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Nitric oxide-repressed Forkhead factor FoxE1 expression is involved in the inhibition of TSH-induced thyroid peroxidase levels Ana Patrícia de Oliveira Novembro de 2016 Universidade Federal do Piauí – UFPI Campus Ministro Reis Velloso, Parnaíba, Piauí A expressão FoxE1 do factor Forkhead reprimido com óxido nítrico está envolvida na inibição dos níveis de peroxidase tiroideia induzida pelo TSH 1 Em 1972, a Fluid-Mosaic Membrana Modelo da estrutura da membrana foi proposta com base em princípios termodinâmicos de organização do lípidos da membrana e proteínas e evidências disponíveis de assimetria e mobilidade lateral dentro da matriz da membrana [SJ Singer e GL Nicolson, Science 175 (1972) 720- 731]. Depois de mais de 40 anos, este modelo de base da membrana celular permanece relevante para descrever os nano-estruturas básicas de uma variedade de intracelular e membranas celulares de células de plantas e animais, bem como formas de vida inferiores. Nos anos seguintes, no entanto, novas informações documentou a importância eo papel dos domínios de membrana especializados, tais como jangadas lipídicas e proteínas / complexos de glicoproteínas, ao descrever a macroestrutura, dinâmicas e funções das membranas celulares, bem como os papéis de membrana-associado cercas do citoesqueleto e estruturas da matriz extracelular na limitação da difusão lateral e a amplitude de movimento de componentes de membrana. Estes dados mais recentes construir sobre o fundamento do modelo original e adicionar novas camadas de complexidade e hierarquia, mas os conceitos descritos no modelo original ainda são aplicáveis hoje. Em versões atualizadas do modelo mais ênfase foi colocada sobre a natureza do mosaico da macroestrutura das membranas celulares, onde muitos componentes de proteína e lipídios são limitados em suas motilidades de rotação e laterais no plano da membrana, especialmente em seus estados naturais onde lipídico-lipídico, proteína-proteína e interacções lípido-proteína, bem como células-matriz, célula-célula e interacções de proteínas do citoesqueleto e associadas a membranas intracelulares são importantes em restringir a mobilidade lateral e a amplitude de movimento de componentes de membrana específicos. A formação de domínios de membrana especializadas e a presença de complexos de proteína de membrana integral embaladas apertadamente, devido a vedações associadas à membrana, fenceposts e outras estruturas são consideradas muito importantes, ao descrever a dinâmica da membrana e arquitectura. Estas estruturas, juntamente com o citoesqueleto associada à membrana e estruturas extracelulares manter a longo prazo, não aleatória mosaico macro-organização das membranas, enquanto os domínios menor nano- membrana e submicro porte, tais como jangadas lipídicas e complexos de proteína, são importantes na manutenção estruturas de membrana especializadas que estão em fluxo dinâmico de cooperação em um plano da membrana lotado. Este artigo é parte de uma edição especial intitulada: estrutura da membrana e função: Relevância no do celular Fisiologia, Patologia e Terapia. 2 Hormônio de estimulação da tireóide (TSH) MILHORANSA & SOARES, 2016 INTRODUÇÃO Os hormônios tireoidianos exercem seus efeitos sobre praticamente todos os sistemas e órgãos do corpo. INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO Tireoglobulina A regulação da integração do metabolismo nos mamíferos é mediada por mensageiros químicos produzidos em um órgão endócrino, transportados pelo sangue e que irão atuar em um outro órgão, denominados hormônios. Os hormônios se dividem em 4 grupos químicos, sendo: os peptídios, os esteróides, as aminas e os eicosanóides. Dentro das aminas, se encontram as catecolaminas (adrenal e células nervosas) e as iodotironinas, derivadas do aminoácido