Resumo virologia

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Resumo virologia
Prova 01
Estrutura e classificação dos vírus
O que é um vírus?
 a) São microorganismos que se replicam sempre dentro de células vivas;
 b) Utilizam (em maior ou menor grau) o sistema de síntese das células;
 c) Induzem a síntese de proteínas capazes de transferir o genoma viral para outras
 células. 
Objetivos
famílias de vírus e se tem DNA ou RNA
genoma: simples? dupla? fechada? aberta? senso +? -?
estrutura e morfologia
virion X virus
virion⇒ sai de uma célula até a outra
virus⇒ dentro da celula
Virion estrutura
Genoma ou Núcleo
RNA ou DNA.
 Por vezes, o genoma está envolto em uma camada de proteínas distinta do capsídeo. 
Tipos de ácido nucleico viral
FITA SIMPLES de DNA (fsDNA); 
FITA DUPLA de DNA (fdDNA); 
FITA SIMPLES de RNA (fsRNA); 
Vírus cujo genoma tem a mesma orientação do mRNA, chamado genoma de polaridade positiva, ou simplesmente genoma de fita simples positiva; 
Vírus cujo genoma tem a orientação inversa do mRNA, chamados de polaridade negativa, ou genoma de fita simples negativa. 
FITA DUPLA de RNA (fdRNA). 
Capsídeo
protege o DNA e o RNA 
pode incluir as proteínas necessárias na penetração da célula
íntegro dependente do pH e temperatura
interior⇒ fortemente hidrofóbica
partículas e cargas apresentam grande importância
Composição essencialmente protéica. 
Composto por um número variável de proteínas. Alguns vírus: possuem uma "matriz" protéica, que preenche o espaço entre o genoma e o envelope (ex. herpes vírus, paramixovírus). 
Esta matriz, também protéica, exerce funções variáveis dentro da multiplicação ou encapsidação viral. 
Simetria do nucleocapsídeo
Icosaédrica ou cúbica: picornavírus, parvovírus, adenovírus; 
Helicoidal : rhabdovirus, filovírus, bunyavírus; 
Complexa: somente os poxvírus, mais complexos do que os demais. 
Envelope
O envelope viral, presente em vírus de algumas famílias, origina-se de membranas da célula hospedeira através de brotamento, que ocorre durante o egresso de vírions maduros da célula hospedeira. 
Essa membrana freqüentemente é derivada de uma região da membrana plasmática, mas pode originar-se também das membranas do aparelho de Golgi, do retículo endoplasmático ou da membrana nuclear, dependendo do vírus e do compartimento celular onde ocorre a replicação. 
As proteínas do envelope são codificadas pelo vírus e constituem-se em sua maioria de glicoproteínas. 
O número de proteínas do envelope pode variar de uma até mais de dez, dependendo do vírus. 
As glicoproteínas do envelope desempenham várias funções, incluindo a ancoragem inicial do vírion na célula, penetração, fusão e disseminação do vírus entre células. 
Ao contrário dos vírus sem envelope, cuja liberação é quase sempre acompanhada de morte celular, o egresso de vírus envelopados é muitas vezes compatível com a sobrevivência da célula hospedeira. 
Portanto, o processo de brotamento representa um mecanismo de liberação de progênie viral sem induzir morte celular
Sistemas classificatórios
De acordo com o tipo de ácido nucleico
estratégia de replicação viral
morfologia do virion
Sorologia (metodologia clássica)
ICTV
sete ordens
caudovirales
herpesvirales
mononegavirales
nidovirales
picornavirales
David Baltimore
baseado no sistema genético e descreve estratégias replicativas distintas
I⇒ DNA dupla
 II⇒ DNA simples
III⇒ RNA dupla
IV RNA + ⇒ DNA- (Transcriptase reversa)
V⇒ RNA -
VI RNA- ⇒ RNA+
Multiplicação e replicação viral
Um vírus RNA é dito de "polaridade positiva" quando seu genoma tem a mesma polaridade ou orientação do mRNA. 
Em outras palavras, seu genoma pode servir como mRNA e portanto, iniciar a síntese de proteínas. 
