Relatorio 2 bioquímica

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO 
 CENTRO UNIVERSITÁRIO NORTE DO ESPÍRITO SANTO 
 
 
 
 
 
 
Relatório n°2: Reações de caracterização de aminoácidos e proteínas; métodos de 
dosagem de proteínas. 
Solubilidade e desnaturação de proteínas. Obtenção e determinação do PI da 
caseína. 
 
 
 
 
 
 
Nome do aluno (a): Skarllathy J. J. C. de Carvalho. 
Professor (a): Carolina Fortes Rigos. 
Código da Disciplina: DCN11431 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
09 de maio de 2014. 
2 
 
1. RESUMO 
O seguinte trabalho aborda o assunto de caracterização, quantificação, precipitação e 
determinação do ponto isoelétrico (pI) de proteínas, em que se utilizam vários métodos 
experimentais, são eles: Reação do Biureto, reação com nitrato de chumbo, reação 
xantoproteica, precipitação por adição de ácidos fortes, precipitação por adição de sais, 
precipitação por solventes orgânicos. Realizou-se a quantificação da caseína (proteína 
encontrada no leite) por técnica de espectroscopia e a determinou-se o seu pI através de 
precipitações realizadas com ácido acético. Observou-se que os vários métodos permite 
a identificação de aminoácidos na estrutura das proteínas, facilitando o entendimento e 
funcionamento de uma dada proteína. 
 
2. INTRODUÇÃO 
As proteínas são resíduos de aminoácidos, e elas se ligam covalentemente através de 
uma ligação denominada peptídica. Na formação dessa ligação uma molécula de água é 
removida (desidratação) (Figura 1). Oligopeptídeos são poucas quantidades de 
aminoácidos unidos, polipeptídeos são muitos aminoácidos unidos e as proteínas 
possuem muito mais quantidades de aminoácidos unidos, podendo chegar a milhares de 
resíduos1. 
 
Figura 1. Formação da ligação peptídica entre aminoácidos. (Fonte: site abrangente de química no Brasil)A 
 
Cada proteína possui uma quantidade de aminoácidos e uma sequência deles 
diferente, essa característica própria de cada proteína a faz possuir funções que são 
apenas delas, assim ela possui características específicas, então cada proteína possui sua 
função, carga elétrica, massa molar, solubilidade e afinidade por certos compostos, 
3 
 
essas características são próprias de cada uma. Isso se faz possível a determinação e 
caracterização das proteínas. 
Existem reações de coloração em que são determinadas as proteínas. Há aquelas 
reações específicas para aminoácidos encontrados na composição da proteína, como a 
reação xantoproteica que evidencia a presença de aminoácidos com um grupo fenil 
(Tirosina, triptofano e fenilalamina), já a reação com nitrato de chumbo identifica 
aminoácidos que possuem grupos sulfurados, como a cisteína. E há as reações de 
coloração que são mais gerais, e irão identificar os grupos que são comuns a todas as 
proteínas, como é o caso da reação do biureto, que identifica a ocorrência de ligações 
peptídicas. 
As proteínas contidas em uma mistura podem ser separadas uma das outras a partir 
da desnaturação. A desnaturação é a modificação da estrutura tridimensional nativa da 
proteína, com a consequente alteração de suas propriedades2. Fatores que fazem ocorrer 
a desnaturação são: mudanças de temperatura, mudanças de pH, adição de íons de 
metais pesados, adição de solventes orgânicos, e entre outros fatores. As substâncias 
utilizadas para a desnaturação se ligam a cadeia das proteínas e formam precipitados2. 
Algumas reações de precipitação que ocorrem são: Precipitação por ação do calor; 
precipitação por adição de ácidos fortes; precipitação por adição de sais de metais 
pesados; precipitação ação de solventes orgânicos. A concentração elevada de sais pode 
remover a água de hidratação das moléculas de proteínas, reduzindo sua solubilidade, 
este efeito é chamado de “salting-out”. Ocorre também que em concentração reduzida, 
os sais aumenta a solubilidade de muitas proteínas, este efeito é chamado de “salting 
in”, e está relacionado a uma diminuição das interações entre grupos carregados de 
moléculas da mesma ou de diferentes proteínas3. 
Para análise quantitativa de proteínas, usa-se o teste do Biureto, em que se verifica 
que quanto mais ligações peptídicas estiver na solução, mais forte será a reação do 
biureto, e a intensidade cor será mais forte também. Assim, o que tem maior intensidade 
na coloração possui maior concentração de proteínas e terá uma absorbância maior4. E 
então as medidas de absorbâncias são realizadas em espectrofotômetro e os devidos 
cálculos são realizados para se encontrar a concentração de proteínas em determinadas 
amostra. 
 
 
 
4 
 
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
 
 Materiais:  Reagentes: 
- Tubos de ensaio; 
- Bécker; 
- Pipetas volumétricas; 
- Pipetas graduadas; 
- Chapa de aquecimento; 
- Pipeta Pasteur; 
- Suporte universal; 
- Funil; 
- Papel filtro; 
- Erlenmeyers; 
- Bastão de vidro; 
- Termômetro; 
- Centrífuga; 
- Balança Analítica; 
- Fitas de medição de pH. 
- Ácido nítrico concentrado; 
- Ácido clorídrico concentrado; 
- Solução de ovoalbumina (clara do ovo); 
- Solução de gelatina 2%; 
- Nitrato de Chumbo; 
- Sulfato de amônio; 
- Água destilada; 
- Acetona; 
- Solução de caseína (leite); 
- Ácido acético; 
- Etanol; 
- Éter etílico; 
- Hidróxido de sódio. 
 
 
 
3.1. Procedimento: Reações de determinação qualitativa de proteínas: 
 
Métodos: 
Preparou-se três soluções, uma solução a 10% de ovoalbumina a partir da clara de 
ovo, uma de gelatina a 2% e a solução de caseína extraída do leite. 
 
3.1.1. Reação do Biureto: 
Enumerou-se três tubos de ensaio. Ao primeiro, adicionou-se 2 mL de solução de 
ovoalbumina a 10%; ao segundo, 2 mL de solução de gelatina a 2% e ao terceiro 2 mL 
de solução de glicina a 1%. Acrescentou-se a cada tubo 2 mL de NaOH 2 mol.L-1. 
Agitou-se e adicionou-se a cada tubo o reagente de biureto, gota a gota, até o 
aparecimento de coloração violeta. Observou-se. 
 
 
5 
 
3.1.2. Reação com o Nitrato de Chumbo: 
Numerou-se três tubos de ensaio. Ao primeiro, adicionou-se 2 mL da solução de 
gelatina, ao segundo uma pequena mecha de cabelo e ao terceiro 2 mL da solução de 
ovoalbumina a 10%. A cada tubo adicionou-se 2 mL de NaOH 6 mol.L-1 e 3 gotas de 
nitrato de chumbo 1%. Ferveram-se as soluções dos tubos em banho-maria, por 2 a 3 
minutos. Observou-se. 
 
3.1.3. Reação Xantoproteíca: 
Pipetou-se 1 mL de ovoalbumina 10% para um tubo de ensaio. Na capela, adicionou-
se 10 gotas de ácido nítrico concentrado, posteriormente, em banho-maria esquentou-se 
a solução até a fervura. Acrescentou-se 4 mL de hidróxido de sódio 2 mol.L-1. 
Observou-se. 
 
3.2. Procedimento: Determinação quantitativa do teor de caseína no leite: 
 
Métodos: 
Em um tubo de ensaio, transferiu-se com o auxílio de uma pipeta volumétrica, 1 mL 
de leite, completou-se o volume com 9 mL de água destilada. Agitou-se bem. 
Enumerou-se de 0 a 6, sete tubos de ensaio, adicionaram-se os reagentes nos tubos, 
seguindo a ordem da tabela 1. Após as adições, agitou-se os tubos e os deixou em 
repouso por 30 minutos. Observou-se. No espectrofotômetro fez-se a leitura de 
absorbância em 540 nm, de cada solução. Anotou-se os dados. 
 