tirosina, produzidas exclusivamente pela tireóide, com mecanismos de ação semelhante aos esteróides. Os hormônios tireoidianos exercem seus efeitos sobre praticamente todos os sistemas e órgãos do corpo. Tireoide- É uma glândula bilateral presente em todos os vertebrados, característica por captar iodo. A unidade anatômica e funcional da tireóide é o folículo tireoidiano, tendo em seu interior o colóide com tireoglobulina O TSH (hormônio de estimulação da tireóide ou tíreotro fina) é um hormônio pertencente à família dos hormô nios glicoproteicos, que inclui o hormônio luteinizante (LH), o folículo estimulante (FSH) e a gonadotrofina coriônica hu mana (HCG) A secreção hipofisária de TSH regula a secreção de T4 (tiroxina) e T3 (triiodotironina), que por sua vez exercem "fe edback" negativo no controle de secreção dos hormônios da tireóide, sendo que, a medida que ocorre um aumento na secreção de T3 e T4, o metabolismo celular aumenta. Este aumento promove, no hipotalamo, redução na se creção de TRF (fator de liberação da tíreotrofina ), provo cando uma redução na secreção de TSH pela adeno-hipó fise e, redução de T3 e T4 pela tireóide, reduzindo o meta bolismo basal celular. Desta forma, quando a função hipo tálamo-hipofisária está intacta, pequenas alterações nas concentrações dos hormônios tireoideanos livres resultam em grandes concentrações séricas de TSH, tornando o mesmo, melhor indicador de alterações discretas da pro dução tireoideana Entre os transtor nos da tireóide o hipotireoidismo e o hipertireoidismo são os predominantes, afetam as pessoas ao longo da vida. O hipotireoidismo é a síndrome clínica provocada pela di minuição da secreção do hormônio da tireóide. Com mais freqüência, reflete uma doença da própria glândula (hipotireoidismo primário) mas, também, pode ser causado por do ença hipofisária (hipotireoidismo secundário) ou por doença hipotalâmica (hipotireoidismo terciário). Com um amplo es pectro de sintomas e manifestações clínicas, essa doença, re sulta na lentificação dos processos metabólicos e, na sua for ma mais grave, em acumulo de mucopolissacarídeos na pe le, causando edema não-depressível, denominado mixedema (GOLDAMAN &BENNETT, 2001; HELFAND, M., 2004) O hipertireoidismo é uma condição na qual a produção e a liberação dos hormônios da tireóide mostram-se aumenta das, na maioria das vezes, devido a uma hiperfunção da glândula. Os sinais e sintomas originam-se em sua maioria, da produção excessiva de calor, aumento da atividade mo tora e da atividade do sistema nervoso simpático, pele ru borizada, quente e úmida; fraqueza muscular, taquicardia, aumento do apetite e, se a ingestão for insuficiente, perda de peso. Ocorre também insônia, dificuldade de permane cer quieto, ansiedade, apreensão, aumento na freqüência de evacuações. Os indivíduos idosos com hipertireoidismo podem não apresentar esses sintomas característicos, mas apresentam o que algumas vezes é denominado hipertire oidismo apático ou mascarado. Eles simplesmente tornamse fracos, sonolentos, confusos, isolados e retraídos. A doença de Graves, uma forma de hipertireoidismo autoimune, caracteriza-se pela formação e secreção excessivas de hormônio tireóideo, bem como por bócio difuso; tais cé lulas produzem quantidades consideráveis de anticorpos contra o receptor de TSH (COOPER, D.S., 2003) 3 Hormônio de estimulação da tireóide (TSH) MILHORANSA & SOARES, 2016 ; COOPER et al., 1982; ROTI et al., 1993 INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO Drogas como Propiltiouracil , Metimazol e Carbimazol inibidores potentes da peroxidase tireoidal Enzima Peroxidase Mais específico- A formação dos hormônios tireoideanos (HTs) ocorrem na molécula de tireoglobulina, sobre o controle da tireotrofina hipofisária (TSH).A tireoglobulina (TGB) é uma glicoproteína sintetizada na célula tireóidea, a