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MICOTOXINAS Parte 1 1 Universidade Federal do Ceará Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem DEPARTAMENTO DE FARMÁRCIA SETOR DE TOXICOLOGIA Disciplina de Toxicologia II 2 HISTÓRICO • Durante muito tempo: – Alimentos bolorentos: Problema sensorial Rejeição do produto 3 HISTÓRICO • Idade média ao início do Século XX: • Doenças e mortes: – Ergotismo na Europa; » 1ª micotoxicose conhecida pelo homem (Bíblia); » “Fogo de Santo Antônio”; » Edema, convulsões. Frio e calor, Gangrena necrótica amputações; – Aleucia alimentar tóxica na Rússia; (Tricotecenos grupo B) Fotomicrografia: Claviceps purpurea. 4 HISTÓRICO • Início Século XX: – Descoberta da penicilina (1928) e outros antibióticos; – Epidemias esporádicas com animais de criação. 5 HISTÓRICO • Década 60: – Inglaterra: • Doença “X” dos perus: Anorexia, apatia, adinamia das asas ÓBITO – Associação causal com ração contaminada. – Identificação das AFLATOXINAS; 6 HISTÓRICO • 1977 - Conferência internacional sobre micotoxinas (Food Agriculture Organization – FAO / World Health Organization – WHO / United Nations Environment Programme - UNEP): Aflatoxinas, OTA, patulina, zearalenona, tricotecenos, citrinina e ácido penicílico; • De 1977 aos dias atuais: identificação e caracterização de grande número de micotoxinas. 7 MICOTOXINAS • Def.: “Agentes químicos produzidos durante metabolismo secundário de fungos filamentosos, que contaminam alimentos e rações animais, produzindo efeitos agudos ou crônicos, via de regra, carcinogênicos.” (Mídio) • Metabolismo secundário: – Produto não apresenta significado bioquímico específico no crescimento e no desenvolvimento do organismo produtor. – Micromicetos: extenso metabolismo secundário. Alternaria spp. 8 MICOTOXINAS • Fonte de exposição: – Contaminantes químicos diretos dos alimentos: • Incontrolável ou difícil controle; • Vegetais, animais, derivados industrializados; • Presentes na alimentação humana e animal desde o surgimento da produção agrícola intensiva; 9 MICOTOXINAS • Contaminantes químicos diretos dos alimentos: – Alimentos contaminados por micotoxinas: FATO. – Pequenas concentrações; sem alteração no odor, sabor e aparência consumo imperceptível. – Problema ultrapassa a importância meramente acadêmica: PROBLEMA DE SAÚDE PÚBLICA. 10 MICOTOXINAS • Contaminantes químicos diretos dos alimentos: Produtos comercializados: interesse econômico quase prioritário IMPORTÂNCIA DADA AO ASSUNTO 11 MICOTOXINAS • Contaminantes químicos diretos dos alimentos: – Conhecimento do potencial tóxico têm levado a medidas preventivas. – Resultados: • Eliminação de epidemias de Ergotismo; • Controle da Aleucia Tóxica Alimentar (ATA); • Interesse e contínua vigilância em vários países. 12 MICOTOXINAS • Contaminantes químicos diretos dos alimentos: – Amendoim, derivados e similares: • Importância maior: contaminação por Aflatoxinas. • Amostras comerciais têm sido analisadas desde anos 70: quantidades significativas. 13 MICOTOXINAS • Contaminantes químicos diretos dos alimentos: – Cereais e seus produtos: • Milho: – Contaminação maior por aflatoxinas (colheita em ambiente de alta umidade); – Zearalenona bastante frequente; – OTA ocasionalmente em seus produtos. 14 MICOTOXINAS • Contaminantes químicos diretos dos alimentos: – Cereais e seus produtos: • Cevada, centeio, aveia: •Frequente presença de OTA; •Alcalóides do Ergot (Ergotamina); 15 MICOTOXINAS • Contaminantes químicos diretos dos alimentos: – Leguminosas: • Aflatoxinas detectadas em feijão, grão-de-bico e outras leguminosas; 16 MICOTOXINAS • Contaminantes químicos diretos dos alimentos: – Frutas e sucos de frutas: • Frutas secas facilmente contaminadas por fungos; • Figos secos contaminados por aflatoxinas; • Maçãs, sucos e fermentados (cidra e vinagre) contaminados por fungos produtores de patulina: frutos parcialmente deteriorados. 17 MICOTOXINAS • Contaminantes químicos diretos dos alimentos: – Especiarias e ervas medicinais: • Fungos isolados: Aspergillus e Penicillium; • Micotoxinas detectadas: aflatoxinas, esterigmatocistina, citrinina, zearalenona, tricotecenos (toxina T-2) e OTA. 18 MICOTOXINAS • Contaminantes químicos diretos dos alimentos: – Leite e derivados: • Aflatoxina M1 detectada desde década de 70; • Leite materno, de gado, integral, desnatado, pasteurizado, UHT, evaporado, queijos, iogurtes, etc. • Relacionado à alimentação dos animais: teores maiores naqueles secretados pelos alimentados com ração (entre safras). 19 MICOTOXINAS 20 MICOTOXINAS 21 MICOTOXINAS 22 MICOTOXINAS • Micotoxicose: – Qualquer enfermidade causada ao homem e animais pela exposição às micotoxinas. – Características: • Relacionada à alimentação; • Não contagiosa; • Não infecciosa; • Causada pela exposição a micotoxinas. Doença de Urov ou Kashin-Beck 23 MICOTOXINAS • Fungos toxicogênicos: – Capazes de produzir micotoxinas, em condições favoráveis. Ex.: Fungos do gênero Aspergillus. Fotomicrografia: Aspergillus flavus. 24 MICOTOXINAS • Fungos toxicogênicos: – Nem todos os fungos são toxicogênicos; – Nem todos os metabólitos secundários dos fungos são tóxicos. 25 MICOTOXINAS • Fungos toxicogênicos: – Uma única espécie de fungo é capaz de produzir uma ou várias micotoxinas: Ex.: Aspergillus flavus: esterigmatocistina e aflatoxinas. – Uma mesma micotoxina pode ser produzida por diferentes espécies de fungos; Ex.: Aflatoxina B1 : Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus. 26 MICOTOXINAS • Fungos toxicogênicos: – Classificação segundo habitat e substrato: • Fungos de campo; • Fungos de armazenamento; • Fungos de decomposição. Fusarium spp 27 MICOTOXINAS • Fungos toxicogênicos: – Principais gêneros: • Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus, A. nominus, etc. • Fusarium: F. moliniforme, F. proliferatum, F. culmorum, etc. • Penicillium: P. expansum, P. verrucosum, etc. • Outros: Claviceps, Alternaria, Trichoderma, Trichothecium, Myrothecium, dentre outros. Aspergillus spp em Ágar Czapek 28 MICOTOXINAS • Alimentos contaminados por mais de uma micotoxina: – Efeito aditivo; – Efeito sinérgico; – Efeito de potencialização; – Antagonismo. 29 MICOTOXINAS • Fatores que favorecem a micotoxigênese: – Fatores intrínsecos; – Fatores extrínsecos; 30 MICOTOXINAS • Fatores intrínsecos: gênero, espécie e linhagem;– A produção de uma micotoxina não está associada a uma única espécie de fungo; – Dentro de uma espécie micotoxigênica nem todas as linhagens o são; – O potencial de produção varia entre as linhagens de uma espécie. 31 MICOTOXINAS • Fatores extrínsecos: – Condições do substrato; – Condições ambientais; 32 MICOTOXINAS • Condições do substrato: Aw Teores de lipídeos Teores de carboidratos TOXICOGÊNESE 33 MICOTOXINAS • Condições ambientais: – Temperatura ótima de micotoxigênese sempre ligeiramente mais baixa que temperatura ótima para desenvolvimento do fungo; – Temperatura pode afetar estabilidade química da micotoxina produzida; – Umidades altas favorecem micotoxigênese. 34 MICOTOXINAS • Condições ambientais: Regiões clima tropical: (Alta umidade, altas temperaturas) Contaminação e desenvolvimento de fungos Teores micotoxinas 35 MICOTOXINAS • Fatores que favorecem a contaminação e desenvolvimento de fungos em vegetais: – Práticas agrícolas incorretas: contato com o solo esporos; – Lesões nos grãos por insetos; – Armazenamento inadequado: Umidade alta e pouca ventilação; 36 MICOTOXINAS • 1977 - Conferência internacional sobre micotoxinas (Food Agriculture Organization – FAO / World Health Organization – WHO / United Nations Environment Programme - UNEP): – 7 grupos de micotoxinas contaminando alimentos: • Aflatoxinas; • Ocratoxina A; • Patulina; • Zearalenona; • Tricotecenos; • Citrinina; • Ácido penicílico. Colônia Gibberella zeae. 37 MICOTOXINAS • Atualmente devem ser adicionadas: • Esterigmatocistina; • Rubratoxinas A e B; • Citroveridina; • Fumonisinas. Alimento contaminado por Alternaria sp. 38 MICOTOXINAS • Principais: • Aflatoxinas; • Esterigmatocistina; • Ocratoxinas; • Zearalenona; • Fumonisinas. • Tricotecenos; • Patulina; • Citrinina; • Ácido penicílico. • Rubratoxinas A e B; • Citroveridina; • Alcalóides do Ergot; Milho contaminado por fungos. 