Mecanismos de Replicação do DNA

Prévia do material em texto

Estrutura do DNA:
Fosfato○
O açúcar desoxirribose (uma pentose que possui apenas um átomo de hidrogênio no 
carbono 2', ao contrário da ribose, que compõe o RNA e possui um grupo hidroxila, OH, 
nesta opção).
○
Adenina e guanina possuem dois anéis aromáticos → purina
Citosina e timina possuem apenas um anel aromático → pirimidina
Uma das quatro bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina e timina. Sendo que:○
A base nitrogenada se liga ao carbono anomérico (carbono 1') da desoxirribose por meio 
de uma ligação β-glicosídica.

O fosfato se liga a desoxirribose por meio de uma ligação fosfodiéster. A hidroxila do 
carbono 3' da desoxirribose se liga ao grupo fosfato ligado à hidroxila do carbono 5' da 
pentose do segundo nucleotídeo através desta ligação.

O DNA é um biopolímero formados por polinucleotídeos. Cada subunidade (nucleotídeo) é 
formada 3 componentes químicos:
•
As duas fitas se mantém unidas por meio de ligações não covalentes (pontes de H) entre 
as bases de cada fita, gerando uma "escada em espiral".
○
As ligações de hidrogênio ocorrem através do pareamento entre uma base purina e 
outra base pirimidina complementares. Dessa forma tem-se:
○
O DNA é uma molécula composta por duas fitas de nucleotídeos torcidos no formato de dupla 
hélice.
•
Base nitrogenada + pentose = nucleosídeo
Nucleosídeo + fosfato = nucleotídeo
Mecanismos de Replicação do DNA
quinta-feira, 1 de junho de 2017 09:09
 
O par G-C possui 3 pontes de hidrogênio, enquanto o par A-T só possui 2. Dessa 
forma, um DNA que possui muitos pares G-C é mais estável, pois uma desnaturação 
requereria um maior nível de temperatura para separar as duas fitas. 
Essa polaridade garante o formato de dupla hélice, graças a interação entre os 
pares de bases. Essa forma de empilhamento estabiliza a molécula.

A fita de DNA tem disposição antiparalela, gerada pelas ligações fosfodiéster. Cada 
ligação açúcar-fosfato possui uma polaridade, um sentido: 5' para 3'. E na molécula 
dupla fita de DNA, as duas fitas tem polaridade inversa: uma com sentido 5'-3' e outra 
no sentido 3'-5'.
○
A porção 5' da fita sempre termina com o fosfato e a porção 3' sempre 
termina com OH do carbono 3'. 
Organização genômica:
O genoma de eucariotos é organizado de maneira distinta ao genoma de procariotos. Dentre as 
principais distinções tem-se:
Genoma Eucarioto Genoma Procarioto
Número de cromossomos variável Grande maioria possui apenas um cromossomo
Cromossomos com poucas regiões distintas 
(centrômeros e telômeros)
Cromossomos são uniformes quanto a densidade 
gênica. Mais genes →maior tamanho 
Evolui para novas funções principalmente por 
duplicação gênica
Repertório gênico aumenta principalmente por 
HGT
Unidades transcricionais geralmente atuam Há genes tipicamente cotranscritos → operons
 
Unidades transcricionais geralmente atuam 
sobre um único gene.
Há genes tipicamente cotranscritos → operons
Os processos celulares são altamente 
compartimentalizados → existência do núcleo
Muitos processos celulares acoplados
Como ocorre a síntese de DNA? 
Experimento de Meselson-Stahl►
Semiconservativo: as duas fitas de uma molécula de DNA seriam separadas e cada fita 
de DNA serviria de modelo para síntese de uma nova fita, que seria complementar →
cada molécula-filha teria uma fita do DNA original e outra fita recém-sintetizada;
○
Conservativa: a molécula de DNA original seria conservada e uma nova molécula seria 
sintetizada, consistindo em dois filamentos recém produzidos;
○
Dispersiva: resultaria em duas moléculas híbridas → cada fita seria uma mistura entre o 
DNA parental e o DNA recém-sintetizado.
○
Haviam três modelos que buscavam explicar como acontecia a replicação de DNA:
Os dois cientistas tentavam descobrir os mecanismos da replicação.
Quando cultivadas neste meio com 15N, as bactérias assimilaram o nitrogênio e o 
utilizaram para sintetizar novas moléculas biológicas, incluindo o DNA.
a.
Depois de muitas divisões celulares, o DNA das células estava bem marcado com o 
isótopo pesado.
b.
Cultivaram E. coli em um meio contendo um isótopo pesado de nitrogênio (15N), em vez da 
forma leve normal (14N).
1.
O crescimento foi mantido durante várias divisões celulares.a.
As células foram removidas do meio com 15N e inseridas em um meio com 14N.2.
Coletaram pequenas amostras de cada geração, extraíram e purificaram seu DNA.3.
O método separa as moléculas em bandas ao girá-las em alta velocidade na presença de 
outra molécula, CsCl (cloreto de césio), formando um gradiente de densidade que 
permite que pequenas diferenças, como o 15N e o 14N sejam detectadas.
a.
Mediram a densidade do DNA por meio da centrifugação por gradiente de densidade.4.
Analisaram o DNA das primeiras quatro gerações, que produziram os seguintes padrões:5.
 
Geração 0 (antes da mudança do meio → fita parental): produziu uma única faixa, 
mostrando que o DNA apenas continha o 15N.
a.
Esse resultado mostrava que as moléculas de DNA eram híbridas de DNA leve e 
pesado. 
○
Geração 1 (primeira replicação pós mudança do meio): produziu uma única banda 
também, porém a banda foi superior, um intermediário entre a densidade do DNA 
pesado de 15N e o leve de 14N.
b.
Este padrão mostrou que o DNA era replicado semiconservativamente. Pois síntese 
de DNA só poderia gerar moléculas com comportamento híbrido (presença da fita 
"parental" com a fita leve) e outra com somente leve.
○
Geração 2 (segunda replicação pós mudança do meio): produziu duas bandas distintas, 
uma na posição de molécula híbrida e outra na posição de molécula leve.
c.
Cada molécula de DNA híbrida da geração 2 deu origem a uma molécula híbrida e 
uma molécula leve. Enquanto a molécula de DNA leve formada na geração 2 só 
formou mais moléculas leves. 
○
O que confirmou o modelo de replicação semiconservativa.○
Gerações 3 e 4: continuaram tendo o mesmo comportamento do padrão mostrado na 
geração 2.
d.
Replicação do DNA
Forquilha de replicação: abertura da fita-dupla parental para a síntese das 
fitas “filhas”.
□
Iniciação → formação da forquilha de replicação e do replissomo;○
Divide-se em:
Replicação: é um processo onde cada fita de uma molécula de DNA age com um molde para 
direcionar a montagem de bases complementares, de modo a reestruturar uma dupla hélice 
idêntica a original. Deste modo, a replicação pode ser resumida como um processo de 
duplicação, ou síntese deste DNA.
 
fitas “filhas”.
Replissomo: complexo nucleoproteico que coordena as atividades na forquilha 
de replicação. 
□
Elongação → processo de formação das fitas contínuas e descontínuas○
Terminação → remoção dos primers de RNA e posterior ação da DNA ligase.○
A replicação é relativamente parecida entre procariotos e eucariotos, porém possui 
diferenças ligadas principalmente aos efeitos da organização genômica destes tipos 
celulares.

O processo de replicação é mediado por um aglomerado proteico, onde cada estrutura 
desempenha diferentes atividades.

A replicação só acontece porque proteínas específicas se ligam a estas sequências, 
permitindo o início da replicação.
•
Em eucariotos, a síntese ocorre na fase S do ciclo celular. ○
Esta ligação entre origens e proteínas iniciadoras ocorrem de acordo com o ciclo 
celular.
•
Em leveduras, cada origem é formada por 100 a 200 pares de bases, ricas em 
AT (que se dissociam facilmente → 2 pontes de hidrogênio).
○
Devido a sua organização mais simples os procariotos possuem 
apenas uma origem de replicação, dando origem a duas 
forquilhas de replicação.
□
Já os eucariotos possuem várias origens de replicação, 
permitindo que a síntese ocorra simultaneamente em vários 
locais dos cromossomos, dando origensa inúmeras forquilhas 
de replicação. 
□
O número de origens de replicação é variável, dependendo das características 
da espécie.
○
Essas sequências são características "universais" da replicação, estando presentes 
tanto em eucariotos quanto procariotos.
•
A replicação se inicia apenas em locais precisos na molécula de DNA. Estes locais 
possuem um contexto de sequência específico e são chamados de origens.
►
Onde se inicia a replicação? 
Atua adicionando desoxirribonucleotídeos à ponta 3' em crescimento. 
Utiliza como molde um único filamento de DNA que foi exposto na deselicoidização 
localizada da dupla hélice.