qual participa das etapas para a formação dos hormônios tireoideanos, pelas células foliculares da glândula tireóide, que são: captação do iodeto pela célula tireóide; oxidação do iodeto a iodo; iodação da tireoglobulina (TGB); proteólise desta molécula; liberação do hormônio na circulação e conversão da tiroxina (T4) em triiodotironina(T3) nos tecidos periféricos. Assim, o controle de todos esses processos se torna bastante complexo, permitindo que os mais variados fatores interfiram na função tireoideana Depois que o iodeto é captado pela tireóide, este é oxidado pela célula folicular. A oxidação do iodeto é realizada pela enzima peroxidase, com um grupo heme, e requer peróxido de hidrogênio como oxidante. Este é produzido por uma enzima NADPHdependente. A oxidação é estimulada por TSH e inibida por compostos tireotóxicos como a tiouréia e o tiouracilo. Alt A tireoglobulina volta para dentro da célula por pinocitose, estimulada pelo TSH, sendo hidrolisada por proteinases nos lisossomos para liberar MIT, DIT, T3 e T4. A MIT e a DIT são deiodadas, pela enzima deiodase, para a reciclagem do iodo na glândula, enquanto T3 e T4 saem para a corrente circulatória por difusão simples Assim, o controle de todos esses processos se torna bastante complexo, permitindo que os mais variados fatores interfiram na função tireoideana. Drogas tiocarbamida, particularmente Propiltiouracil (1), Metimazol (2, 3) e Carbimazol, são inibidores potentes da peroxidase tireoidal e bloqueador da síntese dos HTs, clinicamente usadas no controle do hipertireoidismo. 4 Hormônio de estimulação da tireóide (TSH) MONTESINOS et al., 2016 INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO A biossíntese da hormona tiroideia é um complexo processo multi-passo Que ocorre dentro das células foliculares da tireóide e as células extracelulares Folicular. A peroxidase da tireóide (TPO) é um complexo contendo heme Glicoproteína localizada na membrana apical da tireóide folicular Células. A TPO catalisa a oxidação de iodeto, a incorporação covalente de Iodo em resíduos de tirosina de tiroglobulina e acoplamento de Tirosinas iodadas para formar hormônio tireoidianoTPO catalisa a síntese de hormônios tireoidianos Na interface membrano-coloide apical de tireócitos por mediação A incorporação covalente de iodo em resíduos de tirosina de Tiroglobulina, processo conhecido como organificação do iodo e Acoplamento de resíduos iodotyrosyl para formar hormônios tireoidianos 5 Hormônio de estimulação da tireóide (TSH) MONTESINOS et al., 2016 INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO TSH ativa via AMPc a proteína quinase A (PKA) Principal regulador hormonal da expressão do gene TPO TSHrContribui para a regulação da expressão de TPO TSH Estimula a transcrição de TPO Adaptado de Colin et al., 2013 . O processo geral de hormonogênese da tireóide é Estimulada pelo hormônio estimulador da tireóide (TSH) Através do receptor de TSH acoplado à proteína G (TSHR) localizado Na membrana basolateral das células da tireóide (Colin et al., 2013). . O processo geral de hormonogênese da tireóide é Estimulada pelo hormônio estimulador da tireóide (TSH) Através do receptor de TSH acoplado à proteína G (TSHR) localizado Na membrana basolateral das células da tireóide (Colin et al., 2013) O TSH activa a via AMPc-proteína quinase A (PKA), que é Considerado o principal mediador a jusante das ações de TSH Células tireóideas (Muca e Vallar, 1994). O TSH através da sinalização de cAMP é o Principal regulador hormonal da expressão do gene TPO (Aza-Blanc et al., 1993; Gerard et al., 1988; Postiglione et al., 2002). No entanto, TSHR Através de outros membros da família das proteínas G envolvendo Fosfato de inositol / Ca2 + pode também contribuir para a regulação da expressão de TPO (Buch et al., 2008; Grasberger et al., 2007; Laugwitz et al., 