Doseamento da Bilirrubina Direta e Total

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Doseamento da bilirrubina direta e total
Ciências Biomédicas Laboratoriais
Bioquímica Laboratorial clínica II
Docente: António Rodrigues 
Doseamento da bilirrubina direta e total
Trabalho realizado por:
35205 - Ana Rocha		
35218 - Carlos Brêa		
35217 - Diana Monteiro		
35209 - Tânia Martins
		
Índice
Índice de tabelas 
Tabela 1: Quantidades a pipetar para os tubos (BT)	8
Tabela 2: Quantidades a pipetar para os tubos (BD)	9
Tabela 3: Leitura das absorvâncias no espectrofotómetro a 540 nm (BT)	10
Tabela 4: Leitura das absorvâncias no espectrofotómetro a 540 nm (BD)	11
Tabela 5: Comparação dos intervalos de confiança com os valores obtidos do controlo de qualidade patológico (BT)	14
Tabela 6: Comparação dos intervalos de referência com os valores obtidos da amostra (BT)	14
Tabela 7: Comparação dos intervalos de confiança com os valores obtidos do controlo de qualidade patológico (BD)	14
Tabela 8: Comparação dos intervalos de referência com os valores obtidos da amostra (BD)	15
Tabela 9: Comparação dos intervalos de referência com os valores obtidos da amostra (BI)	15
Introdução
	A bilirrubina é um pigmento amarelo presente no sangue e nas fezes. Níveis altos de bilirrubina causam a icterícia, esta é uma manifestação clínica da hiperbilirrubinémia, que consiste numa deposição de pigmentos biliares na pele, originado coloração amarela nas mucosas e na pele(1).
	A bilirrubina é produzida pelo organismo quando os glóbulos vermelhos se desintegram (produto da degradação do heme) ou são destruídas pelas células reticuloendoteliais. A desintegração de células velhas é um processo normal e saudável. A bilirrubina formada liga-se à albumina e é transportada para o fígado onde é conjugada com ácido glucorónico (bilirrubina conjugada ou direta) para se tornar solúvel e ser excretada dentro do ducto biliar e armazenada na vesicula. Depois disto, a bilirrubina vai para o intestino delgado como bile para auxiliar na digestão da gordura, sendo por excretada nas fezes (após circularem no sangue durante cerca de 120 dias). No intestino, a maior parte da bilirrubina conjugada é reabsorvida e o restante é metabolizado por bactérias intestinais e eliminado, dando às fezes a sua cor característica(2).
	A bilirrubina associada ao açúcar no fígado é chamada de direta ou conjugada, enquanto a não associada ao açúcar é denominada de indireta ou não conjugada. Toda a bilirrubina presente no sangue é referida como bilirrubina total. O doseamento desta no sangue fornece uma contagem precisa dos níveis dos três tipos de bilirrubina no sangue: direta, indireta e total.
	Existe uma série de doenças herdadas ou adquiridas que afetam a produção, captação, metabolismo e excreção da bilirrubina, resultando numa hiperbilirruminémia como presença de lesões hepáticas, obstrução biliar ou quando a velocidade de destruição dos glóbulos vermelhos está aumentada que prejudicam a conjugação e a excreção da bilirrubina ou obstrução das vias biliares. Outra causa da elevação dos níveis da bilirrubina são problemas sanguíneos sem relação com doenças hepáticas. 
	O seu diagnóstico consiste na triagem e monitoração de doenças hepáticas e anemias hemolíticas. Por exemplo se a bilirrubina não estiver associada ao açúcar (conjugada) no fígado e/ou se não estiver sendo adequadamente removida do sangue, significa que pode haver um problema no fígado. Por isso, o exame da bilirrubina presente no sangue é eficaz para avaliar danos hepáticos. 
	Observa-se hiperbilirrubinémia não conjugada em recém-nascidos (icterícia fisiológica) num aumento de destruição de glóbulos vermelhos (anemia hemolítica – destruição de muitas células sanguíneas devido a doenças autoimunes, defeitos genéticos, intoxicação medicamentosa ou infeção, hematoma extenso) na eritropoiese defeituosa assim como em algumas doenças genéticas pouco frequentes (síndrome de Crigler-Najjar, síndrome de Gilbert)(3).
	A hiperbilirrubinémia conjugada associa-se a uma diminuição da excreção da bílis devido a doenças hepáticas (hepatites agudas e crônicas ou cirrose), a uma colestase intra ou extra hepática, nas reações tóxicas a várias drogas e nas obstruções do trato biliar.
	Às vezes, a taxa de bilirrubina é mensurada em conjunto com outros exames. Geralmente, para avaliar o fígado, é realizado um conjunto de exames que analisam os níveis da bilirrubina, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (ALP), albumina, proteína total. 
	Tanto em adultos como em crianças, os sintomas relacionados à elevação da bilirrubina são icterícia, amarelamento da pele ou olhos, fadiga, coceira na pele, urina escura e falta de apetite.
	O método utilizado para a quantificação de bilirrubina direta e total foi o método colorimétrico e enzimático.
	A lei de Beer-Lambert diz-nos que a intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente (4).
O limite de linearidade é de 15 mg/dL.
	
