ESPECTROMETRIA DE MASSAS FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES NA INDÚSTRIA FARMACÊUTICA

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ESPECTROMETRIA DE MASSAS FUNDAMENTOS E APLICAÇÕES NA 
INDÚSTRIA FARMACÊUTICA 
 
INTRODUÇÃO 
Espectrometria de massas (MS) é uma técnica de identificação de substâncias 
desconhecidas, que permite determinar a presença de um composto específico em uma 
determinada amostra ou determinar a composição de uma amostra desconhecida. A MS 
permite obter informação sobre a estrutura molecular de um composto a partir da 
ionização e fragmentação da molécula em pequenos íons, que ao serem analisados em 
conjunto podem levar à dedução da ordem em que estes fragmentos estão unidos. Um 
instrumento de MS é basicamente constituído por uma fonte de íons (onde os 
fragmentos são gerados), um analisador de massas (que separa os íons segundo sua 
relação massa/carga) e um detector de íons. As duas principais formas de ionização 
disponíveis são a ionização por elétrons (EI – Electron Ionization), principalmente 
usada na análise de moléculas pequenas (até 1.000 Da) em acoplamento com a GC; e a 
ionização por electrospray (ESI – Electrospray Ionization) usada na análise de 
moléculas maiores e frequentemente acoplada a LC e CE. Estas duas formas de 
ionização, além dos aspectos técnicos e instrumentais, basicamente se diferenciam no 
tipo de espectros de massas gerados. A EI é considerada uma forma de ionização 
“forte”, que gera espectros ricos em íons e, portanto, em informação estrutural. Por 
outro lado, a ESI é considerada uma forma de ionização branda, que gera espectros com 
poucos íons, normalmente observando-se apenas o íon quasi molecular (molécula 
protonada ou desprotonada). 
 
IONIZAÇÃO POR ELÉTRONS 
 
A Ionização por Elétrons (EI), que é o método de ionização mais comum em 
espectrometria de massas, não só ioniza as moléculas pela retirada de um elétron, mas 
também transfere energia suficiente para que estas moléculas ionizadas se fragmentem. 
Como a massa e a intensidade relativa desses fragmentos são dependentes da estrutura 
da molécula, o espectro de massas torna possível a identificação de moléculas e fornece 
informações valiosas na elucidação estrutural de compostos desconhecidos. A grande 
facilidade de acoplamento de espectrômetros de massas com ionização EI com 
cromatógrafos gasosos torna a técnica ainda mais versátil, permitindo a análise e a 
quantificação de compostos em misturas relativamente complexas. Em EI, no entanto, 
as substâncias precisam ser volatilizadas em alto vácuo na fonte de ionização. A maioria 
das moléculas orgânicas, de baixa massa (até 500 Da), possui uma pressão de vapor 
suficiente para serem analisadas, mas biomoléculas tais como peptídeos, proteínas e 
oligonucleotídeos não possuem estabilidade térmica suficiente para serem volatilizadas 
e, assim, não podem ser analisadas por EI-MS (Electron Ionization Mass Spectrometry). 
 
ESI e MALDI 
 
 Tanto ESI como MALDI são técnicas brandas de ionização, o que resulta na formação 
de íons com baixa energia, tornando possível a ionização desde moléculas de baixa 
massa molecular até biomoléculas com massas de acima 1 milhão de Daltons. Na 
ionização por electrospray no modo positivo, uma solução contendo a substância de 
interesse é acidificada, formando moléculas protonadas e os seus respectivos contra-
ânions. Esta solução é então nebulizada através de um tubo capilar onde se aplica uma 
alta voltagem. Desse modo, os ânions presentes na solução serão neutralizados pelo 
capilar e as gotas formadas pela nebulização conterão excesso de cargas positivas 
(moléculas protonadas). O solvente presente nas gotículas é evaporado restando, assim, 
a molécula protonada na fase gasosa. Analogamente, pode-se utilizar uma solução 
básica e um potencial negativo no capilar para se produzir íons negativos. Entre as 
características da ionização por electrospray, pode-se citar a baixa energia dos íons 
formados e a possibilidade da formação de íons multicarregados (multiprotonados). 
Assim como em ESI, os íons gerados por MALDI têm uma energia muito baixa, mas 
em MALDI os íons formados possuem poucas cargas e na maioria das vezes formam-se 
somente espécies monocarregadas. Essa característica é interessante porque facilita a 
interpretação dos resultados dos espectros de massas, mesmo para compostos de alta 
massa molecular. 
 
O grande uso da espectrometria de massas em várias áreas científicas decorre de 
algumas características da técnica, tais como: 
 
1) Detectabilidade – Quantidades muito pequenas de substâncias podem ser analisadas 
pelos métodos ESI e MALDI. Trabalhos recentes têm mostrado que a utilização de 
apenas 42 zeptomols (~25000 moléculas) do peptídeo P é suficiente para a sua detecção 
por MS. 
 
2) Volume de amostra – O uso de interfaces apropriadas para pequenos volumes, como 
as fontes de nanofluxo em ESI, permite que se use quantidade de amostras menores que 
1 μL. Em MALDI, a quantidade pode ser ainda menor, e trabalhos têm relatado a 
utilização de apenas 50 nanolitros de amostra. 
 
3) Possibilidade de interfaceamento com técnicas de separação – a utilização de 
misturas água/solvente em ESI faz com que ela seja ideal para o acoplamento de 
sistemas de separação, tais como HPLC e eletroforese. A TLC (cromatografia em 
camada delgada), acoplada a técnica de MALDI foi testada em 2004 pelo grupo do 
Profº. Marcos Eberlin9. Nesse método aplica-se o líquido iônico (matriz) diretamente 
sobre a mancha que se quer analisar na placa de TLC, proporcionando uma análise 
rápida e com baixo ruído químico. 
 