1996). A expressão de TPO regulada por TSH é principalmente estimulada a transcrição (Francis-Lang et al., 1992). O promotor mínimo de TPO necessário para conferir a responsividade a TSH contém dois locais de ligação para o factor de transcrição da tireóide (TTF) -1 (também designado por Nkx 2.1), chamado B e C; Um local para a proteína E1 da caixa de Forkhead (FoxE1; Anteriormente conhecido como TTF-2) chamado Z; Um para o Factor Nuclear 1 (NF-1) Sobreposição com o sítio de ligação B de TTF-1 e um para o Caixa domínio transcrição factor-8 (Pax8) que se sobrepõe com TTF-1 site C Além O promotor responsivo ao TSH mínimo, o promotor TPO contém O local de ligação A de TTF-1 e um local de ligação conservado para o Fator de transcrição NF-kB. O local de ligação NF-kB é necessário para A expressão transcricional da TPO em resposta à infecção bacteriana Endotoxina lipopolissacarídeo (Nazar et al., 2012). FoxE1 é o principal Fator de transcrição da tireóide que regula a expressão da TPO Resposta ao TSH e ao fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) (Aza-Blanc Et ai, 1993). Além disso, a expressão FoxE1 em si é estimulada pelo TSH A nível transcricional (Ortiz et al., 1997). Portanto, a ligação FoxE1 O sítio Z constitui um elemento de resposta hormonal que regula a Expressão de genes restritos à tireóide (Fernandez et al., 2013). 6 Hormônio de estimulação da tireóide (TSH) INTRODUÇÃO Brent , 1996 Receptor do TSH . O processo geral de hormonogênese da tireóide é Estimulada pelo hormônio estimulador da tireóide (TSH) Através do receptor de TSH acoplado à proteína G (TSHR) localizado Na membrana basolateral das células da tireóide (Colin et al., 2013). . O processo geral de hormonogênese da tireóide é Estimulada pelo hormônio estimulador da tireóide (TSH) Através do receptor de TSH acoplado à proteína G (TSHR) localizado Na membrana basolateral das células da tireóide (Colin et al., 2013) O TSH activa a via AMPc-proteína quinase A (PKA), que é Considerado o principal mediador a jusante das ações de TSH Células tireóideas (Muca e Vallar, 1994). O TSH através da sinalização de cAMP é o Principal regulador hormonal da expressão do gene TPO (Aza-Blanc et al., 1993; Gerard et al., 1988; Postiglione et al., 2002). No entanto, TSHR Através de outros membros da família das proteínas G envolvendo Fosfato de inositol / Ca2 + pode também contribuir para a regulação da expressão de TPO (Buch et al., 2008; Grasberger et al., 2007; Laugwitz et al., 1996). 7 Óxido nítrico e Hormônio estimulante da tireóide (TSH) MONTESINOS et al., 2016 INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO NOS III ou eNOS -É abundantemente expresso nas células foliculares da tiróide RALSTON, 1997 O óxido nítrico (NO) é uma molécula de sinalização ubíqua envolvida Uma grande variedade de processos fisiológicos. No entanto, desequilibrado A produção de NO tem sido associada à progressão tumoral e Metástases e doenças auto-imunes (Bogdan, 2001, Burke et al., 2013; Fukumura et al., 2006). O NO endógeno é gerado a partir de L-arginina por três isoformas de NO-sintase (NOS): neuronal (nNOS / NOS I), indutível (iNOS / NOS II) e endotelial (eNOS / NOS III), Que são amplamente expressos (Burke et al., 2013). Particularmente, NOS III É abundantemente expresso nas células foliculares da tiróide (Colin et al., 1997, 1995) e sua expressão é restrita a Cles (Gerard et al., 2002). 