol/L 
e levou-se a centrifugação a 3000 rpm por um período de 5 minutos. Decorrido o tempo, o 
sobrenadante foi desprezado. O precipitado depositado no fundo do tubo falcon foi ressuspenso 
com água destilada e levado a centrifugação, durante o mesmo período de tempo. Desprezou-
se novamente o sobrenadante. 
Paralelo, adicionou-se 25,0 mL de água destilada em um béquer, juntamente com 5,0 mL 
de NaOH 1,0 mol/L e os aqueceu em banho-maria a 40⁰C. Atingida a temperatura, verteu-se o 
precipitado de caseína até total dissolução. Observou-se certa turvação da solução, logo fez-se 
uso de filtração simples para eliminar sólidos suspensos antes de proceder com o procedimento. 
Com a solução devidamente livre dos sólidos, transferiu-se para um balão volumétrico de 
50,0 mL, adicionou-se 5,0 mL de ácido acético 1,0 mol/L e avolumou com água destilada. 
Nove tubos de ensaio foram preparados. No tubo 1, 6,8 mL de água destilada e 3,2 mL de 
ácido acético 1,0 mol/L foram adicionados e levou-se a agitação. Nos tubos 2 a 9, 8,0 mL de 
água destilada foram vertidos e em seguida uma alíquota do tubo 1, foi transferida para o tubo 
2. O procedimento repetiu-se para todos os tubos, retirou-se uma alíquota de 2,0 mL e 
transferiu-se para o tubo seguinte. 
 
 
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Procedendo com o procedimento, a cada um dos tubos transferiu-se 1,0 mL da solução de 
caseína contida no balão. Após a transferência, agitou-se e observou-se o resultado. 
Observações visuais do estado físico de cada tubo foram devidamente anotadas. 
Esperou-se por um período de 15 minutos para que procedesse com as leituras dos valores 
de pH de cada tubo, fazendo-se uso de um potenciômetro. 
Com os resultados dos valores de pH, juntamente com as observações visuais das soluções 
contidas nos tubos, foi possível determinar o ponto isoelétrico da caseína. 
 
5. Resultados e discussões 
 
É sabido que o ponto isoelétrico de uma molécula é o valor de pH, no qual ela apresenta 
equivalências de suas cargas positivas e negativas, medições do pH das soluções contidas nos 
tubos de ensaios foram realizadas (tabela 1) para determinação do tal. 
 
Tabela 1: resultados do pH das soluções dos tubos de 1 a 9. 
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
pH 3,50 4,36 4,89 5,23 5,38 5,42 5,41 5,37 5,38 
 
 
Atrelado às medições de pH, fez-se observações visuais das características físicas das soluções 
para que o ponto isoelétrico da caseína fosse devidamente determinado (tabela 2). 
 
 
Tabela 2: observações visuais das soluções dos tubos de 1 a 9. 
Tubos Observações visuais 
1 Levemente turvo 
2 Turvo com presença de precipitado 
3 Levemente turvo com presença de precipitado 
4 Extremamente turvo com presença de 
precipitado 
5 Turvo 
6 Turvo 
7 Turvo 
8 Turvo 
9 Turvo 
 
 
A estabilidade da caseína é dada de acordo com a conformação de seus aminoácidos. 
Em soluções fortemente ácidas ou básicas a carga líquida da proteína difere de zero o que a faz 
manter-se interagindo eletrostaticamente com a solução através de resíduos de aminoácidos 
iônicos. Isto explica o porquê de os tubos 1 e 5 a 9 não apresentaram precipitado, visto que as 
cargas positivas e negativas nestes casos diferiram. 
Já os tubos 2, 3 e 4 apresentaram presença de precipitado branco, indicando que a 
quantidade de íons hidrônio presentes na solução é suficiente para se equivaler a carga das 
 
 
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moléculas da caseína igualando sua carga líquida a zero e consequentemente atingir o ponto 
isoelétrico. Neste ponto, ocorre a falta de repulsão eletrostática promovendo a agregação das 
moléculas e interação hidrofóbica, confirmada pela presença do precipitado. 
 
Imagem 1: tubos de ensaios após adição de 1,0 mLde caseína. 1 a 9, da esquerda para direita 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
É notório também que, embora não apresentem precipitado os tubos 5, 6, 7, 8 e 9 
apresentam turbidez acentuada em relação ao tubo 1 (ver-se imagem 1). Uma explicação para 
o ocorrido é que ao adicionarmos ácido na primeira etapa do procedimento, além de 
precipitarmos a caseína e modificamos suas moléculas de forma que o cálcio, fator que a faz 
ser solúvel por formação de sal, é eliminado com o soro na forma de fosfato de sódio. E apesar 
de a acidificação ser um fator primordial para reduzir a carga e a hidratação das proteínas, ela 
fragiliza as ligações que mantêm as micelas de caseínas juntas, deixando-as mais escassas numa 
faixa de pH 5,2 a 5,3.6 
 
6. Conclusão 
 
 De acordo com a literatura, o ponto isoelétrico da caseína, proteína purificada e 
insolúvel em água, compreende-se entre 4,5 e 4,6. O resultado obtido neste experimento 
compreende-se nas leituras de pH realizadas nos tubos 2, 3 e 4, pH de 4,36 a 5,23. Nesses tubos 
foi notória alto grau de turbidez da solução com presença de precipitado branco, indicando a 
insolubilidade da caseína ao atingir seu ponto isoelétrico. 
Pequenos erros operacionais, variações de calibração de vidrarias, bem como a falta da 
leitura da temperatura real da solução pelo potenciômetro à medida que se fez as leituras de pH 
devem ser levados em consideração para que não existisse exatidão no valor obtido. 
 
7. Referências bibliográficas 
 
[1]. Walstra, P.. Food Science and Technology: Dairy Technology, Volume Vol. 90: Principles 
of Milk Properties and Processes. New York, US: CRC Press, 1999. ProQuest ebrary. Web. 19 
August 2016. 
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Somerset, GB: Wiley, 2014. ProQuest ebrary. Web. 19 August 2016. 
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Nutrition: Production, Composition and Health (1). Somerset, GB: Wiley-Blackwell, 2013. 
ProQuest ebrary. Web. 19 August 2016. 
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Porto Alegre: Artmed, 2010. 
[5]. O’CONNELL, J. E.; FOX, P. F. The two-stage coagulation of milk proteins in the minimum 
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[6]. O’CONNELL, J. E.; KELLY, A. L.; FOX, P. F.; DE KRUIF, K. G. Mechanism for the 
ethanol dependent heat-induced dissociation of casein micelles. Journal of Agricultural and 
Food Chemistry, v. 49, p. 4424-4428, 2001.