Relatório sobre coleta e cultivos de microorganismos V2 Para Monitora PDF

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Universidade Federal Fluminense – UFF 
Campus Universitário de Valonguinho 
Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas 
Disciplina de Fundamentos de Diversidade Biológica e Protista 
Relatório sobre a Aula Prática (31/08/2017) 
 
Professor: Sérgio de Oliveira Lourenço 
Acadêmico: Lohan dos Santos Silva 
Turma: AB 
 
 
Relatório 
 
 
Coleta e Cultivo de 
Microrganismos e 
Infusões 
 
 
 
 
 
 
 São Gonçalo, dia 30 de setembro de 2017 
Coleta e Cultivo de Microrganismos e Infusões 
 
 
 A Biologia é definida como o estudo da vida, de suas relações, estuda como os 
organismos evoluíram ao decorrer do tempo e quais foram as etapas cruciais para 
esse desenvolvimento, estuda sua forma, sua composição, suas reações, esses 
estudos levam a compreensão de como os organismos funcionam trazendo um 
grande benefício para a sociedade, agindo como um precursor. 
 
 Neste material será relatado algumas das formas de vida mais abundantes em 
nossa atmosfera, os microrganismos, seres que não podemos enxergar sem o 
auxílio de ferramentas microscópias, sendo eles os seres mais diversificados e 
abundantes. Retratando a funcionalidade da coleta e do cultivo destes seres, 
assim pode-se conhecer as características gerais da coleta e da produção de 
meios de cultura. 
 
 A coleta dos organismos é uma fase importante na biologia, o tipo de estudo, a 
forma de estudo e o organismo a ser estudado irá definir como esse material será 
coletado, cada tipo de organismo leva a um método único apropriado para a sua 
coleta. Alguns estudos exigem que os organismos sejam mantidos vivos, após a 
coleta estes organismos serão inseridos em meios de cultura, onde irá se 
reproduzir e facilitar os estudos desses seres em vida. 
 
 
 
 
 
Representação de Microrganismos 
(Representação retirada de Science Source [1,2,4]; Dennis Kunkel [3]) 
 
 
 
 
 
Ferramentas de Coletas 
 
 A coletas de microrganismos no meio natural tende a ser uma experiência às 
cegas, não existe a possibilidade de controlar quais espécies serão coletadas na 
amostra, sendo assim; o profissional costuma fazer diversas coletas do mesmo 
material a ser utilizado, logo depois desta coleta o material deve ser levado para 
uma análise em laboratório para ser separados os microrganismos de interesse. 
 Essa análise deve ser feita o quanto antes, para manter a integridade e a 
vitalidade dos seres encontrados na amostra, algumas e mais populares 
ferramentas de coletas apresentadas na aula são: redes de plâncton; garrafa 
hidrológicas (garrafa de Van Dorn e garrafa de Niskin) no meio aquático, por sua 
vez, no meio terrestre são utilizados espátulas e testemunhos. 
 A estratégia de coleta dos microrganismos irá depender da forma de vida do ser 
em interesse, temos seres de vida livres que vivem dispersos em suspensão nas 
águas, outros seres vivem dispersos pelo solo, as ferramentas serão específicas 
para cara tipo de coleta. 
 
• Redes de Plâncton 
 
 O meio mais comum de obtenção de amostras de plâncton, zooplâncton e 
ictioplâncton, são as redes de plâncton, essa rede constitui em uma estrutura 
com nano aberturas que podem capturar corpos que possuam até 20μ de 
comprimento (as redes também podem ser um pouco mais seletivas, mas seu 
tamanho mínimo consiste em 20μm), produzidas principalmente de um plástico 
chamado de Nitex, no final da rede há uma pequena garrafa que armazenará e 
concentrará a amostra. Porém, esta rede possui um lado negativo, por seus poros 
serem minúsculos, a rede tende a entupir com frequência. 
 
 
 
Rede de plâncton sendo demonstrada pelo Professor Sergio O. 
Lourenço 
(Imagem cedida pelo Prof. Sergio O. Lourenço) 
 
• Garrafas Hidrológicas 
 
 A garrafa hidrológica diferente das redes de plâncton permite que a coleta seja 
feita em seu estado natural e não de uma forma concentrada, elas são 
depositadas ao local de coleta e fará a mesma quando alcançar a profundidade 
desejada. 
 