8 Óxido nítrico e Hormônio estimulante da tireóide (TSH) MONTESINOS et al., 2016 INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO Ações NO são mediadas principalmente por guanilato ciclase solúvel (sGC); NÃO ativa sGC para produzir o mensageiro secundário guanosina cíclico Monofosfato (cGMP) Zago;Zanesco, 2006 A maioria das ações fisiológicas de NO são Mediada por meio da guanilato ciclase solúvel (sGC). NÃO Ativa sGC para produzir o mensageiro secundário guanosina cíclico Monofosfato (cGMP), agindo assim através de três grupos principais de Alvos celulares: proteína cinases cGMP-dependentes (cGK), cGMP- Canais de catiões fechados e fosfodiesterases reguladas por cGMP (Francis et al., 2010, Martinez-Ruiz et al., 2011). Importante, basal Níveis de produção endógena de cGMP induzida por NO foram re- Em tecido de tireóide canino (Esteves et al., 1992). Modificações deA expressão da NOS está associada a vários fatores fisiopatológicos Condições da glândula tireóide (Colin et al., 1997, 1995, Patel et al., 2002; Sousa et al., 2010). Neste contexto, as citocinas pró-inflamatórias Modulam a expressão de NOS II ea produção de NO em humanos tiro- Cytes (Kasai et al., 1995, van den Hove et al., 2002). Além disso, Gerard et ai. (2006) relataram uma atividade induzida por citocinas induzida por NO Redução da TPO estimulada pelo TSH e da oxidase da tiróide (ThOX) Expressão em tireócitos humanos. 9 Óxido nítrico e Hormônio estimulante da tireóide (TSH) MONTESINOS et al., 2016 INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO NO na Fisiologia da Tireoide Papel do NO como um circuito de realimentação autocrina inibitória no da função da célula tireóide dependente de TSH. A maioria das ações fisiológicas de NO são Mediada por meio da guanilato ciclase solúvel (sGC). NÃO Ativa sGC para produzir o mensageiro secundário guanosina cíclico Monofosfato (cGMP), agindo assim através de três grupos principais de Alvos celulares: proteína cinases cGMP-dependentes (cGK), cGMP- Canais de catiões fechados e fosfodiesterases reguladas por cGMP (Francis et al., 2010, Martinez-Ruiz et al., 2011). Importante, basal Níveis de produção endógena de cGMP induzida por NO foram re- Em tecido de tireóide canino (Esteves et al., 1992). Modificações de A expressão da NOS está associada a vários fatores fisiopatológicos Condições da glândula tireóide (Colin et al., 1997, 1995, Patel et al., 2002; Sousa et al., 2010). Neste contexto, as citocinas pró-inflamatórias Modulam a expressão de NOS II ea produção de NO em humanos tiro- Cytes (Kasai et al., 1995, van den Hove et al., 2002). Além disso, Gerard et ai. (2006) relataram uma atividade induzida por citocinas induzida por NO Redução da TPO estimulada pelo TSH e da oxidase da tiróide (ThOX) Expressão em tireócitos humanos. 10 Óxido nítrico e Hormônio estimulante da tireóide (TSH) MONTESINOS et al., 2016 INTRODUÇÃO ININTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO Cultura Celular Linhagem de células da tireóide FRTL-5 Meio contendo TSH Tratados com doadores do óxido nítrico: Nitrupussiato de sódio e S-nitrosoglutationa Para controle: Células pré-tratadas com sequestradores de NO- 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide (30 min antes) Determinação de nitrito Produto da oxidação no NO Reagente de Griess A maioria das ações fisiológicas de NO são Mediada por meio da guanilato ciclase solúvel (sGC). NÃO Ativa sGC para produzir o mensageiro secundário guanosina cíclico Monofosfato (cGMP), agindo assim através de três grupos principais de Alvos celulares: proteína cinases cGMP-dependentes (cGK), cGMP- Canais de catiões fechados e fosfodiesterases reguladas por cGMP (Francis et al., 2010, Martinez-Ruiz et al., 2011). Importante, basal Níveis de produção endógena de cGMP induzida por NO foram re- Em tecido de tireóide canino (Esteves et al., 1992). Modificações de A expressão da NOS está associada a vários fatores fisiopatológicos Condições da glândula tireóide (Colin et al., 1997, 1995, Patel et al., 2002; Sousa et al., 2010). Neste contexto, as citocinas pró-inflamatórias Modulam a expressão de NOS II ea produção de NO em humanos tiro- Cytes (Kasai et al., 1995, van den Hove et al., 2002). Além disso, Gerard et ai. (2006) relataram uma atividade induzida por citocinas induzida por NO Redução da TPO estimulada pelo TSH e da oxidase da tiróide (ThOX) Expressão em tireócitos humanos. 