Tabela 1. Volumes necessários para a preparação de soluções utilizada na quantificação de caseína na amostra. 
Tubo Água destilada (mL) Caseína 5mg/L (mL) Reativo de Biureto (mL) 
0 4,0 0,0 5,0 
1 3,5 0,5 5,0 
2 3,0 1,0 5,0 
3 2,5 1,5 5,0 
4 2,0 2,0 5,0 
5 1,5 2,5 5,0 
6 1 mL do leite diluído (1:10) 5,0 
 
 
6 
 
3.3. Procedimento: Reações de precipitação de proteínas: 
 
Métodos: 
3.3.1. Efeito de ácidos fortes:Separou-se dois tubos de ensaios, no primeiro adicionou-se 40 gotas de HNO3 
concentrado e no segundo 40 gotas de HCl concentrado, fez-se a utilização da capela 
para esses procedimentos. Adicionou-se cuidadosamente, 2 mL de solução de 
ovoalbumina. Observou-se. 
 
3.3.2. Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas: 
Em um tubo de Falcon, adicionou-se 2 mL de solução de ovoalbumina e 2 mL de 
solução saturada de (NH4)2SO4. Centrifugou-se a suspensão, separou-se o sobrenadante 
do precipitado. Ao precipitado, adicionou-se 2 mL de água destilada. Ao sobrenadante, 
adicionou-se (NH4)2SO4 sólido até a saturação completa. Observou-se. 
 
3.3.3. Precipitação por acetona: 
Preparou-se 4 tubos de ensaio, de acordo com a tabela a seguir: 
 
Tabela 2. Volumes necessários para a preparação de soluções para análise de precipitação. 
Tubo 1 2 3 4 
Acetona (mL) 1,0 2,0 3 ,0 4,0 
H2O (mL) 3,0 2,0 1,0 ___ 
Solução de Ovoalbumina 10 % (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 
 
Agitou-se as soluções e observou-se o que ocorreu em cada tubo. 
 
3.4. Procedimento: Determinação do ponto isoelétrico de uma proteína: 
 
Métodos: 
3.4.1. Extração da caseína: 
Aqueceu-se 150 mL de água a 38 ºC. Adicionou-se na água 50 mL de leite e 
misturou-se bem. De gota a gota, juntou-se a essa solução, a solução de ácido acético 2 
mol.L-1, até o aparecimento de um precipitado abundante. Deixou-se o precipitado 
sedimentar durante 10 minutos e decantar o sobrenadante. Lavou-se o precipitado, e 
7 
 
nele adicionou-se 20 mL de etanol e misturou-se bem. Centrifugou-se a 3000 rpm por 
10 minutos e desprezou-se o sobrenadante. Ao precipitado, adicionou-se 5 mL de éter 
etílico e misturou-se. Separou-se o sólido (caseína) por filtração e o deixou secando por 
alguns minutos em papel filtro. 
 
3.4.2. Preparação de uma solução de caseína: 
Pesou-se em um erlenmeyer aproximadamente 0,1 grama da caseína extraída do 
leite. Adicionou-se 5 mL de água destilada e ressuspendeu a caseína. Acrescentou-se 
2,5 mL de hidróxido de sódio e agitou-se lentamente, evitando a formação de espuma. 
Adicionou-se 2,5 mL de ácido acético 1 mol.L-1 e agitou-se lentamente. Utilizando-se 
fitas de pH, ajustou-se o pH para valores em torno de 7. 
 
3.4.3. Determinação do ponto isoelétrico da caseína: 
Numerou-se nove tubos de ensaio e distribui-se os reagentes conforme a tabela 3. 
Adicionou-se em cada tubo, 0,5 mL da solução de caseína e agitou-se lentamente, 
evitando a formação de espuma. Logo após a agitação, verificou-se a turbidez das 
soluções e calculou-se o pH de todas as soluções. 
 
Tabela 3. Volume necessários para a preparação das soluções na determinação do pI. 
Tubo H2O destilada (mL) CH3COOH 0,01M CH3COOH 0,1M CH3COOH 1M (mL) CH3COOH 2M 
1 4,0 0,5mL 
2 4,4 0,1 mL 
3 4,3 0,2 mL 
4 3,7 0,8 mL 
5 3,5 1,0 
6 2,5 2,0 
7 0,5 3,0 
8 3,9 0,8 mL 
9 3,7 1,0 mL 
 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
4.1. Reações de determinação qualitativa de proteínas: 
 