 A garrafa de Van Dorn, essa garrafa consiste em estruturas construídas em PVC 
e suas extremidades são conectadas tubo. A garrafa após atingir a profundidade 
para a coleta soltará uma estrutura chamada de mensageiro, uma estrutura que 
ao chegar ao contato com os tubos de sua extremidade irá acionar as duas 
tampas, fechando e vedando todo o material dentro da garrafa. 
 
 
 
Garrafas de Van Dorn sendo demonstrada pelo Professor Sergio O. 
Lourenço 
(Imagem cedida pelo Prof. Sergio O. Lourenço) 
 
 
 A garrafa de Niskin terá a mesma função da garrafa de Van Dorn, porém a sua 
composição é um pouco mais complexa, ela possui termômetros acoplados 
permitindo que o pesquisador possa controlar a temperatura da amostra 
coletada. Além das garrafas de Niskin também serem eletrônicas, diversas dessas 
garrafas podem ser acopladas em um outro mecanismo chamado de Rosette ou 
Carousel, permitindo uma coleta simultânea. 
 
Rousette com diversas garrafas de Niskin acopladas, pronta para serem enviadas para coleta. 
(Imagem retirada de Estrutura de Missão para a Extensão da Plataforma Continental [EMEPC]) 
 
• Espátulas 
 
As espátulas podem ser fabricadas de diversos tipos de materiais, entre eles estão 
metais e plásticos, utilizada para a coleta de material superficial no solo, pedras, 
troncos ou em qualquer superfície que permita a raspagem. 
 
 
 
Espátula sendo utilizada para coleta de solo. 
(Imagem retirada da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária [EMBRAPA]) 
 
• Testemunho 
 
 Testemunho são grandes cilíndros feitos de metal que são utilizados para obter 
cortes do solo em diversas profundidades, eles são inseridos através de ondas 
de vibração ou pistões que irão se chocar contra o cilíndro, que permite que o 
testemunho penetre no solo de uma maneira que não danifique a amostra. A 
grande vantagem dos testemunhos é a possível obtenção de microfósseis, que 
auxiliam no estudo da evolução dos microrganismos. 
 
 
Um testemunho sendo cortado para obtenção da amostra. 
(Imagem retirada do Centro de Energia Nuclear na Agricultura [CENA]) 
 
 
Seres Simbióticos 
 
 No meio científico não há uma definição concreta ou exata para o termo 
simbiose. Segundo Thomas Pradeu (2011), “o termo simbiose pode ser definido 
como qualquer interação a longo prazo entre indivíduos de diferentes espécies, 
sendo essa associação evolutivamente benéfica para o hospedeiro e neutra ou 
benéfica para o simbionte”. Para diversos outros autores (Sapp J. [1994], Oulhen 
N. [2016], Barbara J. [2016], SchulzTyler J. Carrier[2016], etc), a simbiose pode ser 
definida de maneira mais ampla, sendo então uma associação a longo prazo entre 
dois organismos de diferentes espécies, esta é a mais aceita no meio científico. 
 
 Coleta de Seres Simbióticos 
 
 Para a coleta de seres simbióticos devemos utilizar a biópsia e a necropsia, 
exemplos de seres simbióticos são as Giárdia sp, presentes no intestino e nas 
fezes, e os Plasmodium spp, presentes no sangue. A biópsia consiste em coleta 
de simbiontes em um indivíduo vivo, uma pequena fração do tecido ou fluído em 
que está presente o simbionte para ser utilizados como amostra, esse processo 
deve ser feito de forma cuidadosa para não causar nenhum dano ao indivíduo. A 
necropsia consiste na coleta de material em um indivíduo que já esteja morto, 
permite um melhor manuseio do material e uma coleta mais consistente, levando 
em consideração que não é preciso o cuidado que é necessário na biopsia. 
Meios de Cultura 
 
 
 Após as coletas de microrganismos raramente o pesquisador irá iniciar sua 
análise de imediato, visando manter suas amostras vivas e se reproduzindo. 
Porém, assim como os macro-organismos, os microrganismos também possuem 
suas restrições paraque se mantenham vivos, essas condições irão variar em 
diversos fatores, para manter um microrganismo vivo em um meio de cultura 
deve saber suas exigências. 
 
 Os microrganismos irão ser inseridos em um ambiente altamente nutritivo e 
favorável para o seu crescimento esse processo é chamado de inoculação. A 
inoculação consiste em um processo de transporte, onde uma vacina, 
uma toxina, um vírus, uma bactéria, entre outros seres é introduzido em um 
ambiente, seja este um organismo ou um meio de cultura. O conceito de meio de 
cultura se baseia em definir um ambiente altamente nutritivo e específico para a 
proliferação de um ser. Estes são utilizados na biologia, para a preservação e 
cultivo de microrganismo para estudos específicos que necessitam que os seres 
permaneçam vivos ou que necessite de uma frequente coleta. 
 
 Serão apresentados dois meios de culturas, sendo eles sólido e líquido, cada 
meio de cultura será específico para o crescimento de certos organismos e 
utilizará de ferramentas específicas para a inoculação do microrganismo para o 
meio de cultura. Sendo assim meios líquidos são utilizados com uma frequência 
maior para cultivar microalgas e o meio sólido para cultivo de algumas células 
bacterianas e células fúngicas. Os meios de cultura não são a única forma de se 
cultivar estes seres, a infusão é um exemplo que abordaremos sobre o cultivo de 
microrganismos. 
 
• Meio Sólido 
 
 O meio sólido consistirá em uma mistura feita com nutrientes, que irão 
depender da necessidade do microrganismo que será inserido neste meio de 
cultura, algumas substâncias contendo glicose se necessário também serão 
inseridas e o ágar; uma substância extraída de algas vermelhas que fará o papel 
de solidificar a mistura, alguns exemplos de meios de cultura são: BDA (Meio 
derivado de batata, dextrose e ágar) Caldo BHI(É um meio derivado de nutrientes 
de cérebro, coração, peptona, dextrose e ágar). Após realizada, a mistura deve 
ser depositada em um recipiente chamado de: placa de Petri, que consiste em 
um recipiente de vidro circular com uma tampa para serem lacrados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Placas de Petri com algumas amostras de microrganismos. 
(Imagem retirada de Comstock/ Getty Images) 
 
 
 
 
 As ferramentas utilizadas para o transporte dos microrganismos para o meio de 
cultura são: alças de inoculação, que consiste em um apoio com uma alça que 
possui uma extremidade em forma de anel que será responsável para a 
inoculação dos seres no meio de cultura e o bico de Bunsen, este aparelho 
semelhante a um maçarico, consiste em uma base com um tubo vertical onde 
libera chamas em pequena quantidade, ele é responsável pela esterilização das 
ferramentas e a vibração de suas chamas inibem partículas e microrganismos de 
afetar a amostra e o meio de cultura. O processo de inoculação deve ser feito 
próximo ao bico de Bunsen, por fins de preservar a integridade da amostra e do 
meio de cultura. 
 
 
 
 
Exemplos de alças de inoculação. 
(Imagem retirada de MedicalExpo) 
• Meio Líquido 
 
 O meio líquido possuí os mesmos princípios do meio sólido, sendo também 
baseada em uma mistura que irá possuir os nutrientes específicos e necessários 
para o cultivo dos microrganismos, no meio de cultura líquido iremos desprezar 
o uso do ágar, levando em consideração que ele só está presente para 
solidificação da mistura. Alguns exemplos de mistura são: ASM-1 (Gorhan et al., 
1964) utilizado para cultivar a cianobactéria Anabaena flos-aquae e o f/2 (Guillard 
& Ryther, 1962) utilizado para cultivar a clorófita marinha Tetraselmis gracilis. 
Esta mistura será depositada em tubos de ensaios, recipientes cilíndricos e 
compridos com função semelhante as placas de Petri. 
 