11 Óxido nítrico e Hormônio estimulante da tireóide (TSH) MONTESINOS et al., 2016 INTRODUÇÃO ININTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO Western blot Anti-TPO (sc-58432), anti-FoxE1 (sc-16392) PCR TPO Plasmídeos Estudar a via dos fatores de transcrição de TPO EMSA A maioria das ações fisiológicas de NO são Mediada por meio da guanilato ciclase solúvel (sGC). NÃO Ativa sGC para produzir o mensageiro secundário guanosina cíclico Monofosfato (cGMP), agindo assim através de três grupos principais de Alvos celulares: proteína cinases cGMP-dependentes (cGK), cGMP- Canais de catiões fechados e fosfodiesterases reguladas por cGMP (Francis et al., 2010, Martinez-Ruiz et al., 2011). Importante, basal Níveis de produção endógena de cGMP induzida por NO foram re- Em tecido de tireóide canino (Esteves et al., 1992). Modificações de A expressão da NOS está associada a vários fatores fisiopatológicos Condições da glândula tireóide (Colin et al., 1997, 1995, Patel et al., 2002; Sousa et al., 2010). Neste contexto, as citocinas pró-inflamatórias Modulam a expressão de NOS II ea produção de NO em humanos tiro- Cytes (Kasai et al., 1995, van den Hove et al., 2002). Além disso, Gerard et ai. (2006) relataram uma atividade induzida por citocinas induzida por NO Redução da TPO estimulada pelo TSH e da oxidase da tiróide (ThOX) Expressão em tireócitos humanos. 12 Óxido nítrico e Hormônio estimulante da tireóide (TSH) MONTESINOS et al., 2016 INTRODUÇÃO ININTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 13 Fig. 1. NO donors inhibit TSH-induced TPO expression. Starved FRTL-5 cells were treated with SNP (100e300 mM) or GSNO (100e300 mM) in the presence or absence of TSH (0.5 mIU/ml) for 24 h. A and B, Representative Western blot of whole protein extracts evaluating TPO expression. b-actin expression was used as control for equal protein loading (lower panel). Densitometric analysis was performed to determine the relative expression of TPO normalized to b-Actin. Fold change indicates the mean of at least three independent experiments. #p < 0.01 vs Basal; *p < 0.05 vs TSH (ANOVA; StudenteNewmaneKeuls). C and D, Relative TPO mRNA quantification evaluated by RT/qPCR. TPO mRNA expression levels were quantified relative to those of b-Actin. Results are indicated as fold change relative to the mRNA levels of untreated cells. Data (mean ± SD) are from a representative experiment done in triplicate from a total of three with similar results. #p < 0.001 vs Basal; *p < 0.001 vs TSH (ANOVA; StudenteNewmaneKeuls). INTRODUÇÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 14 Fig. 2. NO donors downregulate TSH-dependent TPO gene transcriptional activation involving the Z INTRODUÇÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involvedin the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 15 Fig. 2. NO donors downregulate TSH-dependent TPO gene transcriptional activation involving the Z INTRODUÇÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 16 Fig. 2. NO donors downregulate TSH-dependent TPO gene transcriptional activation involving the Z INTRODUÇÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 17 Fig. 3. NO donors downregulate cAMP-stimulated TPO gene expression. FRTL-5 cells were transiently transfected with A, the TPO promoter construct pTPO or B, the FoxE1 reporter containing twelve Z elements in tandem (p12Z). Starved cells were treated with SNP (200 mM) or GSNO (200 mM) in the presence of TSH (0.5 mIU/ml), forskolin (FSK, 10 mM) or dibutyryl-cAMP (dbcAMP, 1 mM) for 24 h. Results are expressed as Luc activity normalized to b-galactosidase and relative to basal activity for each construct. Data(mean ± SD) are from a representative experiment done in triplicate from a total