Objetivo 
	O trabalho tem por objetivo a determinação de bilirrubina direta e total através do método enzimático colorimétrico, numa amostra de soro. Serão feitas leituras das absorvâncias, e a partir das quais serão calculadas as concentrações de bilirrubina total e direta na amostra a partir da Lei de Beer–Lambert. Com a concentração obtida serão feitas comparações com os valores de referência para averiguar se esta se encontram dentro dos intervalos dos mesmos e assim poder concluir se a amostra analisada contêm níveis normais ou anormais de bilirrubina, e perante os resultados obtidos concluir acerca da presença ou ausência de patologia associada à bilirrubina.
Princípio do método 
	Este método é enzimático colorimétrico, visto que a bilirrubina direta presente na amostra reage com ácido sulfanilico diazotado, originando um complexo colorido que se pode determinar espectrofotometricamente a 540 nm. Neste método, a cetrimida solubiliza a bilirrubina indireta permitindo a sua reação juntamente à fração direta. Os termos direta e total referem-se às características da reação na presença ou ausência de solubilizantes. A bilirrubina direta e indireta equivalem de forma aproximada às frações conjugadas e não conjugadas. 
	A intensidade da cor é proporcional à concentração de bilirrubina na amostra de soro. A Lei de Beer-Lambert estabelece uma relação entre a absorvância de uma solução e a sua concentração, quando atravessada por uma radiação luminosa monocromática. 
	
Materiais e reagentes 	
Tubos de ensaio;
Pontas de micropipetas;
Espectrofotómetro;
Micropipetas de 100-1000 µL;
Micropipetas de 20 - 200 µL;
Suportes para tubos de ensaio;
Vórtex;
Cuvetes;
Gobelé;
Esguicho com água destilada;
Papel absorvente; 
Amostra (200);
Controlo de Qualidade normal;
Padrão;
Reagente de trabalho;
Reagente AT e BT;
Reagente AD e BD.
Procedimento
Bilirrubina Total 
Começou-se por hidratar o padrão com 5 mL de água destilada;
De seguida preparou-se 20 mL do reagente de trabalho adicionando 4 mL do conteúdo do frasco do reagente BT num frasco com 16 mL do reagente AT fazendo assim uma diluição 1/5 (1/5 × 20 mL = 4 mL);
Pipetar para tubos de ensaio:
 Tabela 1: Quantidades a pipetar para os tubos (BT)
	
	
Branco reagente
	
Branco amostra
	
Padrão
	Controlo de Qualidade Normal
	
Amostras
	Padrão 
	
	
	100 µL
	
	
	Controlos de Qualidade (Normal)
	
	
	
	100 µL
	
	Amostras (200)
	
	100 µL
	
	
	100 µL
	Reagente de Trabalho (A)
	1,0 mL
	
	1,0 mL
	1,0 mL
	1,0 mL
	Água destilada
	100 µL
	
	
	
	
	Reagente AT
	
	1,0 mL
	
	
	
