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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CENTRO UNIVERSITÁRIO NORTE DO ESPÍRITO SANTO Relatório n°6: Atividade catalítica da amilase salivar: efeito da temperatura e do pH. Nome do aluno (a): Skarllathy J. J. C. de Carvalho. Professor (a): Carolina Fortes Rigos. Código da Disciplina: DCN11431 18 de julho de 2014. 1. RESUMO O seguinte procedimento experimental traz como assunto a atividade catalítica da enzima amilase salivar. Essa enzima destina-se a realizar a catálise da hidrólise das ligações α-1-4glicosídicas dos polissacarídeos. Primeiramente realizou-se a preparação de uma solução tampão de fosfato, essas soluções são importantes para manter o pH em uma faixa boa para se trabalhar com certas reações. Realizou-se a hidrólise química e enzimática do amido, avaliando-se o efeito da mudança de temperatura e pH, onde observou-se que, com o aumento da temperatura, a hidrolise era mais eficaz e, a enzima possui uma alta atividade em um determinado pH, chamado de pH ótimo. 2. INTRODUÇÃO As enzimas são catalisadores biológicos extremamente eficientes, que aceleram em média 100 a 1000 vezes a velocidade da reação, transformando de 100 a 1000 moléculas de substrato em produto de reação por minuto. Praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas 4 . Elas são muito especificas, assim, uma enzima catalisa somente um tipo de reação. A maioria das enzimas apresentam melhor desempenho em temperaturas que variam de 30 °C a 70 °C e com valores de pH próximos a neutralidade. Nas reações enzimáticas, a velocidade aumenta com a temperatura, até atingir uma velocidade máxima, a partir da qual começa a decrescer, com isso, as enzimas possuem uma temperatura ótima. Cada reação possui também um pH ótimo, valores baixos ou altos de pH podem causar desnaturação proteica considerável e consequente inativação enzimática 7 . As amilases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações α-1-4glicosídicas de polissacarídeos, como o amido, glicogênio e outros α-glucanos, liberando primeiramente, oligossacarídeos de 6-7 unidades de glicose e, posteriormente açucares redutores 7 . O amido não é absorvido no intestino, mas as alfa-amilases hidrolisam as cadeias de amido em moléculas menores, mas quebrem apenas as ligações α-1- 4glicosídicas, com isso fica apenas as ligações α-1-6glicosídicas, resultando em uma estrutura bastante ramificada chamada dextrina limite, que é quebrada apenas no intestino pela enzima amilo-1-6-glicosidase. 3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Materiais: - Erlenmeyer; - Bécker; - Pipeta volumétrica; - pHmêtro; - Balão volumétrico; - Banho de gelo; - Chapa de aquecimento; - Balança analítica. Reagentes: - Água destilada; - Solução de amido a 1%; - Solução de lugol; - Solução de HCl 1:2; - Solução de saliva; - Solução de NaOH; - Fosfato de Sódio Mono hidratado. 3.1. Procedimento: Preparação de solução tampão de Fosfato de Sódio: Métodos: Calculou-se a massa necessária para preparação da solução de 25 mL de fosfato de sódio 0,1 mol/L, através da seguinte fórmula: Sendo: m= Massa; MM= Massa molar do Fosfato de Sódio em g/mol; V= Volume da solução em L; C= Concentração da solução em mol/L. Pesou-se a massa de Fosfato de Sódio calculada em um Becker. Adicionou-se água destilada no Becker (volume menor que 25 mL) e dissolveu-se o sólido. Utilizando-se um pHmetro mediu-se o pH, e com adição de solução de NaOH, ajustou-se o pH da solução até pH 6,8. Após o ajuste do pH, transferiu-se a solução para um balão volumétrico de 25 mL e adicionou-se água destilada até completar o volume. 