Consegue estender uma cadeia de nucleotídeos, mas não consegue começar uma cadeia 
→ necessita de um primer, uma cadeia curta de RNA, complementar a uma região 
específica do DNA, sintetizada pela primase (um tipo de RNA polimerase).

Esta função de revisão garante a fidelidade da replicação já que retira bases 
inseridas erroneamente, evitando que aja instabilidade ou taxas altas de 
□
Como uma exonuclease (sentido 3' para 5') removendo bases erroneamente 
pareadas
○
Além de ter atividade de polimerase essa enzima atua:
DNA polimerase: enzima que catalisa a reação de replicação.
 
inseridas erroneamente, evitando que aja instabilidade ou taxas altas de 
mutação nas moléculas geradas.
Também se configura como uma função de revisão, pois os primers de RNA 
podem possuir erros (primase não tem função de revisão), precisando serem 
removidos e posteriormente substituídos por desoxirribonucleotídeos.
□
Como uma exonuclease (sentido 5' para 3') degradando filamentos de RNA →
primers
○
Tipos de DNA polimerases
Apesar dos mecanismos de replicação serem bastante similares entre eucariotos e 
procariotos, a complexidade dos eucariotos torna os componentes da maquinaria 
um pouco distintos:
DNA polimerase I: substitui os fragmentos de Okazaki 
DNA polimerase II: envolvida em reparo do DNA
DNA polimerase III: principal enzima que catalisa a síntese de 
DNA

Procariotos: há 3 tipos de DNA polimerases.•
Eucariotos: há 13 DNA polimerases diferentes•
Deste modo, os dois tipos de organismos se diferem nos tipos de DNA polimerases 
utilizadas durante a replicação.
A base adicionada para gerar a nova fita deve ser complementar a fita molde.○
Precisam da extremidade 3' por causa do OH livre para a formação da ligação 
fosfodiéster no arcabouço da nova fita.
○
DNA polimerases apenas realizam a síntese adicionando nucleotídeos na ponta 3' em 
crescimento.

Para realização a replicação de modo ágil há a utilização da maquinaria celular → replissomo. 
Para aumentar a processividade da polimerase.
Embora a DnaA seja importante para a montagem do replissomo, não faz parte da 
maquinaria de replicação. Sua função é apenas guiar o replissomo para o local 
correto no cromossomo circular procarionte para iniciar a replicação
○
Iniciação: Possuem uma única origem chamada oriC (rica em AT, mais fáceis de 
dissociar). Na oriC há regiões com sequências específicas de bases (DnaA boxes) na qual 
a proteína DnaA se liga. Com a ligação, a origem é deselicoidizada e as múltiplas 
proteínas DnaA se ligam as fitas simples recém separadas. Com esta configuração, as 
helicases (DnaB) se ligam e promovem a rompimento de mais pontes de hidrogênio, 
separando ainda mais as duas fitas.

As SSBs são proteínas de ligação à fita simples e se unem às fitas recém separadas para 
estabilizá-las e impedir que voltem à constituição de dupla hélice.
Já as topoisomerases (DNA girases) estabilizam as tensões, geradas pela helicase ao abrir 
a forquilha de replicação, que atingem a porção dupla fita que ainda não foi separada. As 
topoisomerases clivam o DNA para que ele gire e depois une os filamentos gerados. 
Replicação em procariotos
 
Para a síntese desta fita ocorrer só é necessária a ação de um 
primer de RNA 

A fita que tem a ponta 3' em crescimento seguindo o mesmo sentido do 
movimento da forquilha será sintetizada sem interrupção → fita contínua ou 
leading
•
Cada fragmento de Okasaki terá um primer, pois quando a DNA 
polimerase produz um fragmento, precisa de outro primer na 
região seguinte para continuar a síntese do próximo fragmento

A fita que tem a ponta 3' em crescimento em um sentido oposto ao 
movimento da forquilha também será sintetizada pela extremidade 3', mas 
pelo sentido contrário originando os fragmentos de Okasaki (fitas curtas de 
DNA recém-sintetizado) → fita descontínua ou lagging
•
Como dito anteriormente, a DNA polimerase sempre promove a síntese na porção 
3' em crescimento (5' → 3'). Deste modo, apenas uma fita pode servir como molde 
no sentido da forquilha.
○
Elongação: o processo propriamente dito de síntese da molécula de DNA ocorre sob 
certas circunstâncias. 

O replissomo bacteriano é formado pela enzima de síntese (DNA pol III) + um grampo β. A 
união do grampo a DNA pol III permite que a enzima se mantenha ligada às fitas molde, 
As fitas geradas na replicação têm que ser complementares às fitas moldes. A 
fita b será contínua pois a sua ponta 3' em crescimento segue o sentido da 
Após a ação da DNA polimerase I a DNA ligase une os fragmentos de Okasaki ao 
catalisar a formação de uma ligação fosfodiéster entre a extremidade 5'-fosfato de 
um fragmento e o grupo 3'-OH adjacente de outro fragmento.
○
Terminação: há a ação da DNA polimerase I, removendo os primers de RNA e 
adicionando os nucleotídeos correspondentes.

Replicação em eucariotos
Bastante similar a replicação em procariotos, porém a organização genômica eucarionte 
garante certas distinções, principalmente na fase de terminação e na ação da helicase.
 
O replissomo eucarioto é formado pela PCNA no lugar do grampo β.
A proteína responsável pelo reconhecimento da origem e posterior início da 
montagem do replissomo é a ORC (complexo de reconhecimento de origem). 
○
Iniciação: nos eucariotos há a presença de inúmeras origens de replicação, sequências 
estas que são ricas em AT.
►
Nucleossomo: constituição básica da cromatina → DNA + histonas.►
Para modelar o DNA recém-sintetizado a CAF-1 + histonas se ligam ao 
antígeno nuclear de proliferação nuclear (PCNA).
□
Este processo acontece com a ação da proteína fator 1 de montagem de cromatina 
(CAF-1), que se associam às histonas e as direcionam para a forquilha de replicação, 
onde serão usadas para a formação de novos nucleossomos.

O replissomo precisa desmontar os nucleossomos dos filamentos de DNA e depois 
adicionar as histonas para remontar este complexo proteína-DNA.
Telômero:►
São regiões localizadas nas extremidades das moléculas de DNA lineares.
Atuam na replicação e são responsáveis pela estabilidade de moléculas de DNA linear.
Há um problema na replicação destas regiões cromossômicas:
Isso gera uma ponta unifilamentar (em uma das fitas) em cada molécula-filha 
de DNA.
→
A fita descontínua demanda primers no início de cada fragmento de Okasaki. 
Quando há o processo de terminação e o último primer é removido, há perda 
destas sequências que estavam na ponta do filamento.
Esta enzima se liga ao prolongamento 3' do DNA e usando o 
pequeno molde de RNA amplia este prolongamento graças a 
sua atividade polimérica;

Após a ampliação, a primase sintetiza um primer e se liga ao 
prolongamento 3', então a DNA polimerase utiliza o primer 
para iniciar a replicação que tem o prolongamento 3' como 
molde para preencher o final do outro filamento de DNA. 

O RNA usado na telomerase serve como molde para a síntese 
de DNA (no alongamento do prolongamento 3'), normalmente 
na transcrição o DNA é o molde para a síntese de RNA, deste 
modo a telomerase se trata de uma transciptase reversa.
→
O telômero preserva a integridadecromossômica por 
associação à proteínas, que formam um revestimento protetor 
para o prolongamento 3'.

A telomerase é uma enzima que possui atividade de polimerase (porção 
proteica) + a adição de um molde, uma pequena molécula de RNA.

A solução para evitar a perda de sequências é adição de múltiplas cópias de uma 
sequência simples, não codificadora, nas pontas dos cromossomos. Isto ocorre 
através da enzima telomerase.
 
para o prolongamento 3'.
Sem este revestimento, o prolongamento 3' estaria exposto e 
poderia ser confundido com quebras filamentares, levando a 
instabilidade cromossômica, podendo levar a ação da 
maquinaria de reparo do DNA.