Determinacao do Ponto Isoeletrico e precipitacao das proteinas de amostras biologicas

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Curso Técnico em Biotecnologia 
Processos Bioquímicos 
 
 
 
 
Determinação do Ponto Isoelétrico e precipitação das proteínas 
de amostras biológicas 
 
 
NOTA: 9,5 
 
Gabriele Mentz 
Nathalia Gonçalves 
Pâmela Stradolini 
 
 
 
 
 
 
Profº. Dra. Alessandra Nejar Bruno e Dr. Leonardo da Silva Bittencourt 
 
 
Porto Alegre, 18 de Outubro de 2019 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
1.1 PROTEÍNAS 
Proteínas são polímeros de aminoácidos responsáveis por controlar 
praticamente todos os processos que ocorrem dentro de uma célula. As proteínas de 
cada organismo, da mais simples das bactérias aos seres humanos, são construídas a 
partir do mesmo conjunto onipresente de 20 aminoácidos (Nelson e Cox, 2019). 
As proteínas têm muitos papéis importantes no corpo; diferentes da gordura e 
do glicogênio, elas não são apenas uma reserva de substratos energéticos. A proteína 
muscular é essencial para o movimento corporal. Outras proteínas funcionam como 
enzimas (catalisadores de reações bioquímicas) ou como componentes estruturais de 
células e tecidos (Nelson e Cox, 2019). 
Os 20 aminoácidos comumente encontrados nas proteínas estão unidos entre 
si por ligações peptídicas. A sequência linear dos aminoácidos ligados contém a 
informação necessária para formar uma molécula proteica com estrutura 
tridimensional única (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
A estrutura de grandes moléculas, tais como proteínas, pode ser descrita em 
vários níveis de complexidade, arranjada em um tipo de hierarquia conceitual. Quatro 
níveis de estrutura proteica são comumente definidos (Nelson e Cox, 2019). 
 
 
Figura 1 - Níveis estruturais de proteína - Princípios de Bioquímica de Lehninger; Nelson e Cox 2019. 
1.1.1 Estrutura Primária 
 
A sequência de aminoácidos em uma proteína é denominada estrutura primária 
da proteína. A sequência linear dos aminoácidos ligados contém a informação 
necessária para formar uma molécula proteica com estrutura tridimensional única 
(Harvey e Ferrier, 2012). 
 
 
Figura 2- Estrutura Primária de proteína – Bioquímica ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012 
1.1.1.1 Ligação Peptídica 
Nas proteínas, os aminoácidos são unidos covalentemente por ligações 
peptídicas, as quais são ligações amida entre o grupo a-carboxila de um aminoácido e 
o grupo a-amino de outro. As ligações peptídicas não são rompidas por condições 
desnaturantes, como aquecimento ou altas concentrações de ureia. Deve haver uma 
exposição prolongada a um ácido ou a uma base forte em temperaturas elevadas para 
hidrolisar essas ligações de forma não enzimática (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
• Características das ligações peptídicas: A ligação peptídica tem um caráter 
de dupla-ligação parcial, ou seja, é mais curta do que uma ligação simples, 
além de rígida e planar. 
 
 
Figura 3 - Características das ligações peptídicas - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
A ligação peptídica geralmente é uma ligação trans, em grande parte devido à 
interferência estérica dos grupos R quando em posição cis (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
 
1.1.2 Estrutura Secundária 
Estrutura secundária se refere a qualquer segmento de uma cadeia 
polipeptídica e descreve o arranjo espacial de seus átomos na cadeia principal, sem 
considerar a posição de suas cadeias laterais ou sua relação com outros segmentos 
(Nelson e Cox, 2019). 
 
O esqueleto polipeptídico não assume uma estrutura tridimensional aleatória, mas, em 
vez disso, geralmente forma arranjos regulares de aminoácidos que estão localizados 
próximos uns aos outros na sequência linear (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
 
Figura 4 - Estrutura de proteína Secundária - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
 
1.1.2.1 α Hélice 
Apresenta estrutura helicoidal, que consiste em um esqueleto polipeptídico 
central espiralado e bem compacto, com as cadeias laterais dos aminoácidos que a 
compõem estendendo-se para fora do eixo central, de modo a evitar a interferência 
estérica entre si (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
1.1.2.3 Folha β 
Outra forma de estrutura secundária, na qual todos os componentes da ligação 
peptídica estão envolvidos com ligações de hidrogênio. As superfícies das folhas β 
apresentam uma aparência "pregueada" e, portanto, essas estruturas são 
frequentemente denominadas ''folhas β pregueadas". Ao contrário da α hélice, as 
folhas β são compostas de duas ou mais cadeias peptídicas ou segmentos de cadeias 
polipeptídicas, que se apresentam quase totalmente estendidos. Nas folhas β as 
ligações de hidrogênio são perpendiculares ao esqueleto polipeptídico (Harvey e 
Ferrier, 2012). 
 