3.2. Procedimento: Avaliação do efeito da temperatura sobre a reação catalisada pela enzima amilase: Métodos: 3.2.1. Hidrolise Química: Rotulou-se um erlenmeyer para a realização da análise ácida. Com o auxílio de uma proveta adicionou-se 30 mL da solução de amido a 1% e com uma pipeta graduada adicionou-se 3 mL de HCl 1:2. Rotulou-se 3 tubos (1,2 e 3) de ensaio e em cada um deles adicionou-se 5 mL de água destilada. Pipetou-se em cada tubo uma alíquota de 5 mL do erlenmeyer. Deixou-se o tubo 1 em banho de gelo, o tubo 2 em 10 minutos de água fervente e o tubo 3 em 20 minutos de água fervente. Após cada tempo colocou-se os tubos 2 e 3 em banho de gelo. Posteriormente retirou-se os tubos de ensaio do banho de gelo, esperou-se atingirem a temperatura ambiente e adicionou-se uma gota de solução de lugol em cada tubo. Observou-se. 3.2.2. Hidrolise Enzimática: Rotulou-se um erlenmeyer para a análise enzimática. Adicionou-se com o auxílio da proveta 30 mL da solução de amido a 1%. Acrescentou-se 1 mL de solução de saliva a 10%. Rotulou-se três tubos de ensaio (1, 2 e 3), e a cada um deles adicionou-se 5 mL de água destilada. Ao tubo 1 (tempo 0’) adicionou-se uma alíquota de 5 mL da solução do erlenmeyer e o colocou em banho de gelo. Ao tubo 2, adicionou-se uma alíquota de 5 mL da solução do erlenmeyer e deixou-se o tubo de ensaio em temperatura ambiente por 10 minutos, posteriormente levou-se para o banho de gelo. Realizou-se o mesmo procedimento para o tubo 3, mas, deixando-o por 20 minutos na temperatura ambiente. Passado o tempo, retirou-se os tubos do banho de gelo. Deixou-se os tubos atingirem a temperatura ambiente e adicionou-se uma gota de solução de lugol a cada tubo. Observou-se. 3.3. Procedimento: Efeito do pH sobre a reação catalisada pela enzima amilase: Rotulou-se três tubos de ensaio (1, 2 e 3), em cada tubo adicionou-se 5 mL da solução de amido a 1%. Ao primeiro tubo adicionou-se 2 mL de tampão acetato (pH 4,0), ao segundo tubo adicionou-se 2 mL de tampão fosfato (pH 6,8) e ao terceiro tubo, adicionou-se 2 mL de tampão glicina (pH 9,5). Manteve-se os três tubos a temperatura ambiente por 5 minutos. A cada tubo de ensaio adicionou-se 5 mL da enzima (solução de saliva diluída). Após 5 minutos de reação adicionou uma gota de lugol a cada tubo de ensaio. Adicionou-se aos tubos 5 mL de água e observou-se. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Procedimento: Preparação de solução tampão de Fosfato de Sódio: Obteve-se a seguinte massa necessária para a preparação da solução de 25 mL de fosfato de sódio 0,1 mol/L: Em um Becker, pesou-se a 0,345 g do fosfato e posteriormente realizou-se a dissolução do sólido. Mediu-se o pH da solução e o pH inicial foi de 6,5, então adicionou-se gota a gota de solução de NaOH 0,1 mol/L até ajuste do pH ao valor de 6,8. Após o ajuste, transferiu-se a solução para um balão volumétrico de 25 mL e adicionou-se água destilada até completar o volume do balão. As soluções tampões são soluções para tentar manter o pH dentro de uma faixa ideal para determinado procedimento laboratorial 1 . Bioquímicos utilizam tampões devido às propriedades de qualquer sistema biológico ser dependente do pH 2 . A solução tampão é composta de um par ácido fraco e seu sal (base conjugada), e pode também ser composta de uma base fraca e seu respectivo ácido conjugado 1 . Quando não há no laboratório o ácido ou o sal (base conjugada), é possível preparar o tampão apenas com um dos dois, como foi realizado no procedimento. As equações de dissociação do tampão de fosfato são as seguintes: →Sendo os pKas: pKa1= 2,14; pKa2= 6,86; pKa3= 12,4 1 . A dissociação que estava ocorrendo no tampão de fosfato realizado no procedimento era a 2, em que o pH requerido era de 6,8. 4.2. Procedimento: Avaliação do efeito da temperatura sobre a reação catalisada pela enzima amilase: 4.2.1. Hidrólise Química: Adicionou-se 30 mL da solução de amido a 1% e 3 mL de HCl 1:2 em um erlenmeyer. Numerou-se 3 tubos de ensaio, em cada um adicionou-se 5 mL de água destilada e 5 mL da solução contida no erlenmeyer. Deixou-se o tubo 1 em banho de gelo, o 2, 10 minutos em água fervente e, o 3, 20 minutos em água fervente. Ao passar os 10 minutos, colocou-se o tubo 2 em banho de gelo, e ao passar 20 minutos colocou- se o tubo 3 em banho de gelo também. Após retirar os tubos de ensaio do banho de gelo (Figura 1), esperou-se atingirem a temperatura ambiente e adicionou-se 1 gota de Lugol a cada um (Figura 2). Figura 1. Antes da adição do lugol. Figura 2. Após a adição do lugol. Observou-se que todos os