Roteiro Dosagem de proteínas pelo método do biureto (1)

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UFPel - CCQFA
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA – Curso de Agronomia
Dosagem de Proteínas Totais - Método do Biureto
A determinação das proteínas totais em amostras biológicas, tanto de origem vegetal como animal, é de fundamental relevância em várias áreas do conhecimento. Por exemplo: em análises clínicas favorece o diagnóstico de certas doenças correlacionadas com a alteração da quantidade de proteínas nos fluidos biológicos; em nutrição animal ressalta o aproveitamento racional de nutrientes e também, pela sua quantificação em leguminosas ou gramíneas, pode indicar quais são as mais aceitáveis e rentáveis para a alimentação animal; na área de química de proteínas faz parte de etapas na purificação de novas proteínas e enzimas.
Os íons cobre (Cu+2) em meio alcalino (Reagente de Biureto: solução diluída de sulfato de cobre, em meio alcalino) reagem com as ligações peptídicas das proteínas séricas formando cor púrpura, que tem absorbância máxima em 545 nm, proporcional à concentração das proteínas na amostra. 
A reação do biureto é devida a presença de ligações peptídicas, dando positiva para proteínas e peptídeos com (3) três ou mais resíduos de aminoácidos. A intensidade da cor é medida no espectrofotômetro e é proporcional a quantidade de proteínas presentes na solução. 
Figura 1- Reação do Biureto
Figura 2 – Reação do cobre com cadeias polipeptídicas. Observe que a reação detecta peptídeos contendo pelo menos três resíduos de aminoácidos.
A dosagem isolada da proteína total tem pouco valor, porque a alteração em uma das frações pode ser compensada por alteração oposta de outra fração, como ocorre nas doenças crônicas em que há diminuição de albumina com aumento de gamaglobulina. Ocorrência similar pode ser observada em respostas de fase aguda, tais como infecções ou traumas, ocasião em que muitas proteínas plasmáticas produzidas no fígado aumentam sua concentração, enquanto a albumina se reduz, mantendo a concentração protéica total praticamente inalterada. 
Curva de calibração:
Identificar oito tubos de ensaio de acordo com a tabela, colocando em cada um deles o que está descrito em cada coluna (itens 1, 2, 3 e 4).
Deixar em repouso por 10 minutos.
	
	Tubos
	
	Branco
	1
	2
	4
	6
	8
	10
	Amostra
	1. Padrão de proteínas 10 mg/ml (ml)
	-
	0,05
	0,1
	0,2
	0,3
	0,4
	0,5
	-
	2. Amostra (ml)
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	-
	0,25
	3. H2O (ml)
	0,5
	0,45
	0,4
	0,3
	0,2
	0,1
	-
	0,25
	4. Reagente de biureto (ml)
	2,5
	2,5
	2,5
	2,5
	2,5
	2,5
	2,5
	2,5
	
	10 minutos
	Concentração de proteína (mg/ml)
	0,0
	1,0
	2,0
	4,0
	6,0
	8,0
	10,0
	?
	
D.O. (fotocolorímetro)
	
	
	
	
	
	
	
	
Ler no fotocolorímetro as absorbâncias a 545 nm, zerando o aparelho com o branco (tubo B).
Descartar os resíduos no frasco K.
Atividades:
1. a)Traçar a curva de calibração colocando as várias concentrações de proteína do padrão no eixo das abcissas e as respectivas D.O. no eixo das ordenadas.
b) Determinar a concentração de proteína na amostra (através do gráfico).
Obs.: o valor da concentração da amostra determinada através do gráfico deve ser multiplicado por 4 para que a concentração final seja em 1 mL.
2. Em que consiste a Lei de Lambert-Beer?
3. O que significa medir a absorbância de uma amostra?
4. Qual a razão de usarmos um “branco” para leituras de absorbância no espectrofotômetro?
_1131967305/ole-[01, 03, 00, 04, 02, 04, 00, 2E]
_1104820715/ole-[01, 03, 00, 04, 02, 04, 00, 6A]