1.1.2 Estrutura Terciária e Quaternária 
A estrutura primária de uma cadeia polipeptídica determina sua estrutura 
terciária (Harvey e Ferrier, 2012). O arranjo tridimensional total de todos os átomos de 
uma proteína é chamado de estrutura terciária. Enquanto o termo “estrutura 
secundária” se refere ao arranjo espacial dos resíduos de aminoácidos adjacentes em 
um segmento polipeptídico, a estrutura terciária inclui aspectos de alcance mais longo 
da sequência de aminoácidos (Nelson e Cox, 2019). 
 
Figura 5 - Estrutura de Proteína terciária - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
Algumas proteínas contêm duas ou mais cadeias polipeptídicas distintas, ou 
subunidades, que podem ser idênticas ou diferentes. O arranjo destas subunidades 
proteicas em complexos tridimensionais constitui a estrutura quaternária. 
 
 
Figura 6 - Estrutura de Proteína Quaternária - Bioquímica Ilustrada; Harvey e Ferrier, 2012. 
1.2 SOLUBILIDADE 
 
A solubilidade das proteínas é determinada por três fatores principais: grau de 
hidratação, densidade e distribuição de cargas ao longo da cadeia e presença de 
substâncias não-protéicas como fosfatos, carboidratos e lipídios, que podem 
apresentar efeito estabilizante (Zuñiga, 2003). 
 
Para que uma proteína se solubilize, deve interagir com o solvente por meio de 
pontes de hidrogênio, dipolo-dipolo, e interações iônicas. A solubilidade é função 
principalmente do pH, força iônica, tipo de solvente e temperatura (FENNEMA, 1993). 
 
A insolubilidade completa das proteínas produz um precipitado, que ocorre 
quando várias moléculas do polipeptídio se aproximam de tal forma, que produzem 
agregados de proteína suficientemente grandes, visíveis a olho nú e que podem ser 
centrifugados em baixa força. Estes agregados são formados por ajuste do pH no 
ponto isoelétrico da proteína, com a adição de sal, uso de certos solventes ou 
combinação destes com a temperatura (ARAÚJO, 1999). Em valores de pH superiores 
ou inferiores ao do ponto isoelétrico, a proteína apresenta cargas positivas ou 
negativas e as moléculas de água podem interagir com estas cargas, contribuindo 
assim para a solubilização (FENNEMA, 1993). 
1.3 DESNATURAÇÃO 
A desnaturação proteica resulta no desdobramento e na desorganização das 
estruturas secundária e terciária, sem que ocorra hidrólise das ligações peptídicas. Os 
agentes desnaturantes incluem calor, solventes orgânicos, agitação mecânica, ácidos 
ou bases fortes, detergentes e íons de metais pesados, como chumbo e mercúrio. A 
desnaturação pode, sob condições ideais, ser reversível; nesse caso, a proteína 
dobra-se novamente em sua estrutura original (nativa) quando o agente desnaturante 
for removido. Entretanto, as proteínas, em sua maioria, uma vez desnaturadas, ficam 
permanentemente desordenadas. As proteínas desnaturadas são, com frequência, 
insolúveis; portanto, precipitam quando em solução (Harvey e Ferrier, 2012). 
 
1.4 PONTO ISOELÉTRICO 
 
O ponto isoelétrico (pi) é o pH no qual um aminoácido é eletricamente neutro, 
ou seja, a soma das cargas positivas é igual à soma das cargas negativas. Para um 
aminoácido como a alanina, por exemplo,que apresenta apenas dois hidrogênios 
dissociáveis (um do grupo a-carboxila e um do grupo a-amino), o pi é a média entre 
pK, e pK2. Assim, o PIpi está a meio caminho entre o pK1 e o pK2. Ele corresponde 
ao pH em que predomina a Forma li (com carga líquida igual a zero) e em que há 
também quantidades iguais das Formas 1 (carga líquida +1) e Ili (carga 1 íquida -1) 
(Harvey e Ferrier, 2012). 
 
1.5 APLICAÇÃO 
 
A importância da aplicação dessa técnica na biotecnologia acontece pelo 
motivo de ser uma técnica barata, fácil, versátil, rápida e eficiente para desnaturar e 
precipitar todas as proteínas de uma amostra biológica utilizando as propriedades da 
mesma, como as cargas e estruturas visando a separação ou o isolamento de 
proteínas de uma determinada amostra biológica. . 
Essa técnica é muito útil, por exemplo, para desenvolver alimentos para 
pessoas com intolerância à lactose, um distúrbio digestivo onde o organismo não 
digere ou digere parcialmente o açúcar do leite e derivados, que ocorre quando produz 
uma quantidade insuficiente ou não produz a enzima lactase, que quebra a lactose, 
açúcar do leite (BRUNA, 2014). 
 
2. OBJETIVO 
 
- Verificar experimentalmente a precipitação de proteínas com e sem desnaturação. 
- Determinar o ponto isoelétrico médio das proteínas de amostras biológicas. 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
Comentado [A1]: Aqui o mecanismo pelo qual cada 
agente desnaturante atua poderia ser explicado! 
Comentado [A2]: Aqui poderiam ser incluídas informações 
sobre como obter o ponto isoelétrico de forma mais exata, a 
importância disto e introduzir conceitos sobre titulação, 
3.1 Materiais 
 
Para o ponto Isoelétrico: 
• 1 Estante para tubos de ensaio 
• 7 tubos de ensaio de vidro 
• Água destilada 
• 8mL de Ácido acético 0,1 M 
• 7 mL de Amostras protéicas (leite, claro de ovo e solução de proteína isolada 
de soja). 
• Indicador de pH ou potenciômetro 
• 3 pipetas de vidro de 5mL 
• 1 pipeta de vidro de 1mL 
• 1 micropipeta de 40-200 uL 
• 1 micropipeta de 200- 1.000 uL 
 
Para a precipitação de proteínas: 
• 6 Tubos Falcon de 15 ml 
• 2 tubos de vidro grande 
• 8 ml de clara de ovo 
• 15 ml de leite 
• 4 ml de solução saturada de (NH4)2SO4 (sulfato de amônio) – aprox. 4 M 
• 35 ml tampão fosfato ph 7,0 
• 2 ml da solução de acetato de chumbo 20% 
• 2 ml ácido tricloroacético 10% 
• Pêras 
• 3 pipetas de vidro de 2 ml; 3 pipetas de vidro de 5ml; 2 pipetas de vidro de 1ml 
• 1 béquer de vidro de 2 L para banho maria 
• Banho maria 
• Centrífuga com adaptador para tubos falcon 
 
3.2 Métodos 
 
Para o ponto isoelétrico: 
Para a determinação do ponto isoelétrico, em tubos de ensaio foram pipetados água 
destilada, ácido acético e a solução proteica conforme a tabela abaixo: 
 
Nº do tubo 0 1 2 3 4 5 6 
Água destilada (mL) 4,5 4,4 4,3 4,0 3,5 2,5 0,5 
Ácido acético 0,1 M (mL) 0,0 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0 
Solução protéica (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 
 
 
 
Para a precipitação de proteínas: 
Experimento 1. Precipitação por sais 
1. Foram adicionados, em 2 tubos falcon, 2 mL da solução protéica a ser 
testada. Nosso grupo testou o leite de vaca. 
2. Em um dos tubos contendo já o leite, foram adicionados, pelas paredes do 
tubo, 2 mL da solução de sulfato amônio -(NH4)2SO4; 
3. No tubo controle com o leite, foram adicionados 2mL de tampão fosfato 
(PBS) pH 7,0, ao invés de (NH4)2SO4. 
4. Ambos foram misturados, por inversão, e o resultado foi anotado e 
comparado com o tubo contendo o sal (tubo teste) e o tubo controle; 
5. As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos; 
6. O sobrenadante foi descartado e observado o tamanho do pellet formado; 
Experimento 2. Precipitação por metais pesados 
1. Foi adicionado, em 2 tubos falcon de centrífuga, 1 mL de leite; 
2. Em um dos tubos, foi adicionado 1 mL da solução de acetato de chumbo -
(CH3COO)2Pb; 
3. No outro tubo (controle), foi adicionado 1 mL de PBS ao invés de acetato de 
chumbo. 
4. Ambos foram misturados por inversão; 
Experimento 3. Precipitação por ácidos fortes 
1. Foi adicionado, em um tubo falcon de centrífuga, 1 mL de leite; 
2. No mesmo tubo, foi adicionado 1 mL da solução de Ácido tricloroacético 10% 
(ou outro ácido forte a 10%). 
3. A amostra foi misturada por inversão; 
Experimento 4. Precipitação pelo calor 
1. Foram adicionados a um tubo de ensaio de vidro 3 mL de solução de leite. 
2. O tubo foi colocado em banho-maria fervente por 15 minutos. 
3. O grupo fez a observação e anotação dos resultados para fazer a 
comparação dos experimentos posteriormente. 
4. RESULTADOS 
 
Experimento 1. Precipitação por sais 
 
Figura 7 - Comparação da amostra onde formou o pellet de caseína com a amostra controle. 
 
Comentado [A3]: Faltou alguma figura sopbre o 
experimento de ponto isoelétrico e/ou a descrição do 
mesmo por se tratar de uma técnica qualitativa. 
Figura 8 - Pellet de caseína formado através da precipitação de sais após centrifugação da amostra. 
 
 
Experimento 2. Precipitação por metais pesados 
 
Figura 9 - Figura 7 - Amostra de leite mais acetato de chumbo. 
 
Figura 10 - Amostra controle dos experimentos 2 e 3. 
 
 
Experimento 3. Precipitação por ácidos fortes 
 
Figura 11 - Amostra de leite mais ácido tricloroacético. 
Experimento 4. Precipitação pelo calor 
 
Figura 12 - Amostra de leite precipitada por calor, com pouca formação de uma "nata" 
5. CONCLUSÃO E DISCUSSÕES 
• Ponto Isoelétrico 
 
De acordo com a literatura, o ponto isoelétrico da caseína, proteína purificada e 
insolúvel em água, compreende-se entre 4,5 e 4,6 (CITAÇÃO???). O resultado obtido 
neste experimento compreende-se na leitura de pH realizado no tubo 4 com 3,5 mL de 
agua destilada, 1 mL de ácido acético 0,1M e com o 1mL de leite, apresentou uma 
precipitação mais evidente em relação aos outros tubos, significando que o pH em 5,7 
aproximadamente, se encontra em ponto isoelétrico. A solubilidade das proteínas, 
como foi explicado em aula, depende de vários fatores. Dentre eles, o principal é a 
presença das cargas elétricas ao longo da molécula. A existência de uma carga 
positiva ou negativa determina a interação com o meio aquoso, além de estabelecer 
um estado de repulsão entre as próprias moléculas de proteína, aumentando a 
interação com o solvente e, consequentemente, favorecendo a solubilidade. Como 
vimos, no ponto isoelétrico existe um equilíbrio entre o número de cargas positivas e 
negativas, o que gera uma situação em que as forças de repulsão entre as moléculas 
de proteína e as forças de interação com o solvente são mínimas, por isso a 
solubilidade é mínima neste ponto. Assim, as proteínas vão formando aglomerados 
que, cada vez maiores, tendem a precipitar. 
Pequenos erros operacionais, variações de calibração de vidrarias, bem como 
a falta da leitura da temperatura real da solução pelo potenciômetro à medida que se 
fez as leituras de pH devem ser levados em consideração para que não existisse 
exatidão no valor obtido. Saber o método de se medir o ponto isoelétrico é importante 
sendo eficiente apesar dos erros ocorridos. 
 