Vírus que possuem genoma de RNA "positivo" possuem o genoma infeccioso. 
multiplicação: biomagnificação
Replicação: cópia da inf. genética
multiplicação precisa replicar o genoma
malhas gênicas regulatórias⇒ interação entre os vírus
Biomagnificação
Curva
adição de vírus
eclipse
crescente (rise)
Sítio de replicação define se é de DNA (núcleo) ou RNA (citoplasma)
Passos na replicação viral
adesão
penetração
Refere-se à introdução do ácido nucléico viral na célula, internalização do nucleocapsídeo via endocitose mediada por receptor, ou fusão do envelope viral com a membrana plasmática.
desnudamento
desmantelamento total ou parcial do capsídeo
transcrição de mrna early e proteínas early
tradução de proteínas early
 período antes da replicação do ácido nucléico, ocorre a produção de proteínas não estruturais. 
replicação
O RNA mensageiro (RNAm) é produzido e traduzido em proteínas. 
Independentemente do tipo (DNA ou RNA; cadeia simples ou dupla; segmentado ou não segmentado), o genoma deve ser capaz de originar RNAs mensageiros que sejam reconhecidos e traduzidos pela maquinaria celular de tradução. 
mrna e proteínas tardias
síntese dos componentes virais
Tardia ou "late" ⇒ ocorre a produção de proteínas estruturais. 
montagem
É a montagem completa das partículas víricas. 
A montagem dos vírus não-envelopados consiste primariamente da associação do genoma com as proteínas que formam o nucleocapsídeo. Esse processo ocorre espontaneamente através de interações entre proteínas e entre estas e o genoma. 
Na maturação dos vírus envelopados, o nucleocapsídeo adquire um envoltório externo
liberação
Na replicação dos vírus sem envelope, milhares de vírions recém formados são liberados pela morte e lise celular.
Nos vírus envelopados, a progênie viral é liberada através de brotamento, sem necessariamente implicar em morte celular. No entanto, muitos vírus envelopados também podem ser liberados pela morte e desintegração da célula. 
Ligação a célula (penetração)
Exploram a biomolécula da célula (endocitose)
Virion consegue fundir com o endossomo (pH)
A adsorção (ou ligação) depende da interação física entre os vírions e a superfície da célula-alvo. 
A adsorção é essencialmente uma interação ligante-receptor. 
Como conseqüência, a especificidade de células-alvo e de hospedeiros susceptíveis é determinada⇒ Sem adsorção/ligação a infecção não pode ocorrer.
sair da célula
clatrina
lise
brotamento
passagem p/ vizinhas
formação de sincícios
Virus da água e entéricos
Distribuição da água na terra
heterogênea 
maior parte salgada e subterrânea
No ambiente⇒ mais de 150 tipos de vírus lançados pelo esgoto
 Vírus entéricos são todos aqueles que são capazes de infectar as células do trato gastrointestinal, pois é neste local que encontram todas as condições necessárias para sua multiplicação
São eliminados com as fezes pelos indivíduos infectados durante períodos de tempo que variam de semanas a meses 
Vírus entéricos: Rotavírus, Adenovírus, Norovírus, Astrovírus
Vírus entéricos
Todos os capazes de infectar o TGI, eliminados durante as fezes
Mais comuns
rotavirus
norovirus
adenovirus
astrovirus
Vírus muito variados⇒ diferentes famílias
DNA ou RNA
capsídeo icosaédrico ou esférico
sem envoltório⇒ extremamente resistentes no ambiente
altamente resistentes a agentes químicos e físicos
diversos quadros clínicos
hepatite
diarreicos
outros
Circulação
Homem⇒ ambiente⇒ água e alimentos⇒ homem
Transmissão oral- fecal
Toda a prevenção envolve a melhora de hábitos de higiene
Contaminação de corpos d'água, solo e água subterrânea
Água do mar e alimentos marinhos
Geração de aerossóis
Dispersão de possíveis contaminantes sobre vegetais
Ciclo
se multiplicam no ciclo de entrada
atingem os órgãos alvo
paciente apresenta manifestações clínicas
Sintomas comuns
vomito 
diarreia aquosa
desidratação
febre
dores abdominais
Risco
dose infectante é baixa
transmissão fecal- oral
excretados em grande quantidade pelas fezes
resistentes a agentes químicos e físicos
filtros por leitos cultivados para tratamento de esgoto doméstico
Fatores que influenciam a infectividade viral
temperatura do ambiente
composição do solo
indice pluviométrico
Percolação
patógenos no solo
900 m/ dia (horizontal) e 350 m/ dia (vertical)
DesinfecçãoTratamento de esgoto
esgoto⇒ esgoto tratado⇒ fração aquosa e fração sólida
Fração aquosa
água de reuso
devolução ao ambiente
Fração dos sólidos
aterro sanitário
PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) E VACINAÇÃO
Vírus de DNA circular dupla fita (aprox 8 kpb)
Vírus pequenos não envelopados (aprox 50 nm)
Célula alvo: queratinócitos 
infecção altamente prevalente em humanos
tropismo anatômico evidente
Relação com tumores
classificação - aprox 40 infectam mucosa genital
baixo risco - lesões de baixo grau e verrugas
alto risco - lesões de alto grau e tumores invasivos
HPV e câncer cervical
⇒ HPV 16 e 18 - mais comumente associado a tumores cervicais
Epitélio uterino - região de transição/epitélio estratificado no colo do útero
Curso natural das infecções por HPV (persistência)
grande janela de detecção; mas mesmo assim ocorre alta prevalência de câncer nos países desenvolvidos
⇒ História natural da infecção 
A grande maioria das infecções regridem → o objetivo do virus não é causar câncer; ocorrem anomalias replicativas que acabam por causar câncer (integração no genoma da célula)
Em média, mais de 95% das pessoas se livram da infecção do vírus em até três anos
baixo risco → menos persistentes
alto risco → mais persistentes
A progressão da infecção depende de fatores virais (tipos de alto risco, variantes, etc) + fatores não virais (hospedeiro)
⇒ Neoplasias associadas ao HPV - estimativas mundiais
CICLO do HPV
⇒ Predileção por células epiteliais 
As células da camada basal da célula epitelial que se dividem - células proliferativas
O vírus causa microlesões para alcançar a células proliferativas da camada basal, mas a maioria das infecções ocorrem nas células da camada suprabasal em que reativa a maquinaria replicativa dessas células
⇒ HPV e transformação celular
Proteínas E6 e E7 - pequenas proteínas pleiotrópicas
promovem aumento do tempo de vida celular; replicação de DNA não programada, resistência a apoptose, evasão da resposta imune
potenciais diferentes dependendo do alto/baixo risco oncogênico
Tipos e doenças
⇒ Baixo risco: verrugas comuns e anogenitais (tipos 6 e 11 prevalentes)
⇒ Alto risco: câncer de colo do útero (associado aos tipos 16 e 18)
⇒ Além disso, tumores em diferentes tecidos podem estar associados a infecção por diferentes tipos de HPV
Tropismo anatômico evidente
200 tipos
Epidermodisplasia verruciforme - doença autossômica que os torna mais suscetíveis a infecções por HPV de diferentes tipos
nao genitais - lesões cutâneas
tipos genitais (>40 tipos) - benignas ou malignas nos genitais femininas e masculinas
papilomatose respiratória (HPV 6/11) - papilomas na laringe que obstruem a passagem de ar
⇒ Sao infeccoes muitas vezes assintomaticas
⇒ A transformação celular esta associada a presenca de proteinas virais
⇒ A persistencia da infeccao é o rpincipal fator de risco de evolucao da infeccao para canceres
VACINAS CONTRA HPV
Vacinas profilácticas - VLP de L1 ou L1/L2 dos tipos mais prevalentes ⇒ estimulação do sistema imune (imunogênicas)
Expressão das proteínas do capsídeo do vírus sem o genoma
Superfície da proteina - alvos imunogênicos
Aplicação intramuscular - rápido acesso dos VLPs aos vasos sanguíneos e aos linfonodos locais
VLPs sao muito imunogênicas
ativadoras potentes das APC
induzem boa resposta das células T helper para celulas B
Componentes das vacinas quadri (6,11,16,18) e bivalente (16, 18) contra HPV
Títulos de anticorpos aumentam com a aplicacao da vacina, comprovando o aumento da resposta imunológica contra o HPV
Vacina quadrivalente bastante eficaz para prevenir infecção (após 5 anos da aplicação) 
Existência de memoria imunologica 
Vacina nonavalente (top cancer-causer types of HPV) → 90% dos HPV causadores de cancer cervical
Terapêuticas - peptídeos e proteínas precoces virais (E6/E7) ⇒ ajuda na eliminação de infecções prevalentes
Diagnóstico laboratorial de vírus
Diagnóstico de bactérias e fungos => a partir de um material clínico, fazemos a pesquisa de qual é o organismo; crescimento em diferentes meios, microscopia (morfologia), testes bioquímicos.
Diagnóstico de vírus => a partir de um material clínico, fazemos a pesquisa da suspeita de algum vírus com base no quadro clínico do paciente (sintomas + história do paciente).
O diagnóstico de vírus é muito difícil, pois eles são parasitas intracelulares obrigatórios, organismos muito pequenos e não crescem em meios de cultivos como bactérias e fungos.
O médico pede um exame específico para um certo vírus ou de vírus com quadros clínicos similares (p. ex. Dengue, Zika e Chikungunya).
É importante saber o que procurar (qual vírus?) e onde procurar (vírus diferentes tem infectividade preferencial por diferentes tecidos; importante conhecer a patogenia dos vírus).
A técnica preferida é a de PCR.
Qualidade da amostra do material clínico depende => manuseio, transporte, armazenamento, tempo de coleta em relação ao início da infecção, quantidade, processamento, local qual a amostra foi retirada.
Até que sejam utilizadas em exames laboratoriais, adiciona-se antifúngicos e antibacterianos às amostras.
Dois tipos de diagnóstico:
DIRETO
→ Detecção do vírus => proteína ou material genético.
→ Recomendado para infecções rápidas em que o diagnóstico rápido é essencial.
→ Problema recorrente => testes com falso negativo.
→ Técnicas:
Imunoensaios => detecção da proteína viral; feito diretamente na amostra de material clínico; inoculação de anticorpos imunoespecífcos na amostra a fim de procurar os antígenos correspondentes na amostra clínica.
ELISA
Enzyme linked immunosorbent assay.
Metodologia:
Incubação do anticorpo conjugado com uma enzima + material clínico.
Mudança de cor => ação de enzima sobre seu substrato quando há ligação do anticorpo ao antígeno (formação de imunocomplexo).
Qualitativo (mudança de cor ou não) e quantitativo (intensidade da coloração - espectrofotômetro).
Indica a carga viral com base no grau de coloração do ensaio.
Dois tipos de anticorpos podem ser utilizados:
Policlonais => simulação da infecção em animais de laboratório → produção de anticorpos contra todos os antígenos do vírus → purificação do soro do animal; problema = reações cruzadas.
Monoclonais => produção de anticorpos específicos para apenas um tipo de antígeno viral.
Imunofluorescência (IF)
Anticorpos marcados com corantes fluorescentes para revelar a formação de um imunocomplexo vírus-anticorpo.
Incubação de anticorpo monoclonal conjugado (fluorescente) com amostra de material clínico em uma lâmina (geralmente, tecidos) → visualização em microscópio de fluorescência.
Imunocromatografia
Membrana de nitrocelulose/nylon que possui uma faixa de anticorpos específicos ou não imobilizados (anticorpos de captura).
A amostra é colocada numa das extremidades da membrana e migra por capilaridade em direção à outra extremidade.
Se na amostra há antígeno viral, aparece uma banda cromatográfica na membrana que corresponde à associação do anticorpo e antígeno.
PCR => detecção de material genético viral; uso de primers específicos para cada vírus; pesquisa de bandas de tamanhos específicos em gel de agarose.
Extração do material genético viral (DNA ou RNA) da amostra de material clínico.
Recomenda-se o uso de apenas 1 primer para cada reação.
É possível fazer uma reação de PCR com diversos tipos de primers para diferentes vírus; problema = perda de sensibilidade do teste em cargas virais pequenas, competição de primers durante a reação, reação cruzada.
PCR real time => quantitativo; indica a carga viral.
Acompanhamento visual do progresso da amplificação do produto de PCR.
Uso de primers com sonda (fluorescente) => hibridização com o fragmento promove mudança no sinal de fluorescência.
A taxa de amplificação do fragmento (que, por sua vez, é proporcional à emissão do sinal da sonda) é proporcional à concentração do genoma viral.
Microscopia eletrônica (ME)
Visualização do vírus inteiro.
Já foi ferramentarotineira de diagnóstico, hoje não mais => técnica cara (aparelho, infra-estrutura, preparação da amostra) e requer mão de obra muito especializada (as partículas virais são muito difíceis de serem identificadas, pois são semelhantes a outras estruturas intracelulares).
Muito utilizada na área de pesquisa.
Sistemas de isolamento de vírus
Permite a propagação viral.
Amplificação da quantidade de vírus → facilita detecção e identificação.
Desvantagem => demorado; sistemas complicados.
Uso de sistemas vivo.
Isolamento do vírus do paciente e inoculação deste no sistema de isolamento laboratoriais adequado → positivo se houver reprodução dos sintomas da enfermidade no sistema laboratorial.
São eles:
Animais de laboratório
Complexo.
Deixou de ser muito utilizado.
Hoje em dia, é usado nos casos de raiva.
Mais comum: camundongos; também algumas espécies de macacos.
Os animais recebem os vírus de paciente e, após alguns dias, apresentam sintomatologia clínica; são, então, sacrificados e submetidos a exames histopatológicos ou testes imunológicos para a identificação do vírus.
Ovos embrionados 
Muito utilizado no passado.
Ainda utilizados nos casos de febre amarela.
Teste positivo = técnica de hemaglutinação no líquido amniótico.
Utilizado no cultivo do vírus influenza para a produção de vacina.
Cultura de células
Mais simples e prática.
Primárias => cultura finita (podem ser feitas subculturas / culturas secundárias); células retiradas de tecidos animais; teste positivo se houver efeito citopático (alguns tipos de efeitos são característicos de alguns tipos virais); diferentes tipos celulares para diferentes vírus.
Efeito citopatológico => alterações morfológicas da célula, lise celular, vacuolização, formação de sincícios. 
De linhagem. 
INDIRETO
→ Detecção de anticorpos contra o vírus.
→ Recomendado em casos de infecções lentas, pois requer a formação de anticorpos.
→ Técnicas => imunoensaios; uso de anticorpos contra anticorpos virais.
Imunocromatografia
Dengue
3 bandas na membrana => 1 de anti-proteína viral (NSI) e duas de anticorpos (anti-IgM e anti-IgG)
Detecção de diferentes fases da infecção
Banda cromatográfica em anti-NSI => fase aguda / inicial da infecção.
Banda cromatográfica em anti-IgM => fase aguda, mais de 7 dias infecção recente.
Banda cromatográfica em anti-IgG => mais de 20 dias de infecção.
IgM => primeiro anticorpo produzido; dura pouco tempo e, seu níveis caem após alguns dias do início da infecção; indica infecção primária recente
IgG => contato prévio com o vírus ou infecção recente (se houver conversão sorológica - aumento significativo no título de anticorpos entre duas amostras de soro num intervalo entre a fase aguda e a fase convalescente - 15 a 20 dias); anticorpo de memória.
ELISA
Soro do paciente + anti-IgM humano + antígeno viral + anticorpo conjugado (fluorescente) anti-antígeno viral.
Imunofluorescência
REFERÊNCIAS
→ Introdução à virologia humana. Norma Suely de Oliveira Santos. 2ª Edição. Guanabara Koogan. Capítulo 4.
→ Microbiologia Médica. Murray. 6ª Edição. Elsevier. Capítulo 50.
→ Fields Virology Volume 1. David M. Knipe, Peter M. Howley. 6th edition. LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS. Chapter 15