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CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia Disciplina de Microbiologia Geral 1 Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM AULA PRÁTICA 06 – COLORAÇÃO DE ESPOROS. A) Material necessário: - Lâmina para microscopia; - lápis para vidro; - alça de platina; - Água destilada; - cultura bacteriana; - óleo de imersão, papel absorvente; - suporte para lâminas; - lamparinas, bico de Bunsen e isqueiro; - Verde malaquita. - Safranina - Pote para descarte das lâminas B) Fundamentação teórica: O esporo ou endósporo bacteriano (Fig. 01) é uma célula de parede espessa formada no interior de algumas bactérias, durante o processo de esporulação pela invaginação de uma dupla camada de membrana celular, que se fecha para envolver um cromossoma e uma pequena quantidade de citoplasma para garantir a sobrevivência da espécie. É muito resistente ao calor, à dessecação e outros agentes químicos e físicos, sendo capaz de permanecer em estado latente por longos períodos e, em seguida, germinar, dando origem a uma nova célula vegetativa. Quando analisados por microscopia eletrônica, revelam uma estrutura complexa, sendo compostos por várias camadas. Mais externamente, há o exosporium, que corresponde a uma fina e delicada. Abaixo do exosporium encontramos a capa do esporo, composta por uma ou várias camadas protéicas, provavelmente responsável pela resistência aos agentes químicos. Mais internamente há o córtex, composto por camadas Fig. 01 – Célula contendo endósporo terminal. CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia Disciplina de Microbiologia Geral 2 Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM de peptideoglicano ligadas frouxamente entre si. Abaixo do córtex há a parede celular do esporo e o cerne, contendo a parede celular, membrana e outros componentes citoplasmáticos, metabolicamente inativos. Uma possível explicação para a enorme resistência dos esporos seria a presença de um composto denominado ácido dipicolínico, localizado no cerne, correspondendo a cerca de 15% do peso seco. O ácido dipicolínico associa-se a íons cálcio, originando o dipicolinato de cálcio, que provavelmente estabiliza os ácidos nucléicos contidos no cerne. Além disso, foram detectadas proteínas de ligação a ácidos nucléicos, que também auxiliam na estabilização destes. Além disso, o grau de desidratação do esporo também é um fator importante na sua resistência, bem como a presença de tantas camadas, tornando-o bastante impermeável. Os esporos são difíceis de serem corados, pois os corantes geralmente não atravessam a parede do esporo a não ser que seja utilizado o calor, como na coloração de Schaeffer-Fulton. C) Objetivos: Certas bactérias, como por exemplo, espécies de Bacillus e Clostridium, formam esporos (ou endósporos) que se desenvolvem em determinadas posições e tamanhos, que servem de características no trabalho de identificação. A prática visa o aprendizado acadêmico na realização da coloração de esporos e a compreensão do princípio dessa técnica. D) Procedimento: COLORAÇÃO DE ESPOROS. 1. Limpe a lâmina de vidro com papel embebido em álcool-éter para remoção completa de gordura e deixe-a secar bem. 2. Coloque sobre a lâmina uma gota de água destilada, no caso da cultura estar em meio sólido, ou uma gota da própria cultura em meio líquido, após flambar a alça de transferência. 3. Toque levemente a ponta da alça de transferência sobre o crescimento bacteriano numa placa de Petri. 4. Transfira o material da ponta da alça para a gota sobre a lâmina. 5. Faça um esfregaço espalhando a gota pela lâmina utilizando a própria alça com movimentos circulares. CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS Departamento de Microbiologia e Parasitologia Disciplina de Microbiologia Geral 3 Prof. Daniel Roulim Stainki UFSM 6. Deixe secar ao ar e identifique o lado da lâmina com o esfregaço. 7. Fixe as células na lâmina passando a superfície inferior (lado oposto do esfregaço) três vezes pela chama do bico de Bunsen. 8. Cubra o esfregaço com solução de verde malaquita 5% aquecendo até a emissão de vapores por 5 minutos. Não deixe o corante evaporar ou ferver; vá adicionando mais corante se necessário. 9. Lavar suavemente em água corrente. 10. Corar com safranina por 30 segundos a temperatura ambiente 11. Lave em água corrente, seque a lâmina a temperatura ambiente e observe ao microscópio com objetiva de imersão. Resultado: Observar os microrganismos que se apresentarão da seguinte maneira: - formas vegetativas: em vermelho; - endósporos (esporos): em verde; DESCRIÇÃO: