aula de meios de cultura

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Meios de Cultura (Isolamento e 
Caracterização de Microrganismos)
Professora MSc. Telma Lélia Gonçalves Schultz 
de Carvalho 
Curso de Medicina Veterinária
INTRODUÇÃO: Nutrição X Crescimento
Nutrição microbiana
– Componentes necessários às células
– Meios de cultura
– Condições ambientais
Crescimento populacional
– Velocidade de crescimento
– Tempo de geração
– Medidas do crescimento
Nutrição microbiana – Elementos Químicos: Macro ou 
Micronutrientes essenciais
• Macronutrientes – compostos químicos muito usados
• Micronutrientes – compostos 
químicos pouco usados
• Principais elementos são:
C, O, H, N, P, S. 
• No entanto, + 50 elementos 
são metabolizados pelas 
células.
O que são meios de cultura? 
MEIO DE CULTURA
Definição 
Material nutriente preparado no laboratório 
para crescimento de microrganismo.
Agar nutriente
Caldo nutriente
Agar 
inclinado
MEIO DE CULTURA
MEIO DE CULTURA
•Critérios utilizados para crescimento de MO em meio de 
cultura 
1.Conter nutrientes corretos para que o MO possa crescer; 
2.Conter quantidade de água necessária; 
3.Ter o pH ajustado; 
4.Conter quantidade específica de oxigênio; 
5.Ser estéril; 
6.Ser incubado na temperatura ideal de crescimento da 
cultura. 
MEIOS DE CULTURA
- Não existe um meio de cultura universal para o crescimento de
todos os microrganismos.
• Para compor um meio adequado é necessário conhecer a fisiologia 
dos microrganismos de estudo.
Ex: não existe meio de cultura para microrganismos como
Treponema pallidum e Micobacterium leprae.
- Estes microrganismos só podem ser cultivados em animais de
laboratório.
Meios de cultura
• Até cerca de 1880, os microrganismos eram 
cultivados em meios líquidos.
• Robert Koch e a sua equipe introduziram os meios 
de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de 
espécies isoladas (culturas puras), separando-as de 
espécies contaminantes.
Meios de cultura artificiais consistem da associação qualitativa e 
quantitativa de substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao 
desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. 
RECIPIENTES PARA OS MEIOS
DE CULTURA.
- Placas de petri, tubos de ensaio,
garrafas, frascos, etc...
CONSTITUINTES DO MEIO DE CULTURA
- Água.
- Fontes de Carbono.
- Fonte de energia.
- Fonte de Nitrogênio “base amino-proteína”
- Fontes de oxigênio, hidrogênio, fósforo (fosfatos) e enxofre
(sulfatos)
- Vitaminas
CONSTITUINTES DO MEIO DE CULTURA
- Sais tamponados: Fósforo (fosfatos), enxofre (sulfato) e
citrato.
- Sais minerais: Cálcio, Ferro, Magnésio
- Fatores de crescimento.
- Agentes de gelificação para meios sólidos: Ágar.
CLASSIFICAÇÃO 
DOS MEIOS DE 
CULTURA
1 – De acordo com a consistência ou estado físico do meio 
de cultura
SÓLIDOS
- Usa ágar, um polímero de galactose como agente
solidificante na concentração de 1,35 a 2,0%.
- Funde-se à 100ºC, Líquido à 40ºC e sólido à 37ºC.
- São feitos em frascos, placas de petri e tubos de ensaio.
1 – DE ACORDO COM A CONSISTÊNCIA
SEMI-SÓLIDOS
- Usa ágar, como agente solidificante na concentração de 0,2 à
0,75%.
- Funde-se à 100ºC, Líquido à 40ºC e Semi-sólido à 37ºC.
- São feitos em tubos de ensaio
1 – DE ACORDO COM A CONSISTÊNCIA
LÍQUIDOS
- São os meios isentos de ágar.
- São sempre líquidos mesmo até a 37ºC e
em temperaturas inferiores.
- São feitos em tubos de ensaio
•Podem ser esterilizados em tubos de ensaio, balões, 
Erlenmeyers ou outros tipos de frascos. 
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SÓLIDO: o crescimento de bactérias é
visualizado pela formação de colônias.
MEIO SEMI-SÓLIDO: o crescimento de bactérias é
visualizado pela turvação. Meio muito utilizado para verificar a
motilidade (movimento) da bactéria.
MEIO LÍQUIDO: o crescimento de bactérias é
visualizado pela turvação do meio.
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SÓLIDO
COLÔNIAS: são milhares de células bacterianas derivadas
de uma única célula bacteriana semeada na superfície do ágar.
TEMPO PARA VISUALIZAÇÃO DAS COLÔNIAS:
- Maioria dos microrganismos cresce de 12 à 48 horas.
- Outros exigem semanas e até meses.
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SÓLIDO: COLÔNIAS
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SEMI-SÓLIDO E LÍQUIDO :
TURVAÇÃO
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SÓLIDO
Exemplos: Ágar Sangue, Ágar chocolate, Ágar
MacConkey, Ágar CLED (Cisteína Lactose Eletrólitos
Deficientes), Ágar Base, Ágar Citrato de Simmons, Ágar
Nutriente, Ágar Müller Hinton), etc....
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SÓLIDO
Ágar Sangue Ágar chocolate
CRESCIMENTO MICROBIANO
MEIO SÓLIDO X MEIO LÍQUIDO
- Meio líquido é impossível afirmar a
existência de mais de uma espécie de
bactérias ou até mesmo quantificar.
- Meio sólido pode-se afirmar a presença
de várias espécies bacterianas.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS ou FUNÇÃO
MEIOS COMPLEXOS
- São meios quimicamente indefinidos, mas tem
como função similar ao ambiente natural da bactéria.
Ex: Ágar sangue, Ágar chocolate.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS SINTÉTICOS
- São meios de composição química conhecida. São
utilizados para estudo de necessidades nutricionais de
determinadas bactérias.
Ex: Meio para micobactérias.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DIFERENCIAIS
- São meios que permitem a distinção (diferenciação)
entre dois ou mais tipos de bactérias pelas simples observação
das características apresentadas pelas suas colônias que neles
se desenvolvem.
- Os meios diferenciais permitem o crescimento de várias
espécies ao mesmo tempo, que facilita a discriminação entre os
diferentes microrganismos.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DIFERENCIAIS
Ex: Mac Conkey
- Permite a distinção entre bactérias
fermentadoras da lactose (lactose positiva –
apresenta colônias rosa) e bactérias não
fermentadora da lactose (lactose negativa –
apresenta colônias incolores).
MEIO DE CULTURA Mac Conkey
Lactose positiva Lactose negativa
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS SELETIVOS
- São meios cuja composição promovem e/ou
inibem o crescimento de um determinado
microrganismo ou grupo de microrganismos.
- Os meios seletivos proporcionam o meio pelo
qual podemos isolar uma determinada espécie ou
categoria de bactérias.
Ex: Salmonella tyfphi (febre tifoide).
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS SELETIVOS
- São usadas substâncias seletivas como os
corantes tais como cristal violeta, azul de metileno,
eosina e verde brilhante.
Ex. Mac Conkey além de seus nutrientes
contém cristal violeta e sais biliares que inibe o
crescimento de bactérias Gram- positivas e
permitindo o crescimento de Gram-negativas.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
OBSERVAÇÃO
- ALGUNS MEIOS SÃO TANTO
DIFERENCIAIS COMO SELETIVOS.
Ex: Ágar Mac Conkey
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DE ENRIQUECIMENTO
- São meios utilizados para isolar um
microrganismo de um meio em que está presente em
pequena quantidade.
- São meios enriquecidos com sangue, soro ou
outros nutrientes.
Ex: Ágar sangue, Ágar chocolate.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DE TRANSPORTE
- São meios utilizados para o transporte e
manutenção de amostras biológicas como fezes e
secreções.
- São meios inertes, pois, permitem a
viabilidade da maioria dos patógenos sem alterar a
sua concentração.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DE TRANSPORTE
Ex: Meio de Stuart ou Amies usado
parao transporte com swabs.
Ex: Meio Cary-Blair e salina
glicerinada tamponada útil no transporte de
fezes para o isolamento de Shigella e
Salmonella.
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
MEIOS DE TRANSPORTE
CLASSIFICAÇÃO DO MEIO DE CULTURA
2 – TIPOS
MEIOS DE MANUTENÇÃO
- São meios utilizados para a preservação das
bactérias para a realização de exames complementares
para estudos futuros como pesquisa clínica,
epidemiológica ou educacional.
Ex: Caldo TSB, caldo nutriente, água destilada.
MEIOS DE MANUTENÇÃO
Métodos de preservação:
Curto período de tempo: temperaturas de 2 a 8
ºC ou de 4 à 10ºC (refrigerador): duração por
semanas. Fazer subculturas em caldo TSB ou caldo
nutriente.
Longo período de tempo: temperaturas de
-70 à -196ºC. Duração por anos (1 até 10 anos). 
- Nitrogênio líquido: (-196ºC)
- Freezers: (-70 à -120ºC) temperatura ultra 
baixa.
- Liofilização: congelamento à seco.
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA A
CULTURA DAS BACTÉRIAS
- TEMPERATURA
- pH
- ATMOSFERA GASOSA
- PRESSÃO OSMÓTICA
- PRESSÃO HIDROSTÁTICA
- LUZ
CONDIÇÕES FÍSICAS PARA A CULTURA DAS
BACTÉRIAS
PRESSÃO OSMÓTICA
- Meios hipertônicos: as bactérias perdem
água e sofrem plasmólise ou enrugamento da
célula.
- Meios isotônicos: concentrações iguais, é o
mais recomendado.
- Meios hipotônicos: as células ganham água
e sofrem lise.
CONDIÇOES FÍSICAS PARA CRESCIMENTO
TEMPERATURA
- Psicotróficos: 0 à 7ºC
- Psicrófilos: 0 à 20ºC.
- Mesófilos: 20 à 45°C.
- Termófilos: 45 à 90°C.
A maioria são mesófilas.
- Temperatura ótima: 36,5 a 37°C em estufa bacteriológica.
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
pH
- Acidófilos: pH 0,1 à 5,4
- Neutrófilos: pH 5,4 à 8,5
- Alcalófilas: pH 7,0 à 11,5
*A maioria na faixa de 4,0 a 9,0.
- Ideal: próximo da neutralidade 6,8 a
7,2.
- pH próximo do neutro (7,0) para a
maioria das bactérias.
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
LUZ
- Bactérias fotossintetizantes
- Bactérias inibidas pela luz.
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
ATMOSFERA GASOSA
- Microrganismos aeróbios: 21% de oxigênio.
- Microorganimos anaeróbios facultativos: crescem
na presença de O2 ou ausência.
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
ATMOSFERA GASOSA
- Microrganismos anaeróbios: Morrem em
presença de oxigênio, não crescem em
presença de ar e não utilizam oxigênio para
reações de produção de energia.
- Jarra de anaerobiose.
Sistema para cultivo de anaeróbios
Presença de Oxigênio
(atmosfera)
Aeróbios Obrigatórios
Ex. Pseudomonas spp.
Facultativos
Ex. Escherichia coli
Anaeróbios Obrigatórios
Ex. Clostridium tetani
1
Agar tioglicolato
3
1
2
32
Condições Físicas (Fatores Ambientais)
MEIOS DE CULTURA MAIS
UTILIZADOS.
Ágar sangue de carneiro a 5,0%
- Meio não seletivo e diferencial
que permite o crescimento de bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas,
além de permitir a visualização de
hemólise.
MEIOS DE CULTURA MAIS
UTILIZADOS.
Ágar sangue de carneiro a 5,0%
MEIOS DE CULTURA MAIS UTILIZADOS.
Ágar Mac Conkey
- Meio seletivo e diferencial que
permite o crescimento de bactérias
(bacilos) Gram-negativas, diferenciando
as bactérias em lactose positiva e lactose
negativa. Inibe o crescimento de
bactérias Gram-positivas.
MEIOS DE CULTURA MAISUTILIZADOS.
Ágar Mac Conkey
• - É utilizado para o isolamento de 
Enterobactérias (Escherichia coli, 
Proteus sp, etc.. e bacilos entéricos não 
fermentadores (Shigella e Salmonella).
• - Amostras utilizadas: fezes, urina, 
água de esgoto, alimentos , etc...
O cultivo dos fungos geralmente é realizado em meio de cultura: Ágar Sabouraud.
Inoculação x Cultura
Inoculação ou semeadura dos meios de
cultura.
É o ato de colocar os microrganismos em um meio de
cultura para iniciar o crescimento.
Inoculação x Cultura
CULTURA: é quando os
microrganismos
crescem e se
multiplicam no meio de
cultura.
Inoculação x Cultura
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
- PERÍODO DE INCUBAÇÃO
- 24 a 48 horas em estufa bacterilógica.
CRESCIMENTOS DAS BACTÉRIAS
TEMPO
- Aumento no número da população
na cultura: 1→2→4→8→16→……
Progressão geométrica?
1→21→22→23→24….→2n
n = número de gerações
2n = número total de células em uma
cultura.
IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS
CARACTERÍSTICAS DAS COLÔNIAS
- TAMANHO (mm)
- Grande: maior que 1 mm de tamanho
- Média: 1 mm de diâmetro
- Pequena: menor que 1 mm de diâmetro.
IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS
COR
- Amarela, Branca, Branca- acinzentada,
Cinza, Rosa, Esverdeada, Preta, Alaranjada,
Creme, Incolor, etc...
ODOR
- Uva, Água sanitária, Fermento de pão,
Vinagre, Queijo, Terra molhada, Peixe,
Caramelo, etc...
IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS
DENSIDADE
- Opaca, Translúcida, Transparente
CONSISTÊNCIA
- Brilhante, Cremosa, Seca, Mucóide
PIGMENTO
- Amarelo, Vermelho, Mostarda
IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS
BORDA OU FORMA
- Circular (redonda), irregular, puntiforme,
ondulada
ELEVAÇÃO
- Convexa, Achatada, Elevada, centro
elevado.
IDENTIFICAÇÃO DAS COLÔNIAS
HEMÓLISE: é a lise (quebra, rompimento) da
hemácia.
Total (beta- hemólise): zona clara ao redor
das colônias.
Parcial (alfa-hemólise): há formação de um
halo esverdeado em volta da colônia, indicando
hemólise parcial das hemácias.
Ausência de hemólise (gama-hemólise): o
meio permanece íntegro em volta das colônias.
Ágar sangue de carneiro a 5,0%
Hemólise
Ágar sangue de carneiro a 5,0%
Tipos de hemólise (alfa, beta e
gama)
MEIOS DE CULTURA 
(Planejamento-Técnica de Preparo)
MEIOS DE CULTURA
1- HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS?
• É a medida individual mais simples e menos dispendiosa para prevenir a
propagação dos microrganismos. Recentemente, o termo “lavagem
das mãos” foi substituído por “higienização das mãos” devido à maior
abrangência deste procedimento.
• A pele das mãos alberga, principalmente, duas populações de
microrganismos: os pertencentes à microbiota residente (Gram+) e à
microbiota transitória (Gram -).