39 AFLATOXINAS Aflatoxina B1 . 40 AFLATOXINAS • Histórico: – 1960: doença “X” dos perus; – Allcroff & Lewis - Isolamento do “fator tóxico” fluorescente que promovia em cobaias os mesmos sintomas dos perus. – 1961: Sargent et al. – Isolamento Aspergillus flavus e associação com o “fator tóxico”. – AFLATOXINAS Aspergillus FLAvus + TOXINAS – 1963: Coomes e Sanders – Separação por cromatografia em papel duas aflatoxinas: B (azul) e G (verde). 41 AFLATOXINAS • Histórico: – De Iongh et al. – Separação das aflatoxinas B por CCD: dois componentes de Rf diferente: B1 e B2. – 1963: Hartley et al. – Descrição de quatro aflatoxinas: B1 , B2 , G1 e G2 – 1964: De Iongh et al. – Excreção no leite de compostos relacionados à B1 : “toxinas do leite”. – Holzapfel et al. – Isolamento M1. – Outras aflatoxinas identificadas: aflatoxicol, 3B, B2a , G2a , H1 , P1 e Q1 . 42 AFLATOXINAS • Características químicas: – Estrutura: derivados difuranocumarinas; – Solúveis em clorofórmio, metanol, benzeno, acetonitrila (benzeno/ acetonitrila 98:2); – Instáveis à luz UV; – Bastante estáveis a temperaturas superiores a 100ºC: pequena ou nenhuma decomposição de aflatoxinas com cozimento, pasteurização e torrefação de alimentos; 43 AFLATOXINAS 44 AFLATOXINAS • Propriedade especial: Sob luz UV ondas longas: fluorescência – AFBs azul; – AFGs verde; – AFM1 azul; – AFM2 violeta. Espectro de fluorescência das Aflatoxinas: 45 AFLATOXINAS • Fungos produtores: – Aspergillus flavus; – Aspergillus parasiticus; – Aspergillus nomius; – Aspergillus tamarii; Fotomicrografia: Aspergillus flavus. 46 AFLATOXINAS • Ocorrência: – AFBs e AFGs grãos. – AFMs Leite e derivados: Gado confinado, apenas ração AFM1 Milho contaminado por Aspergillus flavus. 47 AFLATOXINAS • Ocorrência em alimentos de origem vegetal: – Culturas em áreas tropicais e subtropicais mais contaminadas; – Aflatoxina B1: binômio causa/efeito bem determinado (ingestão de alimento contaminado/ efeitos tóxicos); – Aflatoxinas em ppb (geralmente simultaneamente, B1 em maior concentração); – Características organolépticas dos alimentos preservadas; 48 AFLATOXINAS • Ocorrência em alimentos de origem vegetal: – Obtenção praticamente impossível de certos alimentos isentos: • Maioria dos países (inclusive Brasil): valores limites para a presença nos alimentos; • OBS.: Valores limites não oferecem proteção efetiva contra efeito carcinogênico. 49 AFLATOXINAS 50 AFLATOXINAS • Condições que favorecem a produção: – Para alimentos ricos em amido (trigo, cevada, arroz): • Teor de água entre 18,3 e 18,5 %; • Umidade relativa do ar 85%. 51 AFLATOXINAS • Condições que favorecem a produção: – Para alimentos ricos em lipídeos (amendoim): • Teor de água entre 9 e 10 %; • Umidade relativa do ar 85%. 52 AFLATOXINAS • Condições que favorecem a produção: – Integridade física do substrato: proteção contra a contaminação. 53 AFLATOXINAS • Condições que favorecem a produção: – Temperatura mínima: 12ºC; – Temperatura máxima: 40 – 42 ºC; – Temperatura ótima: 27ºC. 54 AFLATOXINAS • Contaminação dos alimentos de origem vegetal: – Regra geral: fases de colheita e armazenamento; – Amendoim, milho e algodão: pode ocorrer no campo, após ataque de insetos; 55 AFLATOXINAS • Contaminação dos alimentos de origem vegetal: – Técnicas usuais de processamento de alimentos: • Remoção ineficiente de aflatoxinas sem redução de valores nutricionais. • Exceção: refinamento do óleo comestível. 56 AFLATOXINAS ALIMENTO PAÍS Nº AMOSTRAS INCIDÊNCIA AFB1(%) ANO SOJA ARGENTINA 94 10 1991 TRIGO URUGUAI 123 20 1996 AMENDOIM ÍNDIA 380 97 1995 MILHO ÍNDIA 274 47 1996 ARROZ EQUADOR 99 9 1997 Incidência de AFB1 em diferentes alimentos: Fonte: Pittet, 1998 (adaptado). 57 AFLATOXINAS 58 AFLATOXINAS • Ocorrência em alimentos de origem animal: – Aflatoxinas M1 e M2: produtos de biotransformação; – Leite: alimento importante para humanos; – Crianças: altas taxas de exposição; 59 AFLATOXINAS • Ocorrência em alimentos de origem animal: – Aflatoxina M1 : • Produto hidroxilado da biotransformação da B1 ; • Estimativa: < 3% ingestão AFB1 no leite na forma de AFM1; • Relativamente estável em leite cru e produtos industrializados; • Transformação do leite fluido a leite em pó: concentração; 60 AFLATOXINAS • Ocorrência em alimentos de origem animal: – Aflatoxina M1 : • Manteiga: 10% presente no leite fração cremosa; • Fator importante: confinamentodo gado (alimentação resumida a rações, farelo de amendoim, milho ou algodão frequentemente bolorentas); • Contaminação sazonal: países nos quais animais são confinados durante estação fria; 61 AFLATOXINAS • Ocorrência em alimentos de origem animal: – Aflatoxina M1 : • Níveis máximos tolerados estabelecidos em vários países; 62 AFLATOXINAS PAÍS ALIMENTO LIMITE (mg/L) Brasil Leite líquido 0,5 França Leite líquido 0,05 Holanda Leite líquido 0,05 EUA Leite líquido 0,5 Fonte: Boutrif & Canet 1998. 63 AFLATOXINAS • Toxicocinética: – Absorção • Depende alimento e concentração; • Pode ser completa; – Distribuição: • Metabolismo de 1ª passagem; • Ligação à albumina; • Atingem a maioria dos tecidos; • Acúmulo importante no fígado. 64 AFLATOXINAS • Biotransformação (AFB1): – Reações de fase I e fase II; – Fração microssomal hepática: CYP1A2 e CYP3A4; • Hidroxilação irreversível AFM1 • Hidroxilação reversível AFLATOXICOL (Fração solúvel) AFLATOXICOL como reservatório da AFB1 • Oxidação posição 8-9 8,9- EPÓXIDO Colônia Aspergillus flavus. 65 AFLATOXINAS • Excreção: – Urina; – Fezes (excreção biliar); – Leite (metabólitos hidroxilados). Conjugados com ác. glicurônico e sulfato. 66 Conjugação e excreção 67 AFLATOXINAS • Efeitos tóxicos: – Intoxicação aguda: Aflatoxicose • Dor abdominal, vômitos, hepatomegalia, necrose hepática, insuficiência hepática fulminante. – Episódio: 26 intoxicados arroz contaminado. Taiwan (Concon 1988); • Semelhanças com Síndrome de Reye; – Episódio: caso letal de Síndrome de Reye em criança 3 anos: ingestão arroz mofado c/ 10mg/Kg (Concon ,1988). 68 AFLATOXINAS • Efeitos tóxicos: – Intoxicação crônica: carcinogênese. • Ingestão de alimentos contaminados (baixas concentrações, alta freqüência); • AFB1 grupo 1 IARC – Evidência em humanos; • AFM1 grupo 2B IARC – Evidência em animais; 69 AFLATOXINAS • Toxicodinâmica: – Intoxicação crônica: carcinogênese – Formação 8,9-epóxido; • Dano ao DNA: – Ligação não covalente branda; – Ligação covalente irreversível (N7 guanina)- 8,9-epóxido; 70 AFLATOXINAS • Toxicodinâmica: – AFB1- 8,9-epóxido: • Iniciador do processo carcinogênico; • Meia vida em meio aquoso: 1 seg AFB1- 8,9-epóxido AFB1- diol. – Proposta: intercalação na posição 5 do nucleotídio - não hidrolisado. 71 72 FUNGOS MICOTOXIGÊNICOS • Aflatoxinas: Determinação em alimentos: • CCD (Qualitativa); – Eluentes utilizados: • Clorofórmio/Acetona 9:1 • Tolueno/Acetato de etila/Ácido fórmico 5:4:1 – Estimativa visual da comparação entre intensidade de fluorescência da amostra e padrões de referência; • HPLC c/ detector de fluorescência (quantitativa); 73 AFLATOXINAS Fotografia: Cromatoplaca Setor de Toxicologia - UFC • Fluorescência: Propriedade aproveitável para identificação das aflatoxinas em alimentos; 74 FIM 75 FUNGOS MICOTOXIGÊNICOS • Fusarium: – Doença de Urov ou Kashin-Beck: – Rússia; – Comum em crianças; – Associada à contaminação por F. poae; – Toxina: desconhecida; – Sintomas: • Osteoartrite; • Encurtamento ossos longos; • Deformidade nas articulações; • Fraqueza muscular;
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