4.1.1. Reação do Biureto: 
8 
 
Na reação do biureto o procedimento e as observações 
feitas estão descritas na tabela 4. Encontrou-se o reagente 
de Biureto já preparado, o biureto é preparado com os 
solutos CuSO4, tártaro duplo de sódio e potássio 
(KNaC4H4O6·4H2O) e NaOH, estes são dissolvidos em 
água. 
O produto de reação do biureto com as proteínas 
apresenta coloração violeta, dando positiva para proteínas 
e peptídeos com dois ou mais resíduos de aminoácidos, 
ele identifica o grupo CO–NH da ligação2. Esse fenômeno 
deve-se à formação de um complexo entre o íon Cu2+, 
presente no reativo, e os átomos de nitrogênio presentes na molécula, esse complexo 
formado é apresentado na figura 2. 
 
Tabela 4. Resultados obtidos da Reação de Biureto. 
 
 
 
 
 
De acordo com os resultados obtidos nota-se que os testes foram positivos para as 
soluções de ovoalbumina e gelatina. A coloração inicial das três soluções eram 
transparentes, a glicina se tornou azul devido a adição do biureto que tem a coloração 
azul, e a solução de glicina adquiriu a coloração do biureto. Na ovoalbumina encontra-
se a albumina, e na gelatina encontra-se o colágeno. Na glicina não se encontra 
nenhuma proteína, e sim o aminoácido glicina (o mais simples), com isso, o teste deu 
negativo. Na figura 3, tem-se as soluções de ovoalbumina, gelatina e glicina com as 
gotas de biureto já adicionadas. 
Tubos Solução (2mL) NaOH e mol.L-1 Gotas de Biureto (coloração) 
1 Ovoalbumina 10% 2 mL Violeta translúcido 
2 Gelatina 2% 2 mL Violeta translúcido 
3 Glicina 1% 2 mL Azul translúcido 
Figura 2. Reação do íon cobre 
com os grupos polarizados 
presente nos resíduos de 
aminoácidos. (Fonte: Site da 
Biblioteca Digital da UFMA)2 
9 
 
 
Figura 3. Reações do biureto com soluções de ovoalbumina, gelatina e glicina. 
 
O aquecimento da uréia cristalina (𝐶𝑂2(𝑁𝐻3)2) leva à formação de biureto, essa 
formação se dá de acordo com a seguinte equação química5: 
2𝐶𝑂2(𝑁𝐻3)2
𝑐𝑎𝑙𝑜𝑟
→ 𝑁𝐻2 − 𝐶𝑂 − 𝑁𝐻 − 𝐶𝑂 −𝑁𝐻2 +𝑁𝐻3 
Como pode-se perceber no biureto há dois grupos CO–NH, e como na reação da 
solução de sulfato de cobre com tártaro duplo de potássio em meio alcalino é 
identificado dois grupos ou mais de CO–NH (contida em ligação peptídica), essa reação 
recebe no nome do reagente de biureto. 
 
4.1.2. Reação com o Nitrato de Chumbo: 
O teste com Nitrato de chumbo dá positivo (formação de precipitado castanho ou 
preto) para solução que contêm aminoácidos sulfurados como a cisteína. 
Preparou-se os três tubos de ensaio, contendo neles: 1. Gelatina; 2. Fios de cabelo; 3. 
Ovoalbumina. Posteriormente adicionou-se NaOH, para a alcalinização do meio, e 3 
gotas de nitrato de chumbo (Pb(NO3)), e ferveu-se as soluções. Nessa etapa observou-se 
a mudança de coloração das soluções, a primeira ficou laranja-amarronzada translúcida, 
na segunda formou-se precipitado preto, e na terceira também (Figura 5). 
O enxofre das proteínas em meio alcalino e a quente liberam enxofre na forma de 
sulfeto de sódio (Na2S), este reage com o nitrato de chumbo que esta na solução, 
formando o PbS, o qual se apresenta como um precipitado escuro, indicando assim que 
na solução contém enxofre. 
Verifica-se então que o teste deu positivo para os fios de cabelo e a ovoalbumina. 
Nos fios de cabelo há a proteína Queratina, nela contém a cisteína, cuja estrutura possui 
10 
 
enxofre (Figura 4). Na ovoalbumina, encontra-se a albumina que também possui o 
aminoácido cisteína. Por isso, ambos deram positivo no teste. 
 
Figura 4. Estrutura da cisteína (esquerda), ligação de dissulfeto no fio de cabelo devido a presença da cisteína. 
(Fonte: site Mundo Educação)B 
 
 
Figura 5. Reações com Nitrato de Chumbo. Soluções contendo: Gelatina, Fio de cabelo e ovoalbumina. 
 
4.1.3. Reação Xantoproteíca: 
Essa reação evidencia a presença de aminoácidos que contem grupamento fenil 
(tirosina, triptofano e fenilalanina) na proteína, ela é positiva quando se torna 
amarelada. 
Na solução de 1 mL de ovoalbumina adicionou-se ácido nítrico concentrado e 
ferveu-se, a solução de incolor ficou amarelo leitoso. Após a adição de NaOH ela 
adquiriu coloração laranja translúcida (Figura 7). 
O ácido nítrico quando reage com o grupo fenil da tirosina, do triptofano ou da 
fenilalanina, forma nitroderivados que são coloridos em meio acalino2 (Figura 6). Assim 
11 
 
evidencia-se que na proteína albumina há a presença dos aminoácidos contendo 
grupamento fenil. 
 
Figura 6. Reação do benzeno com ácido nítrico, formando o nitrobenzeno. (Fonte: Site da biblioteca digital daUFMA)2 
 
Figura 7. Solução de ovoalbumina depois do aquecimento (esquerda) e depois da adição de NaOH (direita). 
 
4.2. Reações de determinação quantitativa do teor de caseína no leite: 
Fez-se a diluição 1:10 do leite e preparou-se as 7 soluções como descrita na tabela. 
Observou-se a coloração púrpura das soluções (Figura 8), o que indica a presença de 
proteínas, isso causado pela presença do reativo de biureto. Após o repouso fez-se a 
leitura da absorbância em 540 nm no espectrofotômetro, e os valores obtidos foram os 
seguintes: 
 
Tabela 5. Absorbâncias medidas nas soluções. 
Tubo Água destilada 
(mL) 
Caseína 5mg/mL 
(mL) 
Reativo de Biureto 
(mL) 
Absorbância (540 
nm) 
0 4,0 0,0 5,0 0,000 
1 3,5 0,5 5,0 0,336 
2 3,0 1,0 5,0 0,618 
3 2,5 1,5 5,0 0,883 
4 2,0 2,0 5,0 1,127 
5 1,5 2,5 5,0 1,352 
6 1 mL do leite diluído (1:10) 5,0 0,192 
 
12 
 
A partir desses dados, calculou-se a concentração de caseína contida nos tubos de 0 a 
5. Para o cálculo das concentrações utilizou-se a seguinte fórmula: 
𝐶1 ∗ 𝑉1 = 𝐶2 ∗ 𝑉2 
Apresenta-se na tabela a seguir os valores da concentração de caseína calculados 
para cada solução: 
 
Tabela 6. Valores da concentração de caseína em cada tubo e suas respectivas absorbâncias. 
Tubo Concentração de caseína (mg/L) Absorbância 
0 0,0 0,000 
1 0,625 0,336 
2 1,250 0,618 
3 1,875 0,883 
4 2,5 1,127 
5 3,125 1,352 
 
Calculou-se a equação da reta a partir desses valores, sendo: 
𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝑥 
y= absorbância; a= intercepto; b= inclinação; x= concentração. 
Encontrou-se os seguintes valores: 
Intercepto= 0,04805 ; Inclinação= 0,4296. 
Sendo assim, tem-se que: 
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0,04805 + 0,4296 ∗ 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 
O gráfico que se obteve foi o seguinte: 
 
 Gráfico 1. Gráfico obtido da absorbância versus a concentração das soluções padrões. 
y = 0,4296x + 0,048
R² = 0,9951
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 1 2 3 4
A
b
so
rb
ân
ci
a
Concentração (mg/mL)
Abs
Linear (Abs)
13 
 
A partir da equação obteve-se a concentração de caseína no leite: 
0,192 = 0,04805 + 0,4296 ∗ 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 = 0,335
𝑚𝑔
𝑚𝐿
 
A amostra de foi diluída em 1:10, com isso essa a concentração da caseína no leite é 
de 3,35 mg/mL. Em 100 mL de leite a quantidade de será de 335 mg, então sua 
concentração é de 335 mg/100mL. 
Com a acidificação do leite, ocorre a coagulação da caseína. O ponto isoeletrônico do 
leite é em pH igual a 4,6, nesse ponto há uma neutralização completa das cargas 
negativas, as micelas de caseína floculam e aprisionam o líquido dispersante (soro), e 
então forma-se, assim, um gel. Esse fenômeno é chamado de “coalhada ácida”6. 
 