MEIOS DE CULTURA
1- HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS?
MEIOS DE CULTURA
1- HIGIENIZAÇÃO DAS MÃOS?
MEIOS DE CULTURA
APRESENTAÇÃO
Pós
• Cled Agar (36,1 g/L);
• Sabourand Dextrose Agar (65 g/L);
• Mueller Hinton Agar- aguar sangue
(36 g/L);
• Mannitol Salt Agar (111 g/L);
• MacConkey Agar (51,5 g/L).
MEIOS DE CULTURA
PREPARAÇÃO
- De acordo com o fabricante.
-Técnica de preparação vem especificada no rótulo
dos frascos.
- Pesar e hidratar o meio conforme as instruções do
fabricante.
- Devem ser pesados  papel manteiga/alumínio;
CÁLCULO: REGRA DE TRÊS
• Volume de suporte por placa: 20 mL
• Ex: 5 placas de meio de cultura à base 
de Manitol.
1 placa = 20 mL
2 placas = x mL?
X = 40 mL de água 
Destilada em temp. ambiente.
111 g = 1 L (1000 mL)
X g = 40 mL
X = 4,44 g de Manitol
MEIOS DE CULTURA
PREPARAÇÃO
MEIOS DE CULTURA
PREPARAÇÃO
Solução: Água destilada + 
Manitol;
Elemayer = vedar com algodão 
e papel madeira e fita de papel;
MEIOS DE CULTURA
MÉTODOS DE ESTERILIZAÇÃO
1 - Autoclave (calor úmido) 120ºC
por 15 a 20 minutos.
- Vapor fluente
MANIPULAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA
TÉCNICAS DE SEMEADURA
TÉCNICAS DE SEMEIO 
Cuidados: 
Técnicas assépticas; 
Ambiente estéril – próximo à chama (bico de Bunsen); 
Alças devem ser flambadas antes e depois do uso; 
Tubos, quando abertos, devem ser flambados antes e 
depois do uso. 
MEIOS DE CULTURA
TÉCNICAS DE SEMEADURA
1 - Semeadura quantitativa com
alça calibrada.
MEIOSDE CULTURA
TÉCNICAS DE SEMEADURA
2 - Semeadura por esgotamento.
Técnica necessária para o 
isolamento e obtenção de culturas puras; 
Com a alça de platina fazer estrias na superfície do 
meio de cultura, até o esgotamento de todo material 
presente na alça 
Obtenção de culturas puras por semeadura por 
esgotamento
• Obtenção de amostras puras (contém apenas um tipo de 
microrganismo).
• Verificar a pureza da amostra
• Método de assepsia (impedir contaminações) • Avaliar a pureza da amostra• A quantidade de diferentes 
microrganismo
• Obter colônias Isoladas
Várias células 
proveniente de uma 
única célula (bilhões 
de células)
- Por que é importante estudar o crescimento microbiano?
- Isolar os agentes causais das doenças infecciosas
- Identificação dos agentes causais das doenças infecciosas
- Desenvolvimento de agentes antimicrobianos
- Preservação dos alimentos
- Estudo: Bioquímica, Genética, Biotecnologia
Crescimento
As bactérias se proliferam por divisão 
binária em duas metades equivalentes
- Como as bactérias se multiplicam?
Ácidos nucléicos
Proteínas
Lipídeos
polissacarídeos
1 2Tempo de Geração
Crescimento
1 220min 420min 820min
X= x0.2
n Onde n= número 
de gerações
X=1.23
X=8
Crescimento
Tempo de Geração
Crescimento
Exercícios:
- Sabendo-se de o tempo de geração de E. coli é de 20 minutos, partindo-se de 
uma única célula quantas células bacterianas serão obtidas após 1 hora de 
cultivo? 
