cromatografia em papel

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA NATUREZA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
 
 Edivaldo Campos- 2014947647
 Josefa Natália-2014952665
Maísa Barros-2014947807
 Sávio Siqueira. -20149118314
 
TERESINA-PI
MARÇO/2014
Edivaldo Campos- 2014947647
Josefa Natália-2014952665
Maísa Barros-2014947807
Sávio Siqueira. -20149118314
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
Relatório apresentado à disciplina de Química Orgânica Experimental, ministrada pela Professora Dra. Nilza Campos de Andrade, ao curso de Bacharelado em Farmácia como requisito para obtenção de nota parcial.
 
TERESINA-PI
MARÇO/2014
RESUMO
Os critérios para análises de cromatografia em papel utilizando folhas de chanana e uma solução de éter de petróleo e álcool metílico na proporção de (50:1), assim como a separação dos pigmentos foliares, foram devidamente evidenciados, sendo possível marcar a posição das bandas coradas e identificá-las, compreendendo assim o estudo a escopo deste relatório. Os resultados mantiveram boa concordância literária.
1 INTRODUÇÃO
Entende-se por cromatografia, um processo físico de separação, no qual os componentes a serem separados distribuem-se em duas fases: fase estacionária e fase móvel. A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido disposto sobre um suporte sólido com grande área superficial. A fase móvel, que pode ser gasosa, líquida ou ainda um fluido supercrítico, passa sobre a fase estacionária, arrastando consigo os diversos componentes da mistura. (PERES, T. B., 2002). 
A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influênciado por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, bipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade. (VOGEL, 2002).
De maneira mais completa, a técnica baseia-se no princípio da adsorção seletiva (que não deve ser confundida com absorção), um tipo de adesão. A técnica foi descoberta em 1906 pelo botânico italiano naturalizado russo Mikahail Tswett, mas não foi largamente utilizada até os anos 30. Tswett separou pigmentos de plantas (clorofilas) adicionando um extrato de folhas verdes em éter de petróleo sobre uma coluna com carbonato de cálcio em pó em um tubo de vidro vertical. Enquanto a solução percolou através da coluna os componentes individuais da mistura migraram para baixo em taxas diferentes de velocidades e então a coluna apresentou-se marcada com gradientes horizontais de cores. A esse gradiente deu-se o nome de cromatograma. (STROBEL, 1973). 
A cromatografia funciona graças ao fato das moléculas possuírem uma propriedade chamada polaridade em comum e tenderem a se atrair mutuamente. Uma molécula polar é simplesmente aquela que possui uma região rica em elétrons e uma outra região que é pobre em elétrons. Estas regiões às vezes são representadas como sendo negativamente e positivamente carregadas, respectivamente. Moléculas polares são unidas por forças de atração entre cargas opostas de moléculas diferentes. Moléculas de água têm regiões ricas em elétrons nos átomos de oxigênio e regiões pobres em elétrons nos átomos de hidrogênio. Assim, as moléculas de água são polares e, por conseguinte organizam-se de maneira que a região de carga positiva de uma molécula é atraída pela região de carga negativa de outra. (STROBEL, 1973)
Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia em papel, cromatografia de camada fina, cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alta eficiência. A seleção do tipo de cromatografia adequada depende dos materiais a serem isolados e, frequentemente, diversos métodos cromatográficos podem ser usados sequencialmente para que seja obtido um composto na forma pura. (PERES, T. B., 2002).
A cromatografia em camada delgada consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorventes retidos sobre uma superfície plana. A separação pode ser convenientemente expressa como um fator de retardo ou fator de retenção (Rf) que é calculado dividindo a distância da amostra pela distância da frente do solvente. Essa técnica é indispensável para análise de substâncias orgânicas e organometálicas. Apresenta como vantagens: a fácil compreensão e execução, separações em breve espaço de tempo, versatilidade, grande reprodutibilidade e baixo custo.
A cromatografia em papel (CP) é uma das técnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realização, porém é a que apresenta as maiores restrições para sua utilização em termos analíticos. Neste tipo de cromatografia, uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente disposto verticalmente. O papel é composto por moléculas extremamente longas chamadas celulose. A celulose é um polímero polar com muitas regiões de altas e baixas densidades de elétrons (PERES, T. B., 2002).
O experimento que envolve análises de cromatografia em folhas provém à extração das clorofilas e carotenos presentes na mesma com o auxílio de solventes e posteriores empregos de técnicas cromatográficas para a visualização e separação desses componentes. A clorofila é facilmente identificada nas plantas, pois é a responsável pela coloração verde das mesmas. A clorofila a é a mais abundante no reino vegetal, sendo encontrada, juntamente com a clorofila b, numa proporção de 3:1, respectivamente. O mais conhecido dos carotenos é o β-caroteno, com ampla ocorrência no reino animal e vegetal, sendo normalmente encontrado nas plantas, junto com a clorofila. É o mais importante dos precursores da vitamina A e utilizado como corante na indústria alimentícia. (DEGANI, 1998).
Essa técnica permite ao aluno entrar em contato com vários conceitos envolvidos, desde a extração de compostos de plantas com o auxílio de solventes até a cromatografia do extrato obtido. Conceitos como solubilidade, polaridade, coeficiente de partição, adsorção e fator de retenção (Rf) podem ser abordados durante a execução do experimento, que também proporciona ao aluno o conhecimento de uma poderosa técnica de análise empregada cotidianamente em laboratórios de pesquisa e em algumas indústrias, como a farmacêutica. (DEGANI, 1998).
A planta utilizada no experimento foi a Chanana (Turnera ulmifolia), uma planta herbácea com folhas pubescentes e flores amarelas, pertencente à família Turneraceae, composta por ácido tânico, cafeína, damianina, óleo essencial, pepsina, princípios amargos, resina e tanino. Possui raiz axial, caule sub-lenhoso, folhas simples peciolada, filotaxia alterna espiralada, sendo a presença de glândulas de turnera a característica marcante do grupo. A prefloração é contorcida, sendo a flor actinomorfa, heteroclamídea, apresentando estipulas e o fruto é capsular seco. Apresenta o ovário súpero, unilocular e tricapelar, sendo a placenta parietal.  (LIMA, 2007). 
O presente relatório tem como objetivo entender como funciona e quais os princípios da cromatografia em camada delgada, analisando a ocorrência de diferentes bandas coradas originárias de um sistema de solvente e adsorvente em um papel de filtro com diferentes polaridades e assim, evidenciar características quantitativas e qualitativas de uma cromatografia. Ainda, estimar a partir de critérios e dados fornecidos o fator de retenção, após a separação dos pigmentos foliares.
	
2 PARTE EXPERIMENTAL
2.1 Materiais e Reagentes:
 Os seguintes materiais e reagentes, disponíveis no laboratório de ensino do Departamento de Química da UFPI, foram utilizados neste experimento:Folhas de chanana
Éter de petróleo
Álcool metílico
Papel absorvente
Régua
Almofariz
2 béquer de 150 mL
Bastão de vidro
Proveta de 100 mL
Cubeta
Papel de filtro
2.2 Procedimento
A realização da prática iniciou-se com a pesagem de cerca de 1g das folhas frescas de chanana. O próximo passo foi colocar as folhas para ferver em água destilada no béquer de 150 mL. Após isso, as folhas foram retiradas do béquer e o excesso de água das mesmas foi absorvido com papel absorvente.
O próximo passo realizado foi triturar as folhas em um almofariz, usando várias quantidades sucessivas de uma solução de éter de petróleo e álcool metílico a 50:1. A mistura foi realizada na proveta de 100 mL. Com isso, foram utilizados 20 mL da mistura para serem colocados no almofariz.
A última porção da mistura de éter de petróleo e álcool metílico foi juntada e a trituração foi continuada até restarem apenas alguns mililitros de solvente. Após isso, cerca de 1 mL deste extrato de pigmento foi decantado para dentro de um béquer de 150 mL. O próximo passo foi introduzir no béquer uma tira de papel de filtro ligeiramente mais estreita que o diâmetro do tubo. Para finalizar, o desenvolvimento de bandas coradas foi observado.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para se realizar a discussão da prática, é necessário, inicialmente, realizar uma análise detalhada do cromatograma, ressaltando a diferença na bandagem da coloração. A medição do sistema estudado foi realizada com o auxílio de uma régua e detectou-se que a distância percorrida pelo extrato no papel foi de 5,5 cm. Ao se observar, de baixo para cima, as cores neste cromatograma, percebe-se que a cor verde mostra a presença de clorofilas do tipo “b” e “a”, apesar das colorações não se apresentarem com nitidez. As linhas amarelas mais acima, demonstram a presença de xantofilas e carotenos, respectivamente, na mesma amostra.