 
Figura 8. As sete soluções de caseína com reagente de biureto. 
 
4.3. Reações de precipitação de proteínas: 
 
4.3.1. Efeito de ácidos fortes: 
Preparou-se os dois tubos de ensaio, um contendo o ácido nítrico concentrado e o 
outro contendo ácido clorídrico concentrado. Ao adicionar cuidadosamente a solução de 
ovoalbumina notou-se a formação de uma linha branca (precipitado) no limite de 
separação entre os dois líquidos (Figura 9). 
No meio ácido a proteína se encontra com pH abaixo do seu ponto isoelétrico, e as 
bases (Cl- e NO3
-) provenientes dos ácidos fortes (HCl e HNO3), que são carregados 
negativamente combinam-se com as partes positivas das proteínas, formando 
complexos insolúveis, que precipitam na solução2. Ocorrendo assim, a desnaturação da 
14 
 
albumina, o pH afetará as interações da proteína e causará uma mudança em sua 
conformação, o que acarretará em modificações de suas propriedades físico-químicas, 
como a solubilidade: uma proteína desnaturada é insolúvel em água e precipita em 
solução7. A precipitação ocorre primeiramente no limite, pois a ovoalbumina foi 
adicionada lentamente, e a parte que precipitou primeiro é a parte que esta inicialmente 
em contato mais direto com o ácido, depois de um tempo pode-se observar a 
precipitação completa. 
 
Figura 9. Soluções ácidas de ovoalbumina. 
 
4.3.2. Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas: 
Adicionou-se a solução de (NH4)2SO4 em 2 mL de solução de ovoalbumina e 
formou-se um precipitado branco. A formação desse precipitado foi devido ao aumento 
da força iônica na solução, provocada pela adição do sal. A medida que a concentração 
do sal é aumentada, a solubilidade da proteína se reduz gradativamente, esse efeito é 
conhecido como precipitação por salificação ou “salting-out”. a concentração elevada 
de sais removem a água de hidratação das moléculas de proteína, reduzindo, sua 
solubilidade, também ocorre a competição entre os íons salinos adicionados e a 
proteína, diminuindo assim, a capacidade de solvatação do solvente aquoso. 
O precipitado formado foi centrifugado e o sobrenadante foi separado do precipitado, 
ao precipitado (proteína), adicionou-se água destilada, e a proteína voltou a se 
solubilizar. Nessa etapa o sal foi retirado e a proteína voltou a se solubilizar no meio 
aquoso. 
Ao sobrenadante (com concentração de sal) adicionou-se sulfato de amônio sólido 
até a saturação completa. Como a solução já estava com concentração iônica 
proveniente da solução de (NH4)2SO4, pouca quantidade de sulfato de amônio sólido já 
foi o suficiente para deixar a solução supersaturada. 
15 
 
 
4.3.3. Precipitação por acetona: 
Preparou-se as 4 soluções como indicado na tabela 2. Notou-se que ocorreu maior 
índice de precipitação na solução em que a concentração de acetona é maior (Figura 
10). 
Solventes orgânicos como o etanol, éter etílico e acetona fazem com que as proteínas 
precipitem, isso ocorre pelo fato delas apresentarem uma constante dielétrica inferior à 
da água. A água possui uma constante dielétrica alta, e a força de atração entre as 
moléculas protéicas contendo radicais com cargas opostas é baixa, predominando a 
interação proteína-água ao invés da interação proteína-proteína. Então, com a adição 
dos solventes orgânicos, ocorre a inversão dessa situação, fazendo com que ocorra a 
agregação e a precipitação das moléculas protéicas. Como a concentração do solvente 
orgânico é maior na solução 4, então será onde ocorrerá uma maior precipitação de 
proteínas, a concentração será suficiente para fazer com que maior quantidades de 
proteínas inverta a interação para proteína-proteína. 
 