of three with similar results. #p < 0.001 vs Basal; *p < 0.01, **p < 0.001 vs TSH; qp < 0.01; qqp < 0.001 vs FSK; tp < 0.01, ttp < 0.001 vs dbcAMP (ANOVA, StudenteNewmaneKeuls). INTRODUÇÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 18 Fig. 4. NO-repressed TSH-stimulated TPO expression involves cGMP/cGK pathway. A- FRTL-5 cells were transiently transfected with the TPO promoter construct pTPO or the FoxE1 reporter p12Z. Starved cells were treated with SNP (200 mM) or GSNO (200 mM) in the presence of TSH (0.5 mIU/ml) plus the NO scavenger PTIO (200 mM) for 24 h. Results are expressed as Luc activity normalized to b-galactosidase and relative to basal activity for each construct. Data (mean ± SD) are from a representative experiment done in triplicate from a total of three with similar results. #p < 0.01, ##p < 0.001 vs Basal; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 vs TSH INTRODUÇÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 19 Fig. 4. NO-repressed TSH-stimulated TPO expression involves cGMP/cGK pathway. A- FRTL-5 cells were transiently transfected with the TPO promoter construct pTPO or the FoxE1 reporter p12Z. Starved cells were treated with SNP (200 mM) or GSNO (200 mM) in the presence of TSH (0.5 mIU/ml) plus the NO scavenger PTIO (200 mM) for 24 h. Results are expressed as Luc activity normalized to b-galactosidase and relative to basal activity for each construct. Data (mean ± SD) are from a representative experiment done in triplicate from a total of three with similar results. #p < 0.01, ##p < 0.001 vs Basal; *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 vs TSH INTRODUÇÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 20 Fig. 5. NO donors inhibit TSH-induced FoxE1 binding to the TPO promoter. A, Representative EMSA performed with nuclear extracts obtained from FRTL-5 cells treated with SNP (200 mM) in the presence of TSH (0.5 mIU/ml) for 24 h. EMSAs were performed with 32P-labeled oligonucleotides corresponding to the FoxE1 binding site Z(Probe TPO-Z*). Specificity was achieved by performing competition reactions in the presence of 100-fold excess of cold TPO-Z oligonucleotide (lane 3), and by the inhibition of shifted complex when the Z binding site is mutated (Probe TPO-Z MT*; lane6). Incubations performed in the presence of an anti-FoxE1 antibody diminished the formation of specific FoxE1 complex (lanes 4, 7), INTRODUÇÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 21 Fig. 5. NO donors inhibit TSH-induced FoxE1 binding to the TPO promoter. A, Representative EMSA performed withnuclear extracts obtained from FRTL-5 cells treated with SNP (200 mM) in the presence of TSH (0.5 mIU/ml) for 24 h. EMSAs were performed with 32P-labeled oligonucleotides corresponding to the FoxE1 binding site Z(Probe TPO-Z*). Specificity was achieved by performing competition reactions in the presence of 100-fold excess of cold TPO-Z oligonucleotide (lane 3), and by the inhibition of shifted complex when the Z binding site is mutated (Probe TPO-Z MT*; lane6). Incubations performed in the presence of an anti-FoxE1 antibody diminished the formation of specific FoxE1 complex (lanes 4, 7), INTRODUÇÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 22 Fig. 6. NO donors inhibit TSH-induced FoxE1 expression. Starved FRTL-5 cells were treated with SNP (100e300 mM) or GSNO (100e300 mM) in the presence of TSH (0.5 mIU/ml) for 24 h. A, Representative Western blot of whole protein extracts assessing FoxE1 expression. b-Actin expression was used as control for equal protein loading (lower panel). Densitometric analysis was performed to determine the relative expression of FoxE1 normalized to b-Actin. Fold change indicates the mean of at least three independent experiments. #p < 0.01 vs Basal; *p < 0.05 vs TSH (ANOVA; StudenteNewmaneKeuls). B and C, Relative FoxE1 mRNA quantification evaluated by RT/qPCR. FoxE1 mRNA expression. levels were quantified relative to those of b-Actin. Results are indicated as fold change relative to the mRNA levels of untreated cells. Data (mean ± SD) are from a representative INTRODUÇÃO We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 23 Óxido nítrico e Hormônio estimulante da tireóide (TSH) MONTESINOS et al., 2016 INTRODUÇÃO ININTRODUÇÃO METODOLOGIA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO In conclusion, we provide evidence revealing a NO-triggered inhibitory effect of TSH-stimulated TPO gene expression. The No-regulated TPO expression could explain the observed changes in thyroidal iodide organification in response to increased intracellular NO level. Mechanistically, we demonstrated that NO decreases TSH-induced FoxE1 gene expression, thus repressing the transcripcional activation of TPO gene. Importantly, NO-regulated FoxE1 expression may be relevant in modulating FoxE1- dependent transcriptional networks in differentiated thyroid cells (Fernandez et al., 2013). In addition, NO-mediated long term inhibition of thyroid differentiation could be of interest in relation to human thyroid pathologies associated with a chronic NO production. Taken together, the results presented here reinforce the regulatory role of NO on thyroid cell function that could be of pathophysiological relevance. We have previously reported that the classical NO donor sodium nitroprusside (SNP) inhibits TSH-stimulated TPO mRNA expression (Bazzara et al., 2007). To investigate the molecular mechanism involved in the effect of NO on TPO gene expression, we first evaluated the effect of different NO donors on TSH-induced TPO protein expression in FRTL-5 cells. Thyroid cells were treated with the structurally unrelated NO donors SNP and S-nitrosoglutathione (GSNO) in the presence or absence of TSH for 24 h. As expected, SNP and GSNO caused a dose-dependent NO release, as quantified by accumulation of nitrite, the major stable metabolite of NO degradation, in the culture medium of TSH-starved FRTL-5 cells (Table 1). 24 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS INTRODUÇÃO COOPER, D.S., SAXE, V.C., MESKELL, M., FARAHE, F. and RIDGWAY, E.C. Acute Effects of Propylthiouracil (PTU) on Thyroidal Iodide Organification and Peripheral Iodothyronine Deiodination: Correlation with Serum PTU Levels Measured by Radioimmunoassay. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 54(1):101-107, 1982. NABIL N., MINER, D.J. and AMATRUDA, J.M. Comments: Methimazole: An Alternative Route of Administration. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 54(1): 180-181, 1982. Mais específico- A formação dos hormônios tireoideanos (HTs) ocorrem na molécula de tireoglobulina, sobre o controle da tireotrofina hipofisária (TSH).A tireoglobulina (TGB) é uma glicoproteína sintetizada na célula tireóidea, a qual participa das etapas para a formação dos hormônios tireoideanos, pelas células foliculares da glândula tireóide, que são: captação do iodeto pela célula tireóide; oxidação do iodeto a iodo; iodação da tireoglobulina (TGB); proteólise desta molécula; liberação do hormônio na circulação e conversão da tiroxina (T4) em triiodotironina (T3) nos tecidos periféricos. Assim, o controle de todos esses processos se torna bastante complexo, permitindo que os mais variados fatores interfiram na função tireoideana Assim, o controle de todos esses processos se torna bastante complexo, permitindo que os mais variados fatores interfiram na função tireoideana. Drogas tiocarbamida, particularmente Propiltiouracil (1), Metimazol (2, 3) e Carbimazol, são inibidores potentes da peroxidase tireoidal e bloqueador da síntese dos HTs, clinicamente usadas no controle do hipertireoidismo. 25
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