Aplicações da Biologia Molecular no diagnóstico da Leishmaniose

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Aplicações da biologia 
molecular no diagnóstico e 
controle da Leishmaniose e 
identificação parasitária
Henk D. F. H. Schallig e Linda Oskam
“O objetivo deste artigo é analisar alguns 
dos mais recentes desenvolvimentos de 
ferramentas moleculares para o diagnóstico 
e controle da leishmaniose e identificação 
parasitária.”
Manifestações Clínicas 
A doença é causada pelos protozoários unicelulares do gênero 
Leishmania, e pode se apresentar de três formas:
1. Leishmaniose visceral
2. Leishmaniose cutânea
3. Leishmaniose muco-cutânea 
AmastigotasPromastigotas
http://www.ufrgs.br/para-site/siteantigo/Imagensatlas/Protozoa/Leishmania.htm
- Considerada pela OMS uma das doenças parasitárias mais 
importantes;
- População sob risco de contrair a doença: 350 milhões;
- Endêmica em pelo menos 88 países;
- Aproximadamente 57.000 mortes/ano.
Quadro Mundial da Leishmaniose
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Diagnóstico Laboratorial
- Demonstração microscópica de amastigotas de Leishmania em aspirados de 
tecido linfóide ou fígado, em esfregaços cutâneos ou em sangue periférico.
- Ainda não foi descoberto nenhum teste 100% sensível e específico;
- Obtenção de amostras é desconfortável para o paciente.
http://www.biomedicinabrasil.com/2011/07/teste-de-elisa.html https://pt.slideshare.net/labimuno/aglutinacao
 Anticorpo Antígeno Aglutinação
Novas técnicas: ELISA e DAT (Teste de Aglutinação Direta)
A Biologia Molecular no diagnóstico
● Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
● Amplificação Baseada na Sequência de Ácidos Nucleicos 
(NASBA) 
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
● Para o diagnóstico de LV:
 aspirados de medula óssea e de 
linfonodos: 82 % 
amostras de sangue: 70% a 90% . 
● Pacientes coinfectados com 
HIV/Leishmania.
● Pacientes com leishmaniose 
tegumentar ou mucocutânea (CL 
ou MCL): 86% e 71%
http://www.prolab.com.br/produtos/equipamentos-para-laboratorio/termociclador
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Amplificação baseada na sequência de ácidos nucleicos 
(NASBA)
- A NASBA detecta RNA num fundo de DNA e pode, assim, servir para 
medir parasitas viáveis; 
- Sua reação é isotérmica e rápida (90 min); 
- Possui maior especificidade e sensibilidade, 
- Pode ser utilizada para a quantificação exata de níveis de RNA.
Desenvolvimento de vacinas
Há vários fatores que têm dificultado o desenvolvimento: 
- O ciclo de vida complexo da Leishmania;
- A diversidade antigênica do parasita; 
- Modelos animais experimentais não são representativos para a 
doença em seres humanos; 
- Falta de apoio financeiro. 
Os Antígenos Recombinantes
- E. coli: Antígenos recombinantes de L. major, L. braziliensis e L. 
mexicana;
1. Proliferação de células do sangue humano através da exposição ao 
antígeno:
- Indução de resposta proliferativa e produção de interferon-gama; 
imunogenicidade 
2. Experiências de desafio em camundongos imunizados:
- Não houve proteção nos camundongos
- Os resultados não são conclusivos 
- Necessidade de mais estudos e experimentos 
Vacina de DNA
- Embora a captação e a expressão no DNA devam ser muito baixas, o 
antígeno é expresso em quantidade suficiente para induzir uma resposta 
imune potente e específica e conferir proteção contra novas infecções.
DNA 
PLASMIDIAL 
COM GENE
INJEÇÃO OU 
BOMBARDEAMENTO 
DE PARTÍCULAS
DNA NA 
CÉLULA
TRANSCRIÇÃO 
E TRADUÇÃO
https://www.genscript.com/recombinant-vaccine.html
- Estímulo lento e 
contínuo
Mecanismos de resistência à drogas
- A redução do composto pentavalente para um metal trivalente pode ocorrer 
no macrófago hospedeiro ou no parasita. 
- Níveis aumentados de tripanotiona (TSH), o principal tiol reduzido de células 
de Leishmania, são encontradas em células selecionadas para resistência ao 
antimônio trivalente. 
- Alto nível de resistência à drogas é mediado por um sistema de extrusão 
ativo, um sistema de transporte dependente de ATP em vesículas de 
membrana de L. tarentolae.
Identificação de espécies por Southern Blotting 
https://www.researchgate.net/figure/southern-blot-analysis-of-the-
genomic-organization-of-the-meta-1-locus-in-Leishmania_fig1_26
348231
htt ps://ang el.co/pro jects/69 617-sou thern-bl ot-of-le ishmania -donov ani-with- the-pxn 1-gene
https://www.biomedicinapadrao.com.br/201
0/06/southern-blot.html
Identificação de espécies por PCR
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-05962008000300002
Novos desenvolvimentos
● Projeto de Sequenciamento do Genoma
- LGN, 1994: sequenciamento genômico da linhagem de referência L. major 
Friedlin;
- O sequenciamento do genoma está bem encaminhado;
- Otimiza a busca por novas terapias e vacinas.
● Microarray (microarranjo)
- Permite a medida do nível de transcrição de cada gene no genoma; 
 
- Realiza a investigação de milhares de genes de maneira simultânea;
- Baseia-se no princípio de hibridização por complementaridade dos ácidos 
nucleicos. 
Isolamento e 
amplificação 
do RNAm
Conversão à 
DNAc por 
transcriptase 
reversa
Marcação de 
DNAc com o 
fluoróforo
Lavagens
Adição do 
DNAc ao chip 
de 
microarranjo
Ocorre 
hibridização
DNAc => Sonda
Detecção de 
Fluorescência
Análise 
Bioinformática
Conclusão
Há grande quantidade de métodos existentes e utilizados para testes sorológicos 
no diagnóstico da Leishmaniose;
Evidencia a dificuldade em fornecer um diagnóstico preciso com apenas uma 
técnica;
LACK induziu proteção em L. major;
LACK induziu resposta específica mas não proteção em L. donovani.