• Precipitação de proteínas 
Foi observado durante o experimento, quando ocorreu a precipitação de 
proteínas que a principal propriedade observada foi: a solubilidade. A diminuição de 
solubilidade em algumas amostras, é explicada pela exposição de radicais apolares 
(hidrofóbicos) e outros, os quais prejudicam a interação proteína-solvente e favorecem 
a interação proteína-proteína, formando um precipitado. Além da solubilidade 
alterações como a viscosidade da solução foram observadas nas amostras,assim 
como em algumas também houve a alteração de coloração. 
O sal utilizado, sulfato de amônio (NH4)2SO4, devido a sua propriedade em 
baixa concentração pode aumentar a solubilidade de muitas proteínas (solubilização 
por salificação), isso porque a interação da proteína com o sal causa a diminuição da 
interação proteína-proteína. Já em concentrações elevadas, a solubilidade da proteína 
se reduz gradativamente (precipitação por salificação), isso porque acredita-se que a 
concentração elevada de sal pode remover água de hidratação das moléculas 
proteicas, levando a um aumento na interação proteína-proteína, ocorrendo 
precipitação. Após a adição do sal nós utilizamos a centrífuga para acelerar o 
processo de precipitação, porém, se esperássemos por muito tempo conseguiríamos 
observar a mudança do conteúdo do tubo do mesmo jeito. 
A precipitação por metal pesado foi utilizado o acetato de chumbo 
(CH3COO)2Pb, a adição de sais de metais pesados, tais como mercúrio, chumbo, 
cobre, zinco levam a formação de sais denominados “quelatos’’ entre os aminoácidos 
ácidos e estes metais. As proteínas precipitam porque estes sais são insolúveis em 
água e também porque, com a quebra das ligações iônicas, os aminoácidos 
hidrofóbicos ficam mais expostos ao meio aquoso. Os metais pesados (Pb, Hg, Ag, 
Cu) causam a desnaturação de proteínas, isto é, modificam a sua conformação natural 
com a atividade biológica, para uma conformação não natural, biologicamente inativa 
(desnaturada). As moléculas proteicas desnaturadas precipitam porque o chumbo é 
insolúvel em água. Os metais pesados precipitam as proteínas por desnaturação. 
O ácido forte utilizado no experimento “precipitação de proteínas” foi o ácido 
tricloroacético 10%. Quando a proteína está com pH abaixo do ponto isoelétrico, as 
bases provenientes de ácidos fortes são exemplos de íons negativos que se 
combinam com partes positivas de proteínas, formando complexos insolúveis, que 
precipitam na solução. Como exemplos dessas bases podemos citar os alcaloides, 
uma classe de compostos naturais, e as bases derivadas do ácido tricloroacético 
(TCA). Esses reagentes também têm ação desnaturante, ou seja, provocam a perda 
da conformação tridimensional da proteína de forma irreversível. Consequentemente, 
a proteína separada por esse método perde a sua função. 
Precipitação por ação de calor, o calor fornecido a proteína provoca 
desestabilização das interações fracas (pontes de hidrogênio, interações dipolo-dipolo, 
interações de Van der Vaals, etc.) acarretando em um desarranjo da conformação 
tridimensional desta estrutura. Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação e 
altera as estruturas secundária, terciária e quaternária das proteínas, não afetando 
suas estruturas primárias (pontes dissulfeto e ligações covalentes não são afetadas). 
A desnaturação promove alterações na solubilidade da proteína, levando à sua 
precipitação. Com o aquecimento da solução de proteínas, verificou-se precipitação. 
Ao realizar os experimentos, foi possível observar a propriedade da proteína 
aqui discutida, a solubilidade. E, de acordo com a observação e o estudo detalhado, 
conclui-se que as proteínas sofrem alterações causadas pela desnaturação quando 
expostas ao calor, ácidos, sais, metais pesados, entre outros, que resultam na 
diminuição da solubilidade, perda de atividade, alteração na viscosidade, etc. Sendo o 
melhor método a precipitação por sais em conjunto da centrífuga. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
ARAUJO, J.M.A ., Química de Alimentos - Teoria e Prática, editora UFV. 1999. 
P.275-309. 
BRUNA, Maria Helena Varella. Intolerância à Lactose. 2014. Disponível em: 
<https://drauziovarella.uol.com.br/doencas-e-sintomas/intolerancia-a-lactose/>. Acesso 
em: 18 out. 2019. 
FENNEMA, O. R. Aminoácidos, péptidos y proteínas. IN: Química de los alimentos. 
Zaragoza, Espanha: Ed Acribia 1993. p. 275-414. 
HARVEY, A., Ferrier, D; Bioquímica ilustrada - 5. ed. - Porto Alegre : Artmed, 2012. 
NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 5. ed. Porto 
Alegre: Artmed, 2011 
NELSON, L.. Cox, M; Princípios de Bioquímica de Lehninger - 6. ed. – Porto Alegre 
: Artmed, 2014. 
NELSON, David L.; COX, Michael M.; Princípios de Bioquímica de Lehninger - 7. 
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VOLHARDT, K. et al; Química Orgânica – Estrutura e Função 6ª edição; 2013. 
ZUÑIGA, A.D.G. Estratégia de purificação das proteínas α-lactoalbumina e β- 
lactoalbumina do soro do queijo, Viçosa, Minas Gerais, 2003.