 A ferramenta utilizada para a inoculação das amostras para o meio de cultura é 
chamada de pipeta de Pasteur, que consiste em um tubo cilíndrico com 
medidores que será responsável por transportar pequenas quantidades de água. 
Essa ferramenta irá exercer a mesma função das alças de inoculação, coletará 
uma pequena fração da amostra e irá inseri-la no meio de cultura, também 
utilizaremos o bico de Bunsen para os fins de esterilizar e inibir microrganismos 
e partículas possa afetar a amostra e o meio de cultura 
 
 
 
 
Alunos de graduação em Ciências Biológicas, utilizando meio líquido para cultivo de microalgas. 
(Imagem cedida pelo Prof. Sergio O. Lourenço) 
 
 
 
 
 
 
 
Infusões 
 
 Diferente dos outros métodos, as infusões são criadas para o cultivo de seres de 
vida livre, seres heterotróficos em especial, isto não descarta a possibilidade de 
um ser autotrófico se proliferar em uma infusão. As infusões são montadas a 
partir de amostras de diversos ambientes, fragmentos de componentes 
orgânicos, água e um organismo fotossintético que terá a função de manter a 
infusão oxigenada. Não poderá ser mantido um controle dos seres que irão se 
difundir na infusão, diferente dos meios de cultura onde pode ser feito o controle 
dos seres que serão difundidos. Neste meio, os microrganismos desenvolvem 
uma pequena cadeia alimentar, tornando o ambiente ideal para a proliferação de 
seres como os protozoários e bactérias. 
 
 
 
Representação de uma Infusão. 
(Imagem retirada de Biodiversidade Visível e Invisível) 
 
 
Experimentos 
 
 Durante a aula conduzida pelo professor Sérgio, os alunos do curso de 
graduação em Ciências Biológicas da UFF desenvolveram diversos experimentos. 
A primeira dupla de alunos foi selecionada para preparar um meio de cultura 
sólido, os alunos produziram a mistura BDA, que consiste em uma mistura 
baseada em batata, dextrose e ágar, esta mistura é utilizada para cultivo de 
fungos e bactérias, os instrumentos utilizados foram: proveta, placa de Petri, 
ebulidor e Becker. Os alunos prepararam a mistura passo a passo sendo guiados 
pelo o professor que disponibilizou a mistura já pronta, então caberia aos alunos 
apenas complementar com a solidificação da mistura utilizando o ágar. O 
experimento foi feito em algumas etapas. 
 
1. A mistura foi esquentada em um recipiente utilizando o ebulidor. 
2. Despeja-se uma pequena quantidade de ágar no Bekcer. 
3. A mistura deverá ser despejada no Becker, para que a mesma possa diluir o ágar. 
4. Após a mistura apresentar o ágar completamente diluído, a mistura foi 
despejada em uma proveta. 
5. A proveta nos permite ter uma exatidão melhor que o Becker, levando apenas 
100ml da mistura para a placa de Petri. 
6. Após ser preenchida a placa de Petri foi separada para ser resfriada e a mistura 
se solidificar. 
 
 
Alunos de graduação em Ciências Biológicas, produzindo o meio de cultura BDA. 
(Imagem cedida pelo Prof. Sergio O. Lourenço) 
 
 Outro grupo de alunos foi selecionado, eles transportaram microrganismos 
para um meio de cultura sólido que foi disponibilizado pelo professor, tiveram 
de escolher entre as amostras disponibilizadas e transportá-la para o meio de 
cultura. O aluno Lohan dos Santos Silva, voluntário para o experimento, 
escolheu amostra do solo da própria faculdade, utilizando o passo a passo do 
professor, ele completou o experimento de forma correta. 
 
1. Utiliza-se do bico de Bunsen para esterilizar a aça de inoculação, colocando a 
sua extremidade anelar nas chamas até que ela fique incandescente. 
2. Após ela ficar incandescente, retirou-se a alça de inoculação das chamas para 
que a temperatura venha a diminuir. 
3. Após a esterilizada, leva-se a extremidade para coletar parte da amostra. 
4. Coletando a amostra a placa de Petri deve ser levada próxima as chamas, com 
cuidado ela deve ser aberta e a amostra será aplicada. 
5. Com a amostra aplicada, esteriliza-se a alça de inoculação após isso a placa de 
Petri deve ser vedada. 
 
 
Alunos utilizando o meio de culturasólido. 
(Imagem cedida pelo Prof. Sergio O. Lourenço) 
 
 
 Novos alunos foram escolhidos para o terceiro experimento, agora eles terão de 
utilizar o meio de cultura líquido, o professor disponibilizou três espécies de 
microalgas sendo elas; Anabaena flos-aquae, Chaetoceros calcitrans e 
Tetraselmis gracilis. O processo foi realizado da mesma forma, porém utilizando 
a pipeta de pasteur para a inoculação da amostra. 
 
1. O bico da pipeta deve ser esterizado, aproximando o bico das chamas com 
cuidado, para evitar que o mesmo seja danificado. 
2. Aguarde que a pipeta esfrie, para não causar danos a amostra. 
3. Levando a pipeta para coletar uma porção da amostra. 
4. O tubo de ensaio também deve ser esterelizado, sua tampa deve ser passada nas 
chamas com cautela para não danificar o tubo. 
5. Após a esterilização, a amostra deve ser levada para dentro do tubo de ensaio e 
ser despejada no meio de cultura. 
6. O tubo deve ser fechado, porém não devemos utilizar a força, para que ainda 
exista troca de ar com o ambiente externo. 
 
 
Alunos utilizando o meio de cultura liquido. 
(Imagem cedida pelo Prof. Sergio O. Lourenço) 
 
 Terceiro e último experimento foi a produção de infusões, 4 alunos 
selecionados, utilizando bacias de isopor montaram duas infusões. Essas infusões 
foram preparadas contendo algumas partículas orgânicas e diversas amostras de 
materiais disponibilizado pelo professor, foi colocado também folhas de alfaces 
para manter a água oxigenada, após esse experimento a aula foi encerrada e os 
alunos teriam contato com os experimentos apenas duas semanas depois. 
 
 
Alunos produzindo as infusões. 
(Imagem cedida pelo Prof. Sergio O. Lourenço) 
 
RESULTADOS 
 
 Após duas semanas de espera, os alunos tiveram contato com os resultados dos 
experimentos feitos em aula, os resultados foram extremamente agradáveis. Nas 
placas de Petri diversas colônias de fungos e bactérias se proliferaram, seus 
aspectos distintos permite a fácil visualização delas, as partes elevadas, fofas e 
ásperas são aspectos das colônias de fungos, enquanto as partes com um resíduo 
brilhoso e pegajosas são aspectos das colônias de bactérias. 
 
 
(Meio de cultivo sólido após duas semanas depois do experimento.) 
 As microalgas também se proliferaram de uma forma extremamente agradável, 
porém elas receberam um estímulo maior, o professor Sérgio, levou as amostras 
para seu laboratório onde a temperatura e a iluminação é perfeita para o cultivo 
de microalgas. 
 
 
 
(Meio de cultivo líquido após duas semanas depois do experimento.) 
 
 
As infusões apresentaram grandes diferenças, a coloração da amostra ficou 
escura devido a decomposição dos materiais orgânicos que foram depositados, 
podemos notar também a presença de biofilme, uma “crosta” que circundou 
todo o recipiente próximo da água. 
 
 
(Infusão após duas semanas depois do experimento.) 
 
 
 Foram montadas lâminas para observação dos microrganismos que cresceram 
na Infusão, como de esperado, vimos que diversos microrganismos se 
proliferaram, entre eles o mais abundante foi o protozoário ciliados pertencentes 
ao gênero Blepharisma, mas também foram encontrados diversos protozoários 
pertencentes aos gêneros Paramecium, Stylonychia, Vorticella, Colpoda, Halteria, 
Didinium dentre outros, cresceram também diversas bactérias heterotróficas de 
diversos formatos (cocos, bacilos, vibriões etc.), mas não podemos identificá-las 
utilizando somente a microscopia óptica. 
 
 
 
(Imagem da amostra vista de um microscópio óptico.) 
 
 
Referências bibliográficas 
 
 
 
Agencia Nacional de Vigilância Sanitária; 01/04/2004; Descrição dos Meios 
de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos disponível em: 
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_4_2
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Dantas, A.; 2012 ; Exigências nutricionais e meio de cultura em 
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https://pt.slideshare.net/AdrianaDantas2/meio-de-cultura-em-
microorganismos; Acesso realizado em 19/09/2017. 
 
Lourenço, S. O.; 2006; Cultivo de Microalgas Marinhas – Princípios e 
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Möller, O. Jr. e Abe, M. P.; 2017; Oceanografia Física; disponível em 
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19/09/2017 
 
Oulhen N., Barbara J., SchulzTyler J. Carrier; 2016; English translation of 
Heinrich Anton de Bary’s 1878 speech, ‘Die Erscheinung der Symbiose’ 
(‘De la symbiose’); Symbiosis; Vol. 69; pag 131–139.