 𝐴𝑢𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑝𝑖𝑡𝑎çã𝑜 𝑑𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 
⇒ 
 
Figura 10. Soluções de proteínas em solventes orgânicos. 
 
4.4. Determinação do ponto isoelétrico de uma proteína: 
 
4.4.1. Extração da caseína: 
Extraiu-se a caseína do leite como descrito no procedimento experimental 3.4.1. A 
proteína se coagula devido a mudança de pH provocada quando é adicionada a solução 
de ácido acético, então ocorre a decantação desse precipitado. Lavou-se o precipitado e 
16 
 
nele adicionou-se etanol, centrifugou-se e depois adicionou-se éter etílico para então 
fazer a filtração da caseína. Fez-se necessária a adição desses dois solventes orgânicos 
para a melhor separação da caseína do meio aquoso, pois esses solventes faz com que 
ocorra a agregação e a precipitação das proteínas, como explicado em 4.3.3. 
 
4.4.2. Preparação de uma solução de caseína: 
Preparou-se a solução de caseína a partir de 0,1 g da caseína extraída do leite no 
procedimento 3.4.1. A preparou seguindo as instruções do procedimento 3.4.2. 
 
4.4.3. Determinação do ponto isoelétrico da caseína: 
Preparou-se as 9 soluções (Figura 11) conforme as descrições da tabela3. Calculou-
se os valores de pH de cada solução: 
𝐶𝐻4𝐶𝑂𝑂𝐻 ↔ 𝐶𝐻3𝑂𝑂
− + 𝐻+ 𝐾𝑎 = 1,75 ∗ 10
7 
De acordo com a constante de dissociação do ácido calculou-se os valores de [H+] e 
de pH. Primeiro calculou-se a concentração de ácido acético na solução através da 
fórmula: 
𝐶1 ∗ 𝑉1 = 𝐶2 ∗ 𝑉2 
E calculou-se a concentração de H+ e o pH através das seguintes fórmulas: 
[𝐻+] = √𝐶𝐶𝐻4𝐶𝑂𝑂𝐻 ∗ 𝐾𝑎
2
 
𝑝𝐻 = − log𝐻+ 
A tabela a seguir mostra os valores obtidos a partir dos cálculos: 
 
Tabela 7. Apresenta o volume da solução, a concentração de ácido acético e H+ calculadas e o pH da solução. 
Tubo Volume (mL) [𝐶𝐻4𝐶𝑂𝑂𝐻] (mol/L) [𝐻
+] (mol/L) pH 
1 4,5 1,11 * 10-3 1,39 * 10-4 3,85 
2 4,5 2,22 * 10-3 1,97 * 10-4 3,70 
3 4,5 4,44 * 10-3 2,78 * 10-4 3,55 
4 4,5 0,0178 5,57 * 10-4 3,25 
5 4,5 0,222 1,97 * 10-3 2,70 
6 4,5 0,444 2,79 * 10-3 2,55 
7 3,5 0,857 3,87 * 10-3 2,41 
8 4,7 0,340 2,44 * 10-3 2,61 
17 
 
9 4,7 0,425 2,73 * 10-3 2,56 
 
 
Figura 11. Soluções de ácido acético e caseína. 
 
De acordo com as soluções notou-se que a solução que continha maior turbidez era a 
solução 4, e as de menores as 3 primeiras soluções. Em relação à turbidez os resultados 
obtidos foram os seguintes: 
 
Tabela 8. Relação das soluções e sua respectiva turbidez. 
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 
Turbidez X X X XXXX XX XX XX XXX XX 
Crescimento da turbidez 
 