três tubos apresentaram coloração escura após a adição da gota de lugol, porém a solução do tubo 3 apresentava uma coloração mais violeta, enquanto que a do tubo 1 e 2 apresentavam colorações mais azul. O lugol (solução de iodo) é utilizado para a determinação da presença de amido, pois ao entrar em contato com o amido é formado um complexo de coloração azul. Ao aparecer uma coloração azul escura, como observado nos tubos 1 e 2, determina-se que a solução contém amido. Ao adicionar solução de HCl e aquecer a solução, ocorre a quebra das ligações glicosídicas presentes no amido e então ele é convertido para a sua menor parte, que é a molécula de glicose, como pode se visto na reação abaixo: → Como a solução do tubo 1 ficou em banho de gelo, o meio que ela se encontrava não propiciou a quebra das ligações da molécula do amido, por isso na presença do iodo a solução apresentou coloração azul intensa (o que determina a presença do homopolissacarídeo). A solução do tubo 2 também não ficou tempo o suficiente na água fervente para apresentar diferença na coloração, mas a solução do tubo 3 começa a mudar de coloração, observando-se a cor roxa, que pode-se inferir que a estrutura do amido já esta sendo quebrada, mas não se converteu na sua menor parte que é a glicose. A solução do tubo 3 apresentou-se a coloração diferente, pois ela ficou mais tempo sob o aquecimento, isso fez com que acelerasse a quebra do amido provocada pelo ácido. 3.2.2. Hidrólise Enzimática: Adicionou-se 30 mL da solução de amido a 1% e 1 mL de solução de saliva a 10% em um erlenmeyer. Numerou-se 3 tubos de ensaio, em cada um adicionou-se 5 mL de água destilada e 5 mL da solução contida no erlenmeyer. Deixou-se o tubo 1 em banho de gelo, o 2, 10 minutos em temperatura ambiente e posteriormente o levou para o banho de gelo, o 3, 20 minutos em temperatura ambiente e posteriormente em banho de gelo. Passados o tempo necessário, retirou-se os tubos do banho de gelo e os deixou atingir a temperatura ambiente (Figura 3), em cada um deles adicionou-se 1 gota de lugol (Figura 4). Figura 3. Antes da adição do lugol. Figura 4. Depois da adição do lugol. Observou-se que as soluções contidas nos tubos de ensaio apresentaram colorações escuras após a adição da gota do lugol, sendo que a solução do tubo 1 ficou azul intensão, o que indica a presença de amido, as soluções dos tubos 2 e 3, ficaram marrom escura, o que indica que não houve a formação do complexo azul que é proveniente da reação do amido com o iodo. A saliva contem a enzima α-amilase salivar, essa enzima é responsável pela catálise da hidrólise das ligações glicosídicas α-1-4 da cadeia do amido. A hidrólise do amido, catalisada pela α-amilase, é considerada parcial e os produtos resultantes são uma mistura de moléculas de glicose, maltose e dextrina 3 . As enzimas quando estão sujeitas a baixas temperaturas ficam inativas, devido a falta de energia de ativação para provocar o choque entre as moléculas enzimáticas e as moléculas do substrato. Por isso, na solução do tubo a coloração ficou azul após a adição do iodo, pois esta estava sujeita a uma baixa temperatura, assim não foi possível ocorrer a catalise da quebra da enzima, como ocorreu nas soluções dos tubos 2 e 3, que ficaram em presença da temperatura ambiente. As enzimas possuem uma temperatura ótima, que é o ponto em que a atividade enzimática atinge um máximo (Figura 5). Assim, com o aumento gradual da temperatura verifica-se o aumento da atividade enzimática até atingir um máximo. A partir desse valor verifica-se uma diminuição da atividade até atingir um valor que a enzima deixa de atuar devido a desnaturação da proteína que a constitui 4 . Figura 5. Gráfico da Atividade enzimática versus a temperatura, ponto de temperatura ótima. (Fonte: Aula de Enzimas 2)5 3.3. Procedimento: Efeito do pH sobre a reação catalisada pela enzima amilase: Adicionou-se 5 mL da solução de amido a 1% em 3 tubos de ensaio. Em cada tubo adicionou-se 2 mL de um tampão, sendo adicionados: Tubo 1, tampão de acetato (pH 4,0); Tubo 2, tampão de fosfato (pH 6,8); Tubo 3, tampão de