Ao se analisar o cromatograma, constatou-se que: a Clorofila “b” percorreu cerca de 0,5 cm. A Clorofila “a” percorreu cerca de 0,9 cm. As Xantofilas percorreram cerca de 1,5 cm e os Carotenos, cerca de 5,5 cm. A partir dessas medições, pode-se calcular o fator de retenção de cada banda corada. O cálculo é feito através do quociente da medida da distância percorrida de cada substância pela medida da distância percorrida no total. Com isso, conclui-se que o Rf da Clorofila “b” foi de 0,09; o Rf da Clorofila “a” foi de 0,16; o Rf das Xantofilas foi de 0,27 e o Rf dos carotenos foi de 1. 
 A partir da análise do cromatograma pode-se explicar como se deu a distribuição das cores. Foi utilizada uma mistura de um solvente apolar que foi o Éter de petróleo e um solvente polar que foi o Metanol na proporção de 50:1, porém como o éter se apresenta em uma maior proporção na mistura, o solvente mostrará característica apolar. Com isso, chega-se a conclusão que a mistura arrastará consigo as substâncias que tiverem polaridade semelhante à sua, fato que ocorre com os carotenos, uma vez que estes apresentam longas cadeias carbônicas, sendo assim apolares. 
Já as clorofilas apresentam uma estrutura complexa, porém os heteroátomos presentes na sua estrutura fazem com que esse composto apresente característica polar, fator esse que explica o fato de que a mesma substância seja a menos arrastada pelo solvente. As xantofilas são carotenóides polares, funcionalizados com diversos grupos oxigenados como hidroxilas ou cetonas. Com isso, elas também são pouco arrastadas pelo solvente, pois as mesmas irão reagir pouco com o solvente que mostrará característica apolar.
Com a utilização da cromatografia em papel, foi difícil diferenciar as clorofilas “a” e “b”. As clorofilas e as xantofilas são polares e logo terão uma maior interação com o papel já que o mesmo é constituído de celulose (se classificando assim, como uma substância polar); assim apresentarão um fator de retenção considerável, ficando mais retidas no papel e sendo mais difícil de serem arrastadas em um solvente apolar que é o éter. Vale ressaltar que o metanol por ser uma substância polar ajudou na extração das clorofilas e das xantofilas, pois “semelhante” dissolve “semelhante”. O Caroteno apresentou o maior fator de retenção, já que o mesmo sofrerá influência maior do eluente apolar, fazendo assim com que ocupe a parte mais alta do papel, onde se encontra geralmente substâncias de caráter apolar como é o tal. (COLLINS, 1995)
Baseando-se na cromatografia em papel, onde o solvente era apolar, foi observado que as clorofilas “a” e “b” e as xantofilas apresentaram menor fator de retenção, pois foram mais difíceis de serem arrastadas já que apresentaram uma maior interação com o papel, evidenciando que as mesmas são substâncias polares. Os carotenos apresentaram maior Rf ocupando a parte superior do papel, caracterizando uma substância apolar e como tal terá pouca ou nenhuma interação com o papel. (COLLINS, 1995). Com isso, se chega à conclusão de que, nessa prática, quanto menor for a polaridade, maior será o fator de retenção.
4 CONCLUSÃO
Ao analisar o experimento, pôde-se comprovar que na sequência de análises em 1 mL de extrato de pigmento obtido a partir da trituração de folhas de chanana com uma solução de éter de petróleo e álcool metílico na proporção de (50:1), e usufruindo da utilização de um papel filtro, fora possível estimar uma interpretação experimental de um cromatograma, onde partindo-se deste, marcou-se as bandas coradas, e por dados fornecidos fizera-se a identificação dos compostos de clorofila a e b e os carotenos presentes. A partir disso, pode-se concluir a importância das forças intermoleculares na interação entre as moléculas para a separação de materiais.
REFERÊNCIAS
COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., Introdução a métodos cromatográficos. 6. ed, Campinas, Editora da UNICAMP, 1995.	
EWING, Galen W. Métodos instrumentais de análise química. Ed. da Universidade de São Paulo, 1982. 2v ilust.
MARAMBIO,O.G., Métodos Experimentales en Química Orgânica. Pizarro DC.1a Ed. UTEM, Mayo 2007. Editorial Universidade Tecnológica Metropolitana.
PERES, T. P.; Palestra, Noções básicas de cromatografia, Centro de pesquisas e desenvolvimento de proteção Ambiental – Instituto Biológico, v. 64, n° 2, p. 227 - 229, jul/ dez, São - Paulo SP, 2002.
STROBEL, Howard A.; Chemical Instrumentation: A Systematic Approach. 2a edição. Addison –Wesley Publishing company, 1973. 