Agitar bem no vórtex e deixar os tubos durante 2 minutos à temperatura ambiente;
Ler a absorvância (A) dos brancos da amostra contra a água destilada a 540nm;
Ler a absorvância (A) das amostras e do padrão contra o branco do reagente a 540nm;
Bilirrubina direta
Começou-se por preparar 25 mLdo reagente de trabalho, vertendo 5 mL de um frasco de um reagente BD num frasco com 20 mL do reagente AD; Depois de preparado tem que ir à estufa a 37ºC e sempre que utilizado volta-se a incubar;
Pipetar para tubos de ensaio:
 
Tabela 2: Quantidades a pipetar para os tubos (BD)
	
	
Branco reagente
	
Branco amostra
	
Amostras
	
Controlos de Qualidade (Normal)
	Controlos de Qualidade (Normal)
	
	
	
	100 µL
	Amostras (200)
	
	100 µL
	100 µL
	
	Reagente de Trabalho (A)
	1,0 mL
	
	1,0 mL
	1,0 mL
	Água destilada
	100 µL
	
	
	
	Reagente AD
	
	1,0 mL
	
	
Agitar bem no vórtex e deixar reagir durante 5 minutos a 37ºC;
Ler a absorvância (A) dos brancos da amostra contra a água destilada a 540nm;
Ler a absorvância (A) das amostras contra o branco do reagente a 540nm;
Resultados 
Bilirrubina Total 
Tabela 3: Leitura das absorvâncias no espectrofotómetro a 540 nm (BT)
	
	Absorvância
	Médias
	Minimização do erro
	Branco amostra
	0,054
	
	
	Branco reagente
	0,048
	
	
	Padrão
	0,398
	0,358
	
	Padrão 
	0,409
	
	
	Amostra (200)
	0,596
	0,549
	0,596 – 0,054 = 0,542
	Amostra (200)
	0,610
	
	0,610 – 0,054 = 0,556
	Controlo Normal
	0,150
	0,150
	
	Controlo Normal
	0,151
	
	
Bilirrubina direta
Tabela 4: Leitura das absorvâncias no espectrofotómetro a 540 nm (BD)
	
	Absorvância
	Médias
	Minimização do erro
	Branco amostra
	0,053
	
	
	Branco padrão
	0,002
	
	
	Padrão
	0,398
	0,358
	
	Padrão 
	0,409
	
	
	Amostra (200)
	0,154
	0,17
	0,154 – 0,053 = 0,101
	Amostra (200)
	0,186
	
	0,186 – 0,053 = 0,133
	Controlo Normal
	0,095
	0,097
	
	Controlo Normal
	0,099
	
	
Cálculos 
Bilirrubina Total 
Bilirrubina direta
Bilirrubina indireta 
Bilirrubina Indireta = Bilirrubina Total – Bilirrubina Direta 
Bilirrubina Indireta = 7,48 mg/dL – 2,31 mg/dL 
Bilirrubina Indireta = 5,17 mg/dL
Discussão de Resultados 
Bilirrubina Total 
Tabela 5: Comparação dos intervalos de confiança com os valores obtidos do controlo de qualidade patológico (BT)
	
	
Intervalos de Confiança (mg/dL)
	Valores obtidos (mg/dL)
	Controlo de Qualidade Normal
	[1,98 – 2,84]
	2,04
	Mediante os resultados obtidos nesta atividade laboratorial pode-se verificar que o controlo de qualidade obedece aos requisitos necessários sendo possível valida-los, segundo os intervalos de confiança.
Tabela 6: Comparação dos intervalos de referência com os valores obtidos da amostra (BT)
	
	
Intervalos de Referência(mg/dL)
	Valores obtidos (mg/dL)
	Amostra (200)
	Até 1 
	7,48
	Mediante os resultados obtidos verifica-se que a amostra está acima dos intervalos de referência, sendo assim possível constatar que a amostra analisada contem níveis elevados de bilirrubina total no soro.
Bilirrubina direta
Tabela 7: Comparação dos intervalos de confiança com os valores obtidos do controlo de qualidade patológico (BD)
	
	
Intervalos de Confiança (mg/dL)
	Valores obtidos (mg/dL)
	Controlo de Qualidade Normal
	[0,46 – 0,86]
	1,32
	Mediante os resultados obtidos nesta atividade laboratorial pode-se verificar que o controlo de qualidade não obedece aos requisitos necessários não sendo possível valida-los, segundo os intervalos de confiança.
Tabela 8: Comparação dos intervalos de referência com os valores obtidos da amostra (BD)
	
	
Intervalos de Referência(mg/dL)
	Valores obtidos (mg/dL)
	Amostra (200)
	Até 0,2
	2,31
	Mediante os resultados obtidos verifica-se que a amostra está acima dos intervalos de referência, sendo assim possível constatar que a amostra analisada contem níveis elevados de bilirrubina direta no soro.
Bilirrubina indireta 
Tabela 9: Comparação dos intervalos de referência com os valores obtidos da amostra (BI)
	
	
Intervalos de Referência(mg/dL)
	Valores obtidos (mg/dL)
	Amostra (200)
	Até 0,8
	5,17
Conclusão
Com a prática desta atividade foi-nos possível realizar o doseamento de bilirrubina total e direta conhecendo o método em questão e as suas limitações. Este trabalho foi realizado através do parâmetro bioquímico de espetrofotometria sendo que, a leitura das absorvâncias só se consegue realizar através dos resultados obtidos e transmitidos pelo espectrofotómetro, que é um aparelho muito utilizado no laboratório, por ter a capacidade de medir e comparar a quantidade de luz absorvida por uma solução. Para a correta utilização do método é necessário que o espectrofotómetro esteja calibrado e que sejam adotadas medidas corretas de leituras e de limpeza do material para que não ocorram interferências com os nossos resultados. 
Foram realizados duplicados de modo a minimizar os erros, sendo por isso, usado o cálculo da amplitude relativa, que nos permite determinar um valor médio dos mesmos. Tendo em conta que as amplitudes relativas do padrão (BT), amostra (BD) se encontram acima dos 10%, o que indica que não apresentam precisão. 
O limite de linearidade representa o limite de concentração para a qual a lei de Beer-Lambert é válida, neste caso em específico é de 15 mg/dL. Para concentrações superiores ao limite de linearidade observado no desvio da lei de Beer-Lambert, deixa de existir a proporcionalidade linear entre concentração e absorvância, sendo necessário proceder à diluição da amostra de forma a que esta se enquadre no Limite de Linearidade.
	Uma atividade laboratorial pode ter os seus resultados de controlo validados quando comparados com intervalos de confiança já conhecidos se encontram entre os mesmos valores. Posto isto, nesta atividade laboratorial em específico, podemos concluir que o nosso método para a bilirrubina total foi validado uma vez que o controlo normal utilizado se encontra dentro dos intervalos de confiança. Sendo que o nosso controlo foi validado, podemos, por conseguinte, validar o nosso método e deste modo concluir que a amostra encontra-se elevada perante os valores de referência. Quanto ao doseamento de bilirrubina direta, o método não se pode validar uma vez que os resultados obtidos não estão dentro dos intervalos de confiança, assim sendo, não se pode validar os resultados obtidos da amostra. 
 Na análise da bilirrubina indireta obtivemos um valor bastante elevado (5,17 mg/dL) em comparação com o intervalo de referência (0,8 mg/dL), o que era expectável visto que tanto as concentrações de bilirrubina direta como as de bilirrubina total estavam aumentadas. É de notar que não podemos validar o método em questão pois o doseamento de bilirrubina direta não se encontrava dentro dos intervalos de confiança, como o cálculo da bilirrubina indireta resulta da subtração da bilirrubina total pela direta não se pode validar a atividade laboratorial realizada, pelo que deveríamos realizar novamente o doseamento da bilirrubina direta.
	O diagnóstico clínico não se deve basear somente neste teste, e sim complementar-se com os dados clínicos e do laboratório.
 
	
Bibliografia
1. 	Bilirrubina [Internet]. [cited 2018 May 29]. Available from: http://www.labtestsonline-pt.org/tests/Bilirubin.html?tab=3
2. 	Bilirrubina Conjugada [Internet]. [cited 2018 May 29]. Available from: http://www.labtestsonline-pt.org/Glossary/Glossary_Conjugated_bilirubin.html
3. 	Hiperbilirrubinemia [Internet]. [cited 2018 May 29]. Available from: http://www.hepcentro.com.br/gilbert.htm
4. 	Conceito da lei de Lambert-Beer [Internet]. [cited 2018 Mar 12]. Available from: http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/conceito.html