4) Tempo de análise – As análises por ESI e MALDI podem ser feitas em poucos 
segundos e essas características têm sido exploradas em projetos de larga escala, como 
os projetos de proteoma, onde se necessita identificar um grande número de proteínas. 
 
APLICAÇÃO NA INDÚSTRIA FARMACÊUTICA 
 
A indústria farmacêutica usa a espectrometria de massa em todas as fases do processo 
de desenvolvimento de remédio, desde a descoberta de compostos importantes e analise 
estrutural ate desenvolvimento sintético e química combinatória, na farmacologia e no 
metabolismo de remédios. Em clinicas de saúde em todo o mundo, a espectrometria de 
massa e usada em testes de sangue e urina para tudo, desde registro da presença e do 
nível de certos compostos que são marcadores de estados patológicos incluindo muitos 
canceres, ate detecção de presença e analise quantitativa de drogas ilícitas ou 
anabolizantes. 
Na indústria farmacêutica, além de resultados rápidos, é importante a utilização de 
métodos confiáveis, reprodutíveis e que possam ser validados para comprovar sua 
eficácia. O uso do MALDI-TOF é uma ferramenta importante para identificação de 
microrganismos que possam contaminar áreas limpas, água, matéria-prima e o produto 
final. Com uma fiscalização cada vez mais rigorosa é importante garantir uma 
identificação confiável, mas que também seja aliada a indústria para obter resultados 
rápidos e sem altos custos. 
Essa técnica possui várias vantagens como a utilização de células intactas de 
microrganismos (também designada ICM-MS, intact cell MALDI-TOF) que podem ser 
obtidas diretamente do meio de cultivo. A análise produz um espectro de proteínas 
típicas de cada espécie, o que funciona como uma impressão digital (“fingerprinting”), 
que pode ser comparado aos espectros previamente identificados e depositados em 
banco de dados. Apresenta um curto tempo de análise (minutos), alto rendimento (o 
consumo de material biológico é insignificante), baixo custo, pode ser aplicada em larga 
escala, custo de manutenção relativamente baixo, os dados gerados são de simples 
interpretação e apresenta uma alta resolução, fornecendo uma análise mais rápida, 
precisa e altamente sensível às misturas complexasde peptídeos. 
 
VANTAGENS E DESVANTAGENS DE ESI 
 
 Vantagens 
 
• Amostras não-voláteis 
• Ionização “branda” a pressão atmosférica 
• Análise de compostos de elevado peso molecular 
• Acoplamento com HPLC e eletroforese capilar 
 
 Desvantagens 
 
• Espécies multiplamente carregadas exigem transformações matemáticas 
para interpretação do espectro 
• Complementar à APCI. Não é boa para compostos não carregados, não 
básicos e de baixa polaridade, como esteróides 
• Muito sensível a contaminantes, tais como metais alcalinos ou compostos 
básicos 
• Corrente de íons relativamente baixa 
 
 
VANTAGENS E DESVANTAGENS MALDI 
 
 Vantagens 
 
• Baixa concentração do analito 
• Velocidade 
• Análise de polímeros e macromoléculas polares e não polares (M>50.000) 
 
 Desvantagem 
 
• Não compatível com LC/MS 
• Difícil obtenção de espectros de MS/MS 
• Deve ser usado com analisadores compatíveis com métodos pulsados (TOF ou FT-
ICR) 
 
VANTAGENS E DESVANTAGENS EI 
 
 Vantagens 
 
• Método robusto e simples 
• Fragmentação fornece informações estruturais; 
• Espectros são facilmente reprodutíveis; 
• Existência de biblioteca de “impressões digitais”; 
 
 Desvantagens 
 
• Requer volatilização da amostra ou derivatização; 
• Para substâncias de massa molar <800 uma 
• Amostra deve ser termicamente estável; 
• Íon molecular pode ser de difícil identificação; 
• Fragmentação pode ser extensa (moléculas maiores). 
 
CONCLUSÃO 
 
A indústria farmacêutica usa a espectrometria de massa em todas as fases do processo 
de desenvolvimento de medicamentos e descoberta de novos compostos sendo portando 
uma técnica muito importante para as ciências farmacêuticas. A espectrometria de 
massa além da vantagem da economia de tempo proporcionada pela técnica, a mesma 
possui um custo-benefício viável (preparo simples e barato de amostras e placas de 
MALDI reutilizáveis) e de alto desempenho. A validação e comprovação da 
reprodutibilidade da técnica são exigiências na indústria farmacêutica. Além disso, 
pesquisas envolvendo os principais pátogenos exigidos pela Farmacopéia Brasileira e 
também outros isolados ambientais para elaboração de bancos de dados são importantes 
para utilização no controle de qualidade farmacêutico. 
 
 
REFERENCIAS 
 
 
MELO, F. L. A utilização da espectrometria de massa Maldi-tof na identificação de 
microrganismos no controle de qualidade farmacêutico. 2014. 41f. Monografia apresentada 
ao Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Minas Gerais, como pré-
requisito para obtenção do título de Especialista em Microbiologia Industrial e Ambiental, Belo 
Horizonte, 2014. 
 
MARQUES, A. L. Aplicação de Técnicas Avançadas de Espectrometria de Massas em 
Ciências de Alimentos e Perfumaria. 2006. 85f. Dissertação (Mestrado em Química na Área 
de Química Analítica ) Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 2016.