 
No ponto isoelétrico (pI), a caseína apresenta carga elétrica líquida igual a zero, pois 
nesse ponto (valor de pH) as cargas elétricas se igualam e se anulam. Então é nesse 
ponto em que a proteína apresentará menor solubilidade em meio aquoso, e a medida 
que seu pH ou vai aumentando ou vai diminuindo, essa solubilidade aumenta. Quanto 
mais o pH se afasta do seu pI, mais a proteína adquirirá carga. Se o pH se tornar cada 
vez mais baixo, sua carga total será mais positiva, se tornar mais alto, sua carga total 
será mais negativa. 
Analisando-se dessa forma, pode-se perceber que a solução 4 foi a que mais 
precipitou, ou seja, a menos solúvel, então, o ponto isoelétrico é o valor do pH dessa 
solução, que é igual a 3,25. Sabe-se, no entanto, que o ponto isoelétrico da caseína é em 
torno de 4,7, e não em torno de 3,258. Dessa forma algum pode-se ter ocorrido algum 
erro na extração da caseína, ou alguma contaminação, visto que inicialmente a solução 
X, XX, XXX, XXXX 
 
18 
 
da caseína que foi extraída estava apresentando um pouco de turbidez, sendo que 
deveria estar límpida. 
 
5. CONCLUSÃO 
A partir dos experimentos realizados conclui-se que a especificidade de cada proteína 
contribui para a sua caracterização e determinação, e essa especificidade a torna tão 
importante e essencial para a sobrevivência dos organismos vivos. Conclui-se também 
que as reações que ocorrem a precipitação, fazem modificar a estrutura da proteína, 
causando a desnaturação, diferentes das reações colorimétricas e o fenômeno de 
“salting-up”, em que neste último ocorre a precipitação, mas não a desnaturação da 
proteína, pois como pode ser visto a proteína retorna a solubilidade quando a 
concentração iônica na água diminui. 
 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
[A] Site Abrangente de Química no Brasil: 
Disponível em: http://allchemy.iq.usp.br/agregando/ABQ/oqsp07red/ 
Acessado no dia 15/05/2014. 
 
[B] Site do Mundo Educação: 
Disponível em: http://www.mundoeducacao.com/quimica/cabelos-ondulados-com-
permanente.htm 
Acessado no dia 15/05/2014. 
 
[1] Cox, M. M; Nelson, L. D.; Lehninger Princípios de Bioquímica; 5ª Edição-São 
Paulo: SARVIER, 2011; pg. 82-85. 
 
[2] Site da Biblioteca Digital da UFMA (Universidade Federal do Maranhão): 
Disponível em: 
http://www.repositorio.ufma.br:8080/jspui/bitstream/1/445/1/Livro%20de%20Bioquimi
ca%20Pratica.pdf 
Acessado no dia 15/05/2014. 
 
19 
 
[3] Roteiro de experimento da aula de Instrumentação para o Ensino de Química 
Biológica: Reações de caracterização de aminoácidos e proteínas; métodos de dosagem 
de proteínas. 
 
[4] Site Universidade dos Açores: 
Disponível em: http://www.angra.uac.pt/agro-alimentar/STA/P2.html 
Acessado no dia 16/05/2014. 
 
[5] Site do Centro de Tecnologia Mineral – O nitrogênio na agricultura brasileira: 
Disponível em: http://www.cetem.gov.br/publicacao/series_sed/sed-70.pdf 
Acessado no dia 15/05/2014. 
 
[6] Site do Departamento de Engenharia Química e Engenharia de Alimentos da UFSC 
(Universidade Federal de Santa Catarina): 
Disponível em: 
http://www.enq.ufsc.br/disci/eqa5216/material_didatico/componentes_do_leite.htm 
Acessado no dia 15/05/2014. 
 
[7] Site da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul – Reações de 
Precipitação de Proteínas; Professores Maurício Bogo e Luiz A. Basso. 
Disponível em: 
https://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=3&cad=rja&
uact=8&ved=0CEEQFjAC&url=http%3A%2F%2Fwww.pucrs.br%2Ffabio%2Fbioqui
mica1%2Findex_arquivos%2FMatSup_bioquimica%2Frea_prec_prot.doc&ei=SQF1U_
u7G8PIsATPrYGIDQ&usg=AFQjCNHBbUjeEmAMtKOZ3ikQdJIyhThljg&sig2=UT
YumZkgRW7gzGRejVYf6w&bvm=bv.66917471,bs.1,d.cWc 
Acessado no dia 15/05/2014. 
 
[8] Site da UFRGS: 
Disponivel em: 
http://www.ufrgs.br/gcoeb/PontoIsoleletricoDaCaseina/PontoIsoleletricoDaCaseina.swf 
Acessado no dia 16/05/2014.