VOGEL, A, I., Química orgânica: análise orgânica qualitativa, 3ª Ed., Rio de Janeiro, Ao Livro Técnico S.A., 1981. V. 1.
VOGEL; MENDHAM, J.; DENNEY, C. R.; BARNES, J. D.; THOMAS M. Análise Química Quantitativa. 6aedição, Editora S.A. Rio de Janeiro, 2002.
QUESTIONÁRIO
1-Pesquisar a estrutura das clorofilas e carotenos e justificar a cor observada para estas substâncias.
2-Qual é o estado físico da fase móvel e da fase estacionária na cromatografia em papel?
3-Qual é o mecanismo de separação da cromatografia em papel?
4-Como se define o Rf ( fator ou tempo de retenção)?
5-Com base na estrutura molecular, explicar a ordem de Rf observada para as clorofilas a, b e carotenos na cromatografia em papel.
Respostas: 
1- A clorofila a apresenta quatro anéis pirrólicos substituintes, sendo que um deles se encontra reduzido, e ainda um quinto anel não pirrólico. A clorofila b apresenta um grupo aldeído ao invés do grupo metila. Os carotenos possuem muitas ligações duplas conjugadas que o tornam capazes de absorver a luz e transmitir éxcitons.
Figura 1: R para a clorofila “a” é CH3 e para a clorofila “b” é CHO.
 Figura 2: Caroteno
A clorofila, que dá a cor verde característica da maioria dos vegetais, absorve muito bem a luz nas faixas do vermelho e do violeta, refletindo a luz verde.
Esses diversos tipos de clorofila diferem quanto à faixa do espectro da luz visível na qual cada uma delas capta luz com mais eficiência.
As clorofilas a e b possuem espectros de absorção de luz ligeiramente diferentes, como mostra o gráfico a seguir:
Podemos verificar,analisando o gráfico, que ambas as clorofilas possuem dois picos de absorção: um mais elevado, na faixa do violeta, e um outro menor, na faixa do vermelho.
O perfil de absorção de luz de uma substância é o seu espectro de absorção.
Os carotenóides são pigmentos acessórios. Eles absorvem luz em faixas um pouco diferentes das faixas das clorofilas. A presença desses pigmentos acessórios faz com que muitas folhas tenham cores diferentes do verde. Embora tenham clorofila, a presença desses outros pigmentos em grandes quantidades mascara a sua presença e deixa as folhas com outras cores: arroxeadas, alaranjadas, amarelas, etc. 
2- A cromatografia é uma técnica de partição. A mesma utiliza dois líquidos, ou misturas de líquidos, um atuando como fase móvel (eluente) e outro, suportado sobre papel, atuando como fase estacionária. Ocorre a retenção das substâncias devido às diferentes afinidades para com as fases estacionária e móvel. Utiliza-se papel normal ou papel de filtro como suporte da fase estacionária, ou seja, na cromatografia de papel há adsorção. Com isso, a fase móvel e a fase estacionária estão no estado líquido.
3- A cromatografia em papel é uma técnica de partição. Ela utiliza dois líquidos, ou misturas de líquidos, um atuando como fase móvel (eluente) e outro, suportado sobre papel, atuando como fase estacionária. Ocorre a retenção das substâncias devido às diferentes afinidades para com as fases estacionária e móvel. Utiliza-se papel normal ou papel de filtro que é o mais utilizado como suporte da fase estacionária.
A mistura é aplicada no papel e mergulhada na mistura das fases líquida e estacionária. A tira de papel de suporte é colocada em um cuba contendo o eluente. Esta fase móvel que é o solvente sobe por capilaridade e arrasta a substância pela qual tem mais afinidade, seguindo o princípio de que semelhante dissolve semelhante, de acordo com a polaridade, separando-a das substâncias com maior afinidade pela fase estacionária. Como a maioria das substâncias separadas são incolores, utiliza-se um revelador. As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, radioatividade, etc.
4- Fator de retenção é o quociente da medida da distância percorrida por cada substância pela medida da distância percorrida pela fase móvel.
5- O Caroteno possui o maior fator de retenção, ocupando a parte mais alta do papel, pois o mesmo é apolar, sofrendo menos interação com o papel e reagindo mais facilmente com o solvente apolar.
 As clorofilas e as xantofilas são polares. Com isso, apresentam menor fator de retenção, sendo mais difícil de serem arrastadas em um solvente apolar-éter-, já que apresentarão maior interação com o papel. Vale ressaltar que o metanol auxiliou na extração das clorofilas e das xantofilas, pois o metanol é polar, e semelhante dissolve semelhante.