R: Em 1 hora de cultivo (60 minutos) teremos 3 gerações 
(n=3). Então: X= xo.2n
X= 1.23
X= 8
1 hora
2 horas R: Em 2 horas de cultivo (120 minutos) 
teremos 6 gerações (n=6)
Então: X= xo.2n
X= 1.26
X= 64
- E após 2 horas de cultivo? 
- Quero traçar uma Curva de Crescimento Bacteriano. Como o crescimento da 
cultura bacteriana pode ser acompanhado?
1. Contando-se o número de células ao longo do cultivo
2. Acompanhando-se o aumento da turvação ao longo do cultivo
3. Outras possibilidades....
1. Contando-se o número de células ao longo do cultivo
- Quero traçar uma Curva de Crescimento Bacteriano. Como o crescimento da 
cultura bacteriana pode ser acompanhado?
2. Acompanhando-se o aumento da turvação ao longo do cultivo
CSHA (Número Mais provável)
Curva de Crescimento
A
DB
C
Fases da Curva de Crescimento de bactérias: 
- Fase Lag - Fase Estacionária 
- Fase Exponencial ou Logaritmica (Log) - Fase de Declínio
A C
B D
CARACTERIZAÇÃO 
BACTERIANA 
COLORAÇÕES
Colorações diferenciais
• Reage de modo distinto em diferentes bactérias;
• Servem para diferenciar as bactérias;
• Ex.: Gram e BAAR.
Método de Gram
Bactérias gram-positivas e gram-negativas
Gram-
positivas
Gram-
negativas
O corante púrpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bactéria, corando-a de violeta escuro ou purpura.
As bactérias que retêm essa cor apos a tentativa de descolori-las com álcool são classificadas como gram-
positivas; as bactérias que perdem a cor violeta escuro ou purpura apos a descoloração são classificadas como
gram-negativas.
BAAR
• BACTÉRIAS ÁLCOOL-ÁCIDO-RESISTENTES;
• Alta concentração (60%) de um lipídeo 
hidrofóbico (ácido micólico) que previne a 
entrada dos corantes, incluindo os utilizados na 
coloração de Gram. 
• Resistem a descoloração;
• Misturas de álcool-ácido usadas na identificação;
• Bactérias álcool-ácido resistentes podem ser coradas com carbolfucsina; o 
aquecimento aumenta a penetração do corante.
Paredes celulares atípicas (Mycoplasma)
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BARBOSA, H. R.; TORRES, B. B. Microbiologia básica. São Paulo: Atheneu, 2005.
BLACK, J. G. Microbiologia – fundamentos e aplicações. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2002.
KONEMAN, E. W.; ALLEN, S. D.; JANDA, W. M.; SCHRECKENBERGER, P. C.; WINN
JÚNIOR, W. C. Diagnóstico microbiológico. Texto e atlas colorido. 5. ed. Rio de Janeiro:
MEDSI Ed. Médica e Científica, 2001.
LEVINSON, W.; JAWETZ, E. Microbiologia médica e imunologia. 7. ed. Porto Alegre:
Artmed, 2005.
MINS, C.; PLAYFAIR, J.; RITT, I. WAKELIN, D.; WILLIAMS. R. Microbiologia médica. 2. ed.
São Paulo: Manole, 1999.
PELCZAR Jr., M. J.; CHAN, E. C. S. KRIEG, N. R. Microbiologia – conceitos e aplicações.
2. ed. v. 1 e 2. São Paulo: Makron Books do Brasil, 1997.
SPICER, W. J. Bacteriologia, micologia e parasitologia clínicas – um texto ilustrado em
cores. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.
THOMAS, C. L. Dicionário médico enciclopédico – Taber. 17. ed. São Paulo: Manole, 2000.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. H. Microbiologia. 8. ed. São Paulo: Artmed, 2005.
TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM. Microbiologia. 4. ed. São Paulo: Atheneu, 2005.
Para Refletir 
OBRIGADA!!!!