glicina (pH 9,5). Manteve- se os três tubos a temperatura ambiente por 5 minutos e a cada um adicinou-se 5 mL da solução de saliva diluída. Após 5 minutos de reação adicionou-se uma gota de lugol em cada tubo de ensaio. Adicionou-se 5 mL de água em cada tubo para melhorar a visualização das cores (Figura 6). Figura 6. Cores após a adição do Lugol nas soluções de hidrolise do amido em diferentes pHs. Com a adição do lugol, observou-se que a solução do tubo 1 ficou com coloração azul intenso, e a solução do tubo 2 apresentou uma coloração intermediária entre o tubo 1 e 3, a solução do tubo 3 apresentou uma coloração roxeada. A enzima α-amilase salivar, em condições de pH 6,8 e temperatura 37°C, catalisa a hidrólise do amido, essa catalise é dada parcialmente, assim a solução é uma mistura de moléculas de glicose, maltose e dextrina. A dextrina apresenta ligações glicosídicas α-1- 6, e esta pode ser catalisada pela enzima intestinal amilo-1,6-glicosidase. Nas soluções contidas nos tubos, observa-se que o tubo 1 contem amido não degradado, isso ocorre pois o meio apresenta o valor de pH igual a 4,0. Assim como para a temperatura, a enzima possui um pH ótimo (Figura 7), que é 6,8, em que apresentam uma atividade máxima nesse pH, com a variação no pH ocorre a variação do caráter iônico dos grupos carboxila e amina dos aminoácidos, o que pode acarretar alteração da conformação da moléculas e impedir a ligação do substrato no sítio ativo da enzima 3 . Figura 7. Gráfico da Atividade enzimática versus o pH, ponto de pH ótimo. (Fonte: Texto- Efeito de pH na atividade enzimática)6 Quando a coloração da solução que contem iodo e amido é roxa, isso significa que o iodo foi degradado a amilodextrina 3 . As soluções dos tubos 2 (pH 6,8) e 3 (pH 9,5) possuem coloração roxa, sendo a do tubo 3 mais intensa, então isso significa que em ambos os tubos o amido foi degradado à amilodextrina. Porém, somente a solução do tubo 2 encontra-se no pH ótimo. 5. CONCLUSÃO Com o procedimento realizado conclui-se que o conhecimento para a preparação de soluções tampões é muito importante, pois esta solução pode ser utilizada por uma extensa gama de reações, visto que há muitas reações que são favorecidas em certos valores de pH. Conclui-se também que a catalise enzimáticanão é como muitas reações químicas, em que quando aumenta-se a temperatura, a reação ocorre mais rápido, para a catalise enzimática esse fato ocorre até certo ponto, pois se a temperatura estiver muito alta acontece a desnaturação da proteína constituinte da enzima. E, assim como uma temperatura ótima, a atividade enzimática também possui um pH ótimo, ambos valores são estão dentro da faixa ideal para o corpo humano. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] SOLUÇÃO Tampão, Texto. Disponível em: http://www.fop.unicamp.br/calculos/tampao.html. Acessado em 19 de jul. de 2014. [2] FIORUCCI, A. R.; SOARES, M. H. F. B.; CAVALHEIRO, E. T. G. O conceito de solução tampão. Química Nova na Escola, São Paulo, nº 13, p. 18-21, Maio 2001. [3] BERNARDES, C. F. Aula Prática – Avaliação da atividade da enzima amilase salivar: Efeito do pH e da temperatura. Disponível em: http://ftp-acd.puc- campinas.edu.br/pub/professores/ceatec/celene.bioquimica/medicina%201%C2%BA%2 0periodo%20neuro/aula-9-%20pratica-bioquimica-16-e-18-maio.pdf. Acessado em 19 de jul. de 2014. [4] A CONSTITUIÇÃO química e a atividade catalítica das enzimas, Aula. Disponível em: http://pt.slideshare.net/catir/enzimas-302665. Acessado em 19 de jul. de 2014. [5] GALLO, L. A.; MAGALHÃES, G. C.; FILHO, P. F. M. Aula: Enzimas 2. Disponível em: <http://docentes.esalq.usp.br/luagallo/Enzimas2.htm>. Acessado em: 19 de jul. de 2014. [6] BIANCONI, M. L. Texto: Efeito de pH na atividade enzimática. Disponível em: http://www2.bioqmed.ufrj.br/enzimas/pH.htm. Acessado em: 19 de jul. de 2014. [7] PROZYN INSÚSTRIA E COMÉRCIO. Texto: Enzimas catalizadoras de reações biológicas. Disponível em: <http://www.insumos.com.br/funcionais_e_nutraceuticos/materias/86.pdf>. Acessado em